Name: establishment of a clinic-based biorepository
Uploaded: 2017-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
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이 연구는 중서부 대학 건강 과학 연구 촉진 기금, EEH 수여, Midwestern University Office of Research 및 후원 프로그램 교내 기금, KJL에게 수여되었습니다. Affiliated Laboratories 및 Affiliated Dermatology에서 추가 지원을 제공했습니다. 기술 지원을 위해 Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel 및 Ali Zaidi에게 감사드립니다.

인간 조직 샘플에 대한 모든 실험은 Western IRB (WIRB Protocol # 20142461)에 의해 승인되었습니다. 이 절차에 대한 조직 수집에 대한 단일 기준은 생검에서 입증 된 SCC 진단입니다. 원래의 IRB 프로토콜에는 제외 기준이 제시되어 있지 않았지만, 혈액으로 전염 된 질병이 알려진 환자의 샘플은 사용되지 않았습니다. 피부 조직, 혈액 및 타액을 수집하기 전에 사전 동의를 얻었습니다. 중서부 기관 검토위원회 (Midwestern Institutional Review Board)는 Midwestern University (AZ # 807)에서 진료소 기반의 생물 저장소 샘플을 사용한 검증 작업을 승인했습니다. 1. 피부 종양 조직 처리 참고 : 이것은 Mohs histotechnologist가 수행해야합니다. <ol><li> RNA 및 외과 적 배양을위한 새로운 편평 세포 암종 (SCC) 조직의 가공 <ol><li> 조직이 모스 외과 의사에 의해 절제 된 후, 10 ~ 50 mg (≥ 10 mm 3 </sup&gt;) 조직 샘플을 추가 처리하기 전에 이완하는 동안 조직의 꼭대기 쪽 중심에서 제거합니다 (이는 슬라이드에서 평평하게 놓일 수 있도록 조직을 조작하는 과정입니다). 참고 : 이것은 종양이 Mohs 절차의 일부인 조직 학적 평가 이전에 10-50 mg 크기의 샘플 (≥10 mm2)을 제거 할 수있을만큼 충분히 큰 경우에만 가능합니다. 종양의 크기가 최소 2mm 3 이 될만큼 크지 않은 경우 RNA 처리를 계속하지 마십시오 (5 단계 생략). </li><li> 핀셋을 사용하여 문화 매체 (DMEM의 1 : 1 혼합물 : 햄의 F - 12, 25 MM HEPES, 100 IU / ML 페니실린, 그리고 100 μg / ML streptomycin)가 포함 된 표시된 1.5 ML 튜브로 실행 가능한 조직을 전송하고 조직은 매체에 완전히 잠겨 있습니다. 추가 처리 전에이 튜브를 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> RNA 분리 및 발현 분석을 위해 조직을 사용하십시오 (5 단계 참조) 및 / 또는24 시간 이내에 체외 이식편 배양 (단계 6 참조). </li><li> 환자 (1.1.1 단계)에서 제거한 종양 샘플의 나머지 부분을 저온 유지 장치 홀더 (또는 &quot;척&quot;) 위에 놓습니다. 모스 조직학의 완성과 실험 분석을위한 추가 histological 슬라이드의 준비를 허용하기 위해 최적 절단 온도 (OCT) 화합물에 조직을 포함, 홀더 내의 조직을 동결. </li></ol></li><li> 조직 슬라이드의 준비 <ol><li> 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm 두께의 조직 섹션을 잘라내 각 종양 샘플에 대해 두 개 (또는 그 이상)의 슬라이드를 만듭니다. 각 슬라이드에는 전체 종양의 섹션이 최대 3 개까지 포함되도록하십시오. 참고 : 두 개의 슬라이드 중 하나는 Mohs histotechnologist가 H &amp; E로 염색하고 추가 슬라이드는 IF, IHC 또는 FISH 분석으로 처리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 조직을 고정하기 위해 아세톤에 슬라이드를 1-2 초 동안 놓습니다. 이 슬라이드를 건조 상태로 두십시오. H &amp; E하지 마라.실험 프로토콜에 따라 미래 immunofluorescence (IF), immunohistochemistry (IHC), 또는 형광 in situ 하이브리드 화 (FISH) 분석에 사용되는 슬라이드를 얼룩이나 coverslip. </li></ol></li><li> 모종 조직 처리 <ol><li> 일단 모스 처리가 완료되면 (단계 1.1-1.2), 저온 유지 장치 챔버에서 작업하고 냉동 저울 매질에서 샘플을 꺼내어 조직을 표시된 극저온 튜브에 넣습니다. </li><li> 조직이 해동되기 전에 표시된 바이알을 액체 질소에 넣으십시오. 시료를 단백질 및 / 또는 DNA 분석에 사용하려면 액체 질소 또는 -80 ° C의 냉동고로 몇 분 안에 옮겨 미래의 단백질 발현 및 DNA 돌연변이 분석을 위해 보관할 수 있습니다 (4-5 단계 참조) . NOTE : post-Mohs sample에서 온전한 RNA가 필요하다면, cryo-embedding 매질에서 제거하는 동안 샘플을 얼게 유지하는 것이 중요합니다. 극도의주의를 기울이지 않은 경우이 단계에서 모스 샘플은 단백질 및 / 또는 DNA 분석을 위해 예약해야합니다. </li></ol></li><li> 새로운 ANT 처리 <ol><li> 모스 종결 시점에 모스 외과 의사로부터 ANT를 구하십시오. </li><li> 정상 조직의 꼭대기 쪽에서 SCC 샘플 (위 참조)에서 수확 한 것과 동일하거나 더 많은 양의 ANT를 제거하고 배양 배지가 들어있는 라벨이있는 1.5 mL 튜브 (DMEM : Ham &#39;s F- 12에 25 mM HEPES, 100 IU / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신을 보충 한 것)을 사용 하였다. </li><li> 동일한 배양 배지에 조직을 완전히 담그고 4 ℃에서 보관합니다 (후속 처리 (4-6 단계 참조)까지). </li></ol></li></ol> 2. 혈액, 타액 및 구강 내 면봉 처리 <ol><li> venipuncture를 통해 EDTA 수집 튜브에서 약 10mL의 혈액을 얻습니다. </li><li> 수집 튜브에서 멸균 된 15 또는 50 mL 원심 분리 튜브로 혈액을 옮긴다.. 거품을 피하면서 1.5 mL 극저온 튜브에 약 200 μL를 제거합니다. 필요한 경우이 전체 혈액 샘플을 -80 ° C에 보관하여 향후 genotyping 및 tissue matching에 사용하십시오. <ol><li> 나머지 혈액을 1000 xg에서 30 분간 회전시키고 표준 절차에 따라 혈장 분획을 수집합니다. </li><li> 분주하여 1.5mL 극저온 튜브에서 1mL 씩 증분하고 -80 ° C에서 보관하여 향후 액체 생검 분석에 사용하십시오. </li></ol></li><li> 멸균 된 면봉을 사용하여 협측 면봉 샘플을 얻고 상온에서 멸균 된 튜브에 면봉을 보관하십시오. </li><li> 필요한 경우 타액 샘플을 얻고 실온에서 멸균 튜브에 저장하십시오. NOTE :이 샘플은 필요할 경우, 향후 genotyping과 tissue matching을 위해 사용될 수있다. </li></ol> 3. 샘플의 기록 관리 <ol><li> 환자 표본 체크리스트의 정보를 바이오 저장소 데이터베이스로 전송합니다. 환자 정보 및 진단 포함환자 차트에서 코. </li><li> 각 샘플에 대한 바코드 라벨을 인쇄하고 데이터베이스에 각각 기록하여 수집 된 각 샘플을 환자 데이터와 연결합니다. </li><li> 샘플을 연구실로 옮기기 전에 바이오 리포 지 토리 데이터베이스에 비확인 된 샘플의 분포를 기록하십시오. </li></ol> 4. 단백질 분리 및 Western Blot 분석 <ol><li> 각 조직 샘플 (SCC 및 / 또는 ANT)을 조직 100mg 당 프로 테아 제 억제제가 들어있는 세포 용해 완충액 500 μL가 들어있는 유리 병에 넣고 조직을 녹입니다. 참고 : 우리는 50mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 0.5 % 나트륨 deoxycholate, 1.0 % NP - 40 및 0.1 % SDS로 구성된 radioimmunoprecipitation 분석 (RIPA) 버퍼를 사용했습니다. 다른 세포 용해 완충액을 사용할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 20 초 간격으로 5 분 동안 조직 균질기를 사용하여 조직을 균질화하십시오. 21,000 xg와 4 ° C에서 20 분 동안 시료를 회전시키고 단백질을 함유하는 상청액을 신선한 tu있다. 동일한 조건을 사용하여 상등액을 다시 스핀하고 최종 상등액을 신선한 튜브에 수집합니다. </li><li> 4 ~ 20 % SDS-polyacrylamide gradient gel을 사용하여 각 시료에서 30-50 μg의 단백질을 전기 영동합니다. 원하는 경우 Coomassie Blue로 젤을 염색하여 단백질 밴드를 시각화하십시오. </li><li> 발현 된 단백질의 웨스턴 블럿 분석이 필요한 경우 표준 프로토콜에 따라 젤의 단백질을 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 옮깁니다. 전달 후 Ponceau는 원하는 경우 단백질 밴드를 시각화하기 위해 PVDF 막을 얼룩지게합니다. </li><li> 표준 프로토콜에 따라 관심 단백질을 검출하기 위해 PVDF 멤브레인과 프로브를 차단하십시오. 서양 얼룩 분석을 위해 제조업체에서 권장하는 농도로 1 차 항체에 해당하는 2 차 항체와 함께 해당 단백질에 특이적인 1 차 항체를 사용하십시오. </li><li> chemiluminescent 기판을 사용하여 탐침 막을 노출하고 imagi를 사용하여 막 이미지시스템. </li></ol> RNA 분리 및 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR) <ol><li> 즉시 RNA 안정화 용액이 들어있는 1.5 mL 튜브에 신선한 조직 샘플 (SCC 및 / 또는 ANT)을 놓고 고정 된 조직 전이 용액이 들어있는 1.5 mL 튜브에 Mohs 조직 샘플을 넣으십시오. 조직이 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 이 샘플을 사용할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> -80 ° C에서 RNA 샘플을 제거하고 얼음 위에서 녹입니다. 조직 50-100 MG 당 1 ML의 RNA 추출 버퍼 (페놀 / 구아니딘 thiocyanate)를 포함하는 새로운 1.5 ML 튜브에 조직을 전송하십시오. </li><li> 조직 호 모지 나이저를 사용하여 조직을 용해시킵니다. 6 회의 균질화를 수행 한 다음 샘플 냉각 기간을 수행합니다. 각 사이클은 4 ℃에서 40 초의 균질화와 20 초의 균질화로 구성됩니다. 균질화 후, 실온에서 5 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 0.2 추가1 mL의 RNA 추출 완충액 당 1 mL의 클로로포름을 넣고 15 초 동안 손으로 튜브를 격렬히 흔드십시오. 실온에서 2-3 분 동안 품어 낸다. </li><li> 12,000 xg와 4 ° C에서 15 분 동안 시료를 회전시킵니다. 샘플의 수성 상을 제거하고 새로운 1.5 mL 튜브에 넣으십시오. </li><li> 수성 상에 단계 5.2에서 사용 된 RNA 추출 완충액 1 mL 당 100 mL의 이소프로판올 0.5 mL를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 항온 처리한다. 참고 : RNA 수율이 낮을 것으로 예상되는 경우 ( 즉, 시작 조직 부피가 10mg 미만인 경우), 샘플은 밤새 -80 ° C에서 침전 될 수 있습니다. 또한 RNA 추출액 500 μL 당 RNase가없는 글리코겐 5 μg을 이소프로판올 침전 단계에서 첨가하여 RNA 수율을 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 12,000 xg에서 10 분간 시료를 회전시킨다. 뜨는을 제거하고 75 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 샘플을 간단하게 볼텍스 한 다음 7,500 x 4 및 4 °로 회전시킵니다.5 분간 C로 처리 하였다. 세척을 버리고 5 ~ 10 분 동안 펠렛을 공기 건조시킵니다. </li><li> RNase가없는 물 20 μL에 RNA 펠렛을 Resuspend. <ol><li> 원한다면 RNA 제조사의 권고에 따라 RNA 클린업 키트를 사용하여 각 RNA 샘플을 정제하십시오. 참고 :이 단계를 수행하면 작은 RNA가 샘플에서 손실됩니다. </li></ol></li><li> RNA의 품질을 분석하기 위해 1.2 % 포름 알데히드 -MOPS 아가 로스 젤을 사용하여 1 μg 샘플을 전기 영동하십시오. 참고 : 대안으로, 바이오 분석기를 사용하여 샘플을 분석하여 RIN 번호 13 을 얻습니다. </li><li> 대상 mRNA (또는 miRNA)의 qPCR 분석을 위해 역전사 프로토콜을 사용하여 RNA를 cDNA에 역전사하십시오. </li></ol> 6. 조직 미생물 배양 <ol><li> 조직을 70 % 에탄올로 침지하여 배양하기 전에 절제 된 조직을 소독하십시오. </li><li> 슬라이드 또는 접시에 조직을 놓고 충분한 배양 배지 (DMEM : Ham &amp; # 1 : 1 혼합물)조직을 건조시키기 위해 10 % FBS, 25 mM HEPES, 100 IU / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신을 보충 한 F-12; 메스 블레이드를 사용하여 조심스럽게 조직을 파편 (&lt;1 mm 3 )으로 자릅니다. </li><li> 35 mm 조직 배양 접시에 조직 조각을 전송하고 각 조각 상단에 태아 소 혈청 (FBS)의 약 20 μL를 추가합니다. </li><li> 접시를 20 ~ 30 분 동안 또는 거의 건조 될 때까지 문화 후드에서 열어 두십시오. </li><li> 각 접시에 문화 매체 (10 % FBS, 25 MM HEPES, 100 IU / ML 보충의 DMEM : 햄의 F - 12 1 : 1 혼합물, 페니실린 100 μg / ML streptomycin)를 추가하고 37 ° 부화 5 % CO2에서 C. 필요에 따라 하위 문화를 배양하거나 배양 물을 복제하십시오. </li></ol>

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저자의 지식에 따르면이 프로토콜은 비용 효율적이고 빠른 접근 방식으로 피부 조직 샘플을 임상 적으로 조달하는 데 주력하는 최초의 제품입니다. Mohs 미세 수술을받는 환자는 일반적으로 특정 시간대에 예정되며 수집은이 기간으로 제한됩니다. 샘플 채취에는 환자 관리에 종사하는 의료 보조원, 종양 샘플을 처리하는 모스 (Mohs) histotechnologist 및 샘플 진입 및 혈액 처리를 담당하는 지정 실험실...

암 및 바이오 마커 연구는 우수한 인체 조직 샘플의 공급에 의존하며, 제한된 공급으로 인해 연구 1,2 가 방해 받고 있습니다. 많은 피부 과학 연구는 인간 조직의 사용과 관련된 부적절한 공급, 다양한 품질 및 비용으로 인해 제한됩니다. 대형 전용 바이오 뱅크를 설립하는 데 드는 비용은 약 2 백만 달러로 추정되며, 이러한 비용은 인체 조직을 많은 연구자들이 사용할 수 없게 만듭니다. 또한 연구 샘플을 생성하고 저장하는 과정은 신중하게 실행하지 않으면 임상 조작에 영향을 미치고 환자 치료를 지연시킬 위험이 있습니다. 비용 효과적인 클리닉 기반의 바이오 저장소는 권장되는 모범 사례와 샘플 검증 4 , 5 , 6 에 따라 피부암 샘플에 초점을 맞추고 있습니다. <p이 프로토콜은 편평 세포 암종 (SCC), 기저 세포 암종 (BCC) 및 흑색 종 피부암을 제거하기 위해 대량의 모스 현미경 수술을 수행하는 피부과 전문의에서 개발되었습니다. 자원 봉사자 기증자는이 환자 집단에서 모집 할 수 있습니다. 치료를 지연시키지 않고 동의 한 환자의 조직과 혈액을 신속하게 포획하기 위해서는 수집 장소에 바이오 저장소를 설치하는 것이 중요합니다. 같은 클리닉에서 샘플을 수집하면 수집 기술의 변화를 최소화하고 샘플의 품질 변화를 최소화 할 수 있습니다. 이는 다운 스트림 어플리케이션 7 , 8 에서 문제가 될 수 있습니다. Mohs 현미경 수술 기술의 목표는 최대한 많은 건강한 조직을 보존하면서 모든 암 조직을 제거하는 것입니다. 이 절차는 종양 조직의 얇은 층을 점진적으로 제거하는 것을 포함합니다. 연속되는 각 레이어는 그의(모든 종양 조직이 제거되었는지 여부를 결정하기 위해 피부과 의사가 종양 조직을 냉동시키고 H &amp; E 염색을 시행 한 후) 논리적으로 검사했다. 환자가 사무실에있는 동안 조직의 후속 층의 절제 및 검사가 실행됩니다. 이 기술은 SCC 9 에 대한 최상의 치료 옵션으로 간주됩니다. 이 시점에서 상처는 닫히고, 치유 및 미용 외관을 향상시키기 위해 인접한 정상 조직 (ANT)을 자주 절제합니다. 따라서 종양 제거 수술은 향후 연구를 위해 조직 학적으로 특성화 된 조직을 수집하는 데 이상적입니다. 종양 조직, 인접한 정상 조직, 타액 및 혈액 샘플을 얻기위한 조달 절차는 정상적인 직원 업무에 미치는 영향을 최소화하도록 설계되었습니다 ( 그림 1 ). 의료 보조원은 절차를 위해 환자를 준비하는 동안 혈액을 채취합니다. 모스 절차 완료 후, M<html> ohs histotechnologist는 표본의 추가 조직 슬라이드를 준비하고 조직을 biorepository에 전송합니다. 바이오 리포지토리 구축과 관련된 비용으로는 냉동 보관 냉동고 구입, 겸손한 임상 실험실 공간 창출 및 재고 추적 프로그램 개발 등이 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig1.jpg" /> 그림 1 : 샘플 수집 및 담당 직원의 순서. 환자가 체크인하고 환자의 동의를 얻으면 의료 보조원은 협측 면봉을 수집하여 혈액을 채취합니다. 피부과 의사와 의료 보조원은 종양을 절제하고 상처를 닫습니다. SCC와 ANT 표본은 각각 수집됩니다. 헌혈 기술자가 혈액을 처리하고 SCC 및 ANT 표본에 조직 배양, 보존 및 바이오 저장소로 들어가기위한 섹션을 분류합니다.ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 수집 된 샘플의 다양성은 다양한 실험 접근법을 가능하게합니다 ( 그림 2 ). 환자에게서 채취 한 샘플은 협측 면봉 (필요한 경우 타액을 수집 할 수 있음), 전혈 및 절제 된 조직입니다. 구강 내 면봉과 전혈에서 채취 한 샘플은 유전자 타이핑과 조직 일치를 위해 가공없이 저장됩니다. 미래의 분석을 위해 전혈이 백혈구 (WBC)와 혈장 분획으로 분리됩니다. 모스 처리 후, 동결 된 종양을 액체 질소에 직접 놓고 -80 ° C의 냉동고로 옮깁니다. 신선하고 실행 가능한 종양 조직 및 ANT 샘플은 이전 기술 10 , 11의 변형을 사용하여 배양 한 다음 저온 보존합니다. 수집하는 동안 각 샘플 유형의 번호는 스프레드 시트에 기록되기 전에 기록됩니다<html> 재고 추적 프로그램은 정확한 처리를 용이하게합니다 ( 표 1 ). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55583/55583fig2.jpg" /> 도표 2 : 진료소 ​​근거한 biorepository 견본 수집과 가공의 개관. 환자에게서 협측 면봉과 혈액 샘플을 수집하여 다운 스트림 genotyping과 조직 매칭을 위해 보관합니다. 전혈은 백혈구 (WBC) 분리 및 CTC 분석뿐만 아니라 혈장 수집 및 액체 생검 분석을 위해 추가 처리됩니다. Mohs 절차 중에 절제 한 조직을 진단 목적으로 조직 학적으로 처리 한 후 조직학 슬라이드를 면역 조직 화학 분석을 위해 실험적으로 사용할 수 있습니다. 절제 된 조직 샘플이 충분히 큰 경우, 신선한 조직의 일부를 제거하고 단백질 및 RNA 분리 및 배양 된 세포주를 확립하기 위해 절단한다.55583 / 55583fig1large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 컬렉션 날짜 : </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 환자 1 </td><td> 환자 2 </td><td> 환자 3 </td><td> 환자 4 </td><td> 환자 5 </td></tr><tr><td> 이니셜 및 생년월일 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 눈 색깔 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 샘플 유형 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 샘플 위치 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 타액 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 승구멍 혈액 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 혈장 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유력한 종양 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 조직 생체 적합성 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 종양 모스 액체 질소 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 조직 일반 액체 질소 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1 : 샘플 수집을 기록하기위한 체크리스트. 수집 된 각 샘플과 함께 추적되고 기록 된 데이터에는 환자의 머리 글자, 생년월일, 눈색 (피부 유형의 경우), 로케티on 표본 제거. 타액 샘플 수, 혈액 수집 체적 및 수집 된 생존 및 보존 된 조직 검체 수 또한 추후 사용을위한 참고 자료로 기록됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55583/Table1.xlsx">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 샘플 수집 절차의 유효성을 확인하기 위해 각 샘플 유형은 다운 스트림 어플리케이션에서 테스트되었습니다. 이전 기술 12의 수정을 사용하여, 종양 및 ANT는 단백질 및 RNA 분리에 성공적으로 사용되었으며 잠재적으로 DNA 분리에 사용될 수 있습니다. 조직 절편으로부터 확립 된 생체 외편은 현미경으로 평가되었으며, 보존 된 조직 슬라이드는 면역 조직 화학과 면역 형광 검사에 사용되었다. 여기에 설명 된 프로토콜을 따르면이 모델을 다른 피부과 진료소, 다른 종양 유형 (예 : 흑색 종)으로 확장 할 수 있습니다., 그리고 인간 암에 대한 다방면 연구를위한 인간 조직 샘플을 제공하는 기타 외과 전문 분야 및 관행. 이 프로토콜의 약간의 수정은 다른 관행에 필수적 일 수 있지만 원칙적으로이 프로토콜은 환자 치료 과정에서 수집 된 환자 샘플을 정기적으로 폐기하는 모든 수술에 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-949-411</td><td></td></tr><tr><td>Curved Medium Point General Purpose Forceps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9791321</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-363-579</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1950 Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743909</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Microscope Slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrome H&amp;amp;E Frozen Section Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>99-900-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03-337-7X</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Boca Scientific BuccalT-Swab&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC9679349</td><td></td></tr><tr><td>Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-195-822</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Microcentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-401-203</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Morter Cordless Homogenizer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-141-3</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Free Pellet Pestle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>121-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Forma SteriCycle CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-998-089</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SH30071.02</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-634-028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 1 M Hepes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-630-130</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cell Culture 35 mm with Vent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1256591</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24</td><td>Abnova</td><td>MAB12583</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p40 (p63 delta) antibody</td><td>Abnova</td><td>ABX-144A</td><td></td></tr><tr><td>Anti MUC-1 antibody</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-7313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail + Slug (phospho S246)</td><td>Abcam</td><td>Ab63568</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phallodin</td><td>Molecular Probes&amp;nbsp;</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>Molecular Probes&amp;nbsp;</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera</td><td>Zeiss</td><td>4300009901</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera</td><td>Olympus</td><td>IX511F3</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of a clinic-based biorepository

지난 몇 년 동안 피부암 ( 예, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종)이 증가 해 왔습니다. 생물 의학 연구를위한 피부 종양 샘플에 대한 병행 요구가있을 것으로 예상됩니다. 그러나 조직 가용성은 생물 저장소를 확립하는 비용과 임상 조작을 방해하지 않는 임상 샘플을 입수 할 수있는 프로토콜이 없기 때문에 제한적입니다. 모스 수술 날짜에 일상적인 임상 절차에 최소한의 영향을 미치는 피부 종양 및 관련 혈액 및 타액 샘플을 수집하고 처리하기위한 프로토콜이 수립되었습니다. Mohs histotechnologist가 생검에서 입증 된 피부 악성 종양에 대한 첫 번째 모스 수술을받는 환자로부터 종양 샘플을 수집하고 가공합니다. 인접한 정상 조직은 수술 종결시 수집됩니다. 수집 할 수있는 추가 샘플은 전혈 및 협측 스왑입니다.. 정상적으로 폐기 된 조직 표본을 활용함으로써 병원에서 실험실 환경을 기반으로 여러 가지 주요 이점을 제공하는 생물 저장소가 생성되었습니다. 여기에는 광범위한 수집 된 샘플이 포함됩니다. 병리학 보고서를 포함하여 확인되지 않은 환자 기록에 대한 접근; 전형적인 기증자의 경우 추적 방문 중에 추가 샘플을 이용할 수 있습니다.

종양 및 ANT는 단백질 분리에 성공적으로 사용되고 웨스턴 블 랏팅으로 시험되었습니다. 그림 3 에서 볼 수 있듯이, 클리닉 기반 바이오 저장소에 수집 및 저장 한 환자 표본에서 피부 편평 세포 암종 마커 (Muc1 14 , FHL-1 15 및 p40 16 , 17 )를 검출 할 수 있습니다. <p class="jove_content" f...

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Establishment of a Clinic-based Biorepository

피부 종양은 모스 (Mohs) 현미경 수술 후 폐기됩니다. 임상 지원 직원이 임상 작업을 방해하지 않고 하류 실험실 응용을위한 피부 종양 ( 예 : 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종) 샘플을 효과적으로 처리하고 저장할 수있는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.

클리닉 기반 생물 저장소의 설립

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

6.4K 조회수.  Midwestern University.  피부 종양은 모스 (Mohs) 현미경 수술 후 폐기됩니다. 임상 지원 직원이 임상 작업을 방해하지 않고 하류 실험실 응용을위한 피부 종양 ( 예 : 편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색 종) 샘플을 효과적으로 처리하고 저장할 수있는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 

비디오: Establishment of a Clinic-based Biorepository

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

종합 흉부 종양학 데이터베이스의 생성 - Translational 연구 도구

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

연구

의학

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires a platform for preclinical research. Over recent years, we have established a biobank of colorectal and pancreatic cancers comprising of primary tumor tissue, normal tissue, sera, isolated peripheral blood lymphocytes (PBL), patient-derived xenografts (PDX), as well as primary and secondary cancer cell lines. Since original tumor tissue is limited and the establishment rate of primary cancer cell lines is still relatively low, PDX allow not only the preservation and extension of the biobank but also the generation of secondary cancer cell lines. Moreover, PDX-models have been proven to be the ideal in vivo model for preclinical drug testing. However, biobanking requires careful preparation, strict guidelines and a well attuned infrastructure. Colectomy, duodenopancreatectomy or resected metastases specimens are collected immediately after resection and transferred to the pathology department. Respecting priority of an unbiased histopathological report, at the discretion of the attending pathologist who carries out the dissections, small tumor pieces and non-tumor tissue are harvested. 
Necrotic parts are discarded and the remaining tumor tissue is cut into small, identical cubes and cryopreserved for later use. Additionally, a small portion of the tumor is minced and strained for primary cancer cell culture. Additionally, blood samples drawn from the patient pre- and postoperatively, are processed to obtain serum and PBLs. For PDX engraftment, the cryopreserved specimens are defrosted and implanted subcutaneously into the flanks of immunodeficient mice. The resulting PDX closely recapitulate the histology of the "donor" tumors and can be either used for subsequent xenografting or cryopreserved for later use. In the following work, we describe the individual steps of creation, maintenance and administration of a large biobank of colorectal and pancreatic cancer. Moreover, we highlight the crucial details and caveats associated with biobanking.

In the following work, we describe the consecutive steps necessary for the establishment of a large biobank of colorectal and pancreatic cancer.

살아있는 바이오 뱅크의 창조 및 유지 보수 - 우리가 그것을 하는 방법

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

암 연구학

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Biobank for Translational Medicine: Standard Operating Procedures for Optimal Sample Management

Biobanks are key research infrastructures aimed at the collection, storage, processing, and sharing of high-quality human biological samples and associated data for research, diagnosis, and personalized medicine. The Biobank for Translational and Digital Medicine Unit at the European Institute of Oncology (IEO) is a landmark in this field. Biobanks collaborate with clinical divisions, internal and external research groups, and industry, supporting patients' treatment and scientific progress, including innovative diagnostics, biomarker discovery, and clinical trial design. Given the central role of biobanks in modern research, biobanking standard operating procedures (SOPs) should be extremely precise. SOPs and controls by certified specialists ensure the highest quality of samples for the implementation of science-based, diagnostic, prognostic, and therapeutic personalized strategies. However, despite numerous efforts to standardize and harmonize biobanks, these protocols, which follow a strict set of rules, quality controls, and guidelines based on ethical and legal principles, are not easily accessible. This paper presents the biobank standard operating procedures of a large cancer center.

Biobanks are crucial resources for biomedical research and the Biobank for Translational and Digital Medicine Unit at the European Institute of Oncology is a model in this field. Here, we provide a detailed description of biobanks' standard operating procedures for the management of different types of human biological samples.

중개 의학을 위한 바이오뱅크: 최적의 시료 관리를 위한 표준 운영 절차

Biobanks are key research infrastructures aimed at the collection, storage, processing, and sharing of high-quality human biological samples and ...

전립선 절제술 표본 매핑 및 해부를 위한 프로토콜

Enhancing Prostate Tumor Biobanking Reliability with Improved Sampling Technique and Histological Characterization

Acquiring fresh and well-characterized tumor tissue samples is critical for conducting high-quality &#34;omics&#34; studies. However, it can be particularly challenging in the context of prostate cancer (PC) due to the unique nature of this organ and the high heterogeneity associated with this tumor. On the other hand, histopathologically characterizing samples before their storage without causing significant tissue alterations is also an intriguing challenge. In this context, we present a new method for acquiring, mapping, characterizing, and micro-dissecting resected prostate tissue based on anatomopathological criteria.
Unlike previously published protocols, this method reduces the time required for histopathological analysis of the prostate specimen without compromising its structure, which is crucial for assessing surgical margins. Furthermore, it enables the delineation and micro-macro dissection of fresh prostate tissue samples, with a focus on histological tumor areas defined by pathological criteria such as Gleason score, precursor lesions (high-grade prostatic intraepithelial neoplasia - PIN), and inflammatory lesions (prostatitis). These samples are then stored in a Biobank for subsequent research analyses.

저자 스포트라이트: Advancing Prostate Cancer Research Through Improved Tissue Sampling and Biobanking (조직 샘플링 개선 및 바이오뱅킹을 통한 전립선암 연구 발전)

This protocol describes a method for facilitating the collection of samples from radical prostatectomy specimens. The goal is to map, characterize, and micro-macro dissect tissue samples from the specimens based on anatomopathological criteria before storing them in a Biobank.

개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

Acquiring fresh and well-characterized tumor tissue samples is critical for conducting high-quality &#34;omics&#34; studies. However, it can be ...

난소암 오가노이드 바이오뱅킹 표준화

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in research and patient care, standardization remains a challenge due to the heterogeneity of this lethal malignancy, combined with the inherent complexity of organoid technology. This adaptable protocol provides a systematic framework to realize the full potential of ovarian cancer organoids considering a patient-specific variability of progenitors. By implementing a structured experimental workflow to select optimal culture conditions and seeding methods, with parallel testing of direct 3D seeding versus a 2D/3D route, we obtain, in most cases, robust long-term expanding lines suitable for a broad range of downstream applications. 
Notably, the protocol has been tested and proven efficient in a great number of cases (N = 120) of highly heterogeneous starting material, including high-grade and low-grade ovarian cancer and stages of the disease with primary debulking, recurrent disease, and post-neoadjuvant surgical specimens. Within a low Wnt, high BMP exogenous signaling environment, we observed progenitors being differently susceptible to the activation of the Heregulin 1 &#223; (HER&#223;-1)-pathway, with HER&#223;-1 promoting organoid formation in some while inhibiting it in others. For a subset of the patient's samples, optimal organoid formation and long-term growth necessitate the addition of fibroblast growth factor 10 and R-Spondin 1 to the medium. 
Further, we highlight the critical steps of tissue digestion and progenitor isolation and point to examples where brief cultivation in 2D on plastic is beneficial for subsequent organoid formation in the Basement Membrane Extract type 2 matrix. Overall, optimal biobanking requires systematic testing of all main conditions in parallel to identify an adequate growth environment for individual lines. The protocol also describes the handling procedure for efficient embedding, sectioning, and staining to obtain high-resolution images of organoids, which is required for comprehensive phenotyping.

저자 스포트라이트: 난소암의 맞춤형 의학 발전 

This protocol offers a systematic framework for the establishment of ovarian cancer organoids from different disease stages and addresses the challenges of patient-specific variability to increase yield and enable robust long-term expansion for subsequent applications. It includes detailed steps for tissue processing, seeding, adjusting media requirements, and immunofluorescence staining.

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

클리닉 기반 생물 저장소의 설립

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개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

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