私たちがそれを行う方法を生きているバイオバンクの作成とメンテナンス。紹介。従来のバイオバンクは、一般的に生存不可能な組織および血液サンプルを含む。がん患者集団の多様性を十分に反映し、遺伝的および組織学的分析を可能にするにもかかわらず、治療戦略を評価する前臨床アッセイには適していない。
また、患者由来モデルを統合するバイオバンクは、これらの制限を克服します。このように精密医療のための機能試験を可能にする。サンプル取得。
大腸癌および膵臓癌のバイオバンキングのために、証明された診断と十分な腫瘍サイズを有する症例を選出し、患者の情報に基づいた短所が必須である。手術開始前に、ヘパリン化注射器を使用して20mlの血液を引き出し、血清モノベットで7.5mlを追加します。血清処理とPBL分離。
1で遠心分離した後、128 RCFは4度で15分間、血清を事前に標識されたクライオチューブでアリクォートし、液体窒素に直接沈める。ヘパリン化された血液をポリプロピレンチューブに移し、15mlPBSで希釈する。血清ピペットを使用して、15mlパンコルでゆっくりと混合物を下敷きにします。
密度勾配遠心分離後、単核細胞を含む不透明層を血清ピペットで取り上げ、新しいPPチューブに移す。PBSで洗浄し、遠心分離によって単核細胞をペレット化した後、上清を捨て、冷凍培地中のペレットを再懸濁し、事前にラベル付けされたクライオチューブに分配する。1分あたり1度でゆっくりと凍結するのに適した冷却容器にチューブを移し、80度で一時的に保管してください。
組織処理。組織標本が外科医によって切除されるとすぐに、適切な容器に入れる。組織がホルマリンで覆われているすべての状況下で避けてください。
切除マージンの病理評価に関係ない腫瘍材料の切除のための病理にできるだけ速く輸送する。腫瘍片は、できるだけ無菌として扱われるべきである。さらに、健康な組織の標本を得て、氷の上に組織貯蔵溶液をあらかじめ充填した別々のチューブに両方を入れる。
すぐにラボに戻り、滅菌条件下で組織処理を開始します。組織片は、乾燥を避けるために、組織貯蔵溶液で満たされた滅菌プラスチック皿の上に置かれます。まず、得られた組織標本の大きさに応じて、凍結をスナップするための1つ以上のピンヘッドサイズの部分を物品切りする。
ネイティブ組織を事前に標識されたクライオチューブに入れ、液体窒素にすぐに沈めます。残りの組織を3立方ミリメートルで3立方体に切ります。壊死組織は完全に解剖されなければならないが、廃棄すべきではないことを考慮に入れて.
四足立方体を 4 つに並べて、重要な保管のためのアリコートの数を決定します。適切な数の凍結チューブにラベルを付け、それぞれ1.5ml冷凍培地で事前に充填します。冷凍媒体中のDMSOは細胞毒性であるので、次のステップを迅速かつ中断することなく行う。
チューブあたり4つのティッシュ片をすくうためにメスの刃を使用してください。すべての部分が理想的にはチューブの底に冷凍媒体に完全に沈め、凍結容器を使用してチューブを急速に凍結することを確認してください。健康な標本と同じように進みます。
長期保存のために、液体窒素タンク内のすべてのアリクォートを保管してください。細胞培養。できるだけ小さいメスの刃を持つ壊死部分を含む腫瘍組織処理の残骸を粉砕する。
細胞ストレーナーを滅菌PPチューブの上部に置き、細胞ストレーナーを通過するために血清ピペットで懸濁液を吸引します。単一の使用シリンジのプランジャーを使用して、細胞ストレーナーを通して残る組織を押して、単一の細胞懸濁液を生成する。PBSでリンスし、材料が残らなくなるまでこれらの手順を繰り返します。
細胞ストレーナーを取り出し、180 RCFで7分間懸濁液を遠心分離します。その間、異なる培地組成物を備えたコラーゲンプレコートされた6ウェルプレートを準備して、腫瘍の成長の確率を高めます。上清を捨て、PBSでペレットを再懸濁し、1ウェルあたり500マイクロリットルを分配します。
その後、プレートを標準インキュベーターに入れる。患者由来異種移植片の生成。免疫不全マウスにおける患者由来の異種移植片の生成のために、動物は特定の病原体のない環境で飼われるべきである。
スクラブ、エプロン、フェイスマスク、ヘアカバー、手袋からなる個人用保護具を着用してください。ワークスペースを配置した後、液体窒素容器から欲求腫瘍標本を取る。35ml PBSで新鮮なPPチューブを充填し、慎重に解凍プロセスを洗浄し、クライオチューブを上下に傾けます。
内容物がスラッシーになるとすぐに、PBSに注ぎ、腫瘍片をすすいだ。PBS の大部分を破棄し、キューブをふたの中に空にします。アイスパックに無菌プラスチック皿を置き、100マイクロリットルマトリゲルの液滴を追加します。
鉗子を使用してマトリゲルに腫瘍片を入れ、腫瘍を10分間インキュベートする。その間に、2匹のマウスを麻酔する。動物の足をつまんで麻酔の深さを確認してください。
任意の動きは、不十分な麻酔を示し、いくつかの待っているか、追加のドージングを必要とします.目の軟膏を塗布し、首でマウスをつまみ、マイクロチップを皮下に注入する。次の手順を並行して実行します。
マウスの側面を消毒し、ストライプメッツェンバウムはさみで小さな皮膚切開を行い、鈍い調製によって皮下ポケットを形成する。解剖鉗子を使用して腫瘍片を挿入する。ピースがスキンポケットの後端に置かれておきます。
残りのマトリゲルを吸引し、4つのポケットすべてに均等に分配します。ゲルの治癒を待ち、針で腫瘍片を損傷することなく、単一のボタン縫合で皮膚を閉じます。結び目の上にできるだけ短く糸をカットし、縫合糸のうずくまを防ぐためにスプレードレッシングを適用します。
マイクロチップをスキャンし、後で動物を識別するためにデータベースに腫瘍情報を追加します。新鮮な寝具とネスティング材料でケージを準備し、赤外線ランプの前にマウスを置き、麻酔が治まるまで動物を監視します。PDXの排泄物。
PDX腫瘍が必要なサイズに達した後、マウスはCO2窒息とその後の子宮頸部脱臼によって安楽死させる。慎重に腫瘍から皮膚を解剖し、PDXを完全に除去する。代表結果。
無菌プラスチック皿に腫瘍を置き、さらに処理するために無菌メスの刃を使用してください。スライスで穴をカットし、それらを組織学的カセットに入れ、ホルマリンに沈め、後で組織学的評価のためにパラフィン埋め込まれた標本を生成する。腫瘍の残りの部分を組織貯蔵溶液に移し、バイオバンク用の新しい重要に保存され、凍結した標本を作成する。
さらに、第二次腫瘍細胞株を確立するために、章細胞培養に類似したPDX腫瘍の残存を使用する。さらにPDXを生成するには、前に示したように、マトリゲルを用いた2つ以上の腫瘍片を新しいレシピエントマウスに移す。結論。これまでに提示されたプロトコルによって、我々はこれまでに9膵臓および100以上の大腸患者由来の癌細胞株、ならびに19の膵臓および150以上の大腸PDXモデルを確立することができた。
