この研究は、Dong、X.に対するNIH R03 NS087322-01によって支持された。

注：すべての手順に含まれている動物試験は、ノーステキサス保健科学センターの施設動物実験および使用委員会の承認を受けています。 1.NGF HDL模倣ナノ粒子の調製<ol><li>賦形剤、ホスファチジルコリン（PC）、スフィンゴミエリン（SM）、ホスファチジルセリン（PS）、オレイン酸コレステリル（CO）およびD-α-トコフェリルポリエチレングリコールサクシネート（TPGS）をエタノールに溶解して1mg / mLの原液を調製する。 注：ストック溶液を等分し、-20℃で保存した。オレイン酸コレステリルは暗いボトルに貯蔵した。 PC、SM、PS、およびCOストック溶液は、それぞれ-20℃で6,13,12および12ヶ月間安定であった。 TPGS溶液は、-20℃で少なくとも12ヶ月間安定であった。 </li><li> NGF（水中1mg / mL）10μLをプロタミンUSP（水中1mg / mL）10μLと1.5mLマイクロ遠心チューブで混合し、室温で10分間放置する複合体を形成する。 注：NGFおよびプロタミン原液を等分し、-20℃で保存した。繰返し凍結および解凍はNGFストックには推奨されません。 </li><li>ガラスバイアルに、59μLのPC、11μLのSM、4μLのPS、15μLのCO、および45μLのTPGSをガラスバイアルに加える。エタノールを穏やかな窒素気流下で約5分間混合し、蒸発させる。すべての賦形剤は、ガラスバイアルの底部に油状の薄いフィルムを形成すべきである。 </li><li>バイアルに1 mLの超純水（1型）を加え、室温で5分間9,500 rpm（8,600 xg）でホモジナイズしてプロトタイプNPを形成する。 </li><li> ステップ1.2で調製した複合体をプロトタイプNPに添加し、ガラスバイアル中の小さな撹拌棒を用いて撹拌しながら37℃で30分間インキュベートする。 <ol><li>室温でさらに30分間撹拌することによりNPを冷却する。これが冷えた後、106μLのApo AI（1.49mg / mL）を添加し、室温で一晩撹拌して最終NGF HDLを模倣したNP。 </li></ol></li></ol> 2.NGF HDL模倣ナノ粒子のキャラクタリゼーション<ol><li> 製造元の指示に従って、粒子分析器（材料表を参照）を使用して、粒子サイズおよびゼータ電位を測定する。 </li><li>架橋アガロースゲルろ過クロマトグラフィーカラムを使用して、非負荷NGFをNGF HDL模倣NPから分離し、NGFの封入効率を決定する。 <ol><li>カラム調製のために、セファロース4B-CL懸濁液15mLを50mLビーカーに移す。ガラス棒を用いてビーズ懸濁液を撹拌し、カラム（30cm長さ×直径1cm、ガラスフリットを底にして）にいくらかを注ぐ。穏やかにカラムをタップして気泡を取り除く。溶媒を排出させ、ビーズを数分間静置する。 </li><li>残りのサスペンションを追加し続けます。カラムの内壁をすすいでビーズを洗浄します。溶媒レベルがわずかにaになるまで溶媒を排出する固定相の上部に位置する。 1×リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、137mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na 2 HPO 4 、および2mM KH 2 PO 4を含有するPBS）20mLでカラムを洗浄し、調整する。 </li><li>無負荷NGFを含む画分を決定するために、200μLのNGF溶液（10μg/ mL）をゲル濾過カラム（長さ25cm×直径1cm）に負荷し、1×PBSで溶出する。 </li><li>合計12の画分（各画分につき1mL）を集め、NGFについてのサンドイッチELISAキットを用いて各画分中のNGFの濃度を測定する。 </li><li>サンドイッチELISAキットを使用して、画分6〜10からNGFを検出する。カラムに負荷されていないNGFのクロマトグラムを取得する。 20mLのPBSでカラムを洗浄する。 </li><li> NGF HDL模倣NPを含有する画分を決定するために、200μLのNPをカラムに負荷し、1×PBSで溶出する。合計12の画分（各画分につき1mL）を集め、各画分の粒子の強度を測定する。粒度分析器を呼び出す。画分2から4までのNGF NPを検出する。 注：強度は、粒子分析装置によって測定されるパラメータであり、試験溶液中にいくつのナノ粒子が存在し得るかを示す。溶液中に存在するNPが多いほど強度は高くなります。このアプローチによって、本発明者らは、カラムが無負荷NGFからNGF NPを分離できることを確認することができる。 </li><li> NGFの捕捉効率を測定するために、200μLのNGF HDL模倣NPをカラムに負荷し、1×PBSで溶出する。合計12の画分を集める（各画分につき1 mL）。 </li><li>サンドイッチELISAキットを使用して、画分6〜10から無負荷NGF濃度を測定する。 </li><li>画分6〜10から測定したNGF量を無負荷NGFとして加え、次の式を用いてNGFの捕捉効率を計算する。 ％EE =（1-無負荷NGF / NPに添加された総NGF）×100％式（1） </li></ol></li></ol> 3.NGF HDLのインビトロ放出- ナノ粒子を真似る<ol><li> NGF（水中10μg/ mL; n = 4）およびNGF HDL-模倣NP（10μg/ mL; n = 4）を並行して調べる。 </li><li>製造者の指示に従って、8つの透析チューブ（分子量カットオフ：300kDa）を前処理する。 </li><li>放出培地としてPBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）を調製する。 30 mLの放出培地を50 mLの遠心チューブに加え、振とう速度が135 rpmのシェーカーで37℃まで温めます。交換のためにシェーカーに放出培地をさらに50mL入れる。 </li><li> 400μLの放出培地を透析チューブに加え、迅速に200μLの試験サンプルを加えて、透析に十分な容量を作ります。 </li><li>チューブを閉じ、迅速に透析チューブをリリース培地（遠心チューブ）に入れます。即座に、時間0のサンプルとして、外部透析チューブから放出培地100μLを抜き取る。後で分析するためにサンプルを直ちに-20℃に置く。新鮮な100μLを加える遠心分離管に培地をリースして取り出されたサンプルを交換する。タイマーを開始します。 </li><li> 1,2,4,6,8,24,48および72時間で、100μLの放出培地を回収し、100μLの新鮮な培地と交換する。後で分析するために取り出したサンプルを直ちに-20℃に置く。 </li><li> 72時間後、すべてのサンプルを-20℃から取り出し、室温で解凍する。サンドイッチELISAキットを用いて放出サンプルのNGF濃度を測定する。 </li></ol> 4. NGF HDL模倣ナノ粒子の生理活性（神経突起伸長試験） <ol><li> 10％熱不活性化ウマ血清、5％ウシ胎児血清、100μg/ mLストレプトマイシンおよび100単位/ mLペニシリンを補充したRPMI-1640培地中の培養PC12細胞。加湿インキュベーター内で37℃、5％CO 2で細胞を維持する。 </li><li>細胞が約70〜80％コンフルエンスに達すると、培養培地を除去し、細胞を1×PBS（10cm 2あたり約2mL）で洗浄し、2つの培養表面積）。洗浄液を除去する。 0.25％トリプシン-EDTA溶液（0.25％トリプシンおよび1mM EDTA;培養表面積10cm 2あたり0.5mL）をフラスコに添加し、37℃でインキュベートしてほとんどの細胞が剥がれるまで細胞をトリプシン処理します。 </li><li> 2倍量の培地を添加し、5分間180xgでスピンダウンする。上清を除去し、5mLの培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞クラスターを破壊するために、22G、1/2インチの針を通して細胞をろ過する。 </li><li>新しい細胞培養フラスコに1：3の比率で細胞を分割する。一晩インキュベートした後、結合していないPC12細胞を除去する。付着した細胞をさらなる成長のために残す。 </li><li>この手順を3回繰り返すことにより、強い接着性を有するPC12の継代培養を選択する。 6ウェルプレートに800μL/ウェルのラット尾コラーゲンI型（100μg/ mL）を予めコートする。 </li><li>ステップ4.2で説明したように、選択したPC12細胞をトリプシン処理し、22 G、1/2インチ針で細胞クラスターを破壊する。血球計数器で細胞を数える。細胞をプレートに付着させるために、ステップ4.5のプレコートされた6ウェルプレートに10,000細胞/ウェルの密度で細胞を一晩シードする。 </li><li> 0.5,1,5,10,50、および100 ng / mLの濃度を調製するために、培地（手順4.1に記載）で遊離NGF（10μg/ mL）およびNGF HDL模倣NP（10μg/ mL）を希釈する。各ウェルから2mLの培地を除去し、2mLの希釈した遊離NGFまたはNGF HDL模倣NPと交換する。 4日間培養する。 </li><li> 4日目に、対応する処置を含む新鮮な培地（ステップ4.1に記載）に培地を交換し、さらに3日間処置を続ける。 </li><li> 7日目に、倒立光学顕微鏡で細胞を視覚化し、各ウェルを10倍の倍率でランダムスポットで画像化する。 </li></ol> 5.NGF HDL模倣ナノ粒子の生体内分布<ol><li>大人のBALB / cマウス（雄、25〜30 g）を用いてNGF NPの組織分布を推定する。グループあたり3匹のマウスからなる3つのグループに無作為にマウスを分ける。マウスを拘束し、尾部をエタノールで拭いて血管拡張および静脈の可視性を促進するために、円錐形のプラスチック拘束具（ 例えば、デカプリコーン）を使用する。 </li><li> 100μLの生理食塩水、遊離NGF、またはNGF HDL模倣NPをマウスの各群（3群）に尾静脈を通して40μg/ kgのNGFの用量で注射する。 1 mLシリンジに付属の30 1/2 G針を使用してください。 </li><li> 注射30分後に、3％吸入イソフルラン（2L /分の流速で酸素中）を用いてマウスを麻酔する。麻酔の深さを決定するために尾とつまみを実行します。心臓穿刺によって血液を採取する。 <ol><li>心臓から約1mLの血液を抜き取る。頸部脱臼によって各マウスを安楽死させる。 </li></ol></li><li>背臥位にマウス屠体を置きます。外科用はさみを使用して腹部を開き、脂肪と腸を別に移動する肝臓、脾臓、および腎臓を暴露するために綿棒を使用する。これらの組織を採取し、血液をきれいにするために1×PBSですすいでください。 </li><li>直ちに3,400 xgと4℃で5分間血液サンプルを遠心分離して血漿を得る。分析まで血漿および組織を-80℃で保存する。 </li><li>組織サンプルを分析するには、サンプルを-80℃から4℃に移動させ、10倍量の抽出緩衝液（0.05M酢酸ナトリウム、1.0M塩化ナトリウム、1％トリトンX-100、 1％BSA、0.2mMフェニルメタンスルホニルフルオライド、および0.2mM塩化ベンゼトニウム）。 10,000 rpmおよび4℃で5分間ホモジナイズする。 </li><li>手順5.3および5.4に記載されているように、未処置の2匹のマウスを犠牲にして、空の血漿および組織を収集する。空の血漿またはブランク組織ホモジェネートを用いてNGF標準溶液を調製する。 </li><li>上記のように、サンドイッチELISAキットを使用して、血漿および組織ホモジェネート中のNGFの濃度を決定する。 </li></ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoproteins+for+the+systemic+delivery+of+short+interfering+RNA.">High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA.</a> Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).</li><li>McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+as+cancer+therapy.">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy.</a> Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).</li><li>Lerch, P. G., F&#246;rtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+a+reconstituted+high+density+lipoprotein+for+therapeutic+applications.">Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications.</a> Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).</li><li>Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mimicking+peptide-lipid+nanoparticles+with+improved+tumor+targeting.">HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting.</a> Small. 6 (3), 430-437 (2010).</li><li>Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. 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著者は何も開示することはない。

この研究では、NGFカプセル化のためにHDL模倣NPを調製する簡単な方法を実証する。様々なNP送達系がタンパク質を送達するために研究されている。現在、多くのNP調製物は、透析、溶媒沈殿、および膜水和を含む。これらのプロセスは一般に複雑であり、スケールアップには困難が伴う。このNP発達の間、脂質は容器のガラス壁に強い接着性を有し、薄膜を水​​和させ、賦形剤を効率的に混?...

タンパク質、ペプチド、および核酸などの高分子は有望な投薬として出現しており、過去数十年間でかなりの注目を集めています1,2 。彼らの高い有効性と特定の行動様式のために、彼らは癌、免疫疾患、HIV、および関連する病気の治療のための大きな治療可能性を示す3,4。しかしながら、それらの大きな分子サイズ、三次元構造、表面電荷、および親水性のような物理化学的性質は、これらの高分子のin vivo送達を非常に困難にする。これは彼らの臨床的使用を著しく妨げる4 。マイクロ粒子、ポリマーナノ粒子（NP）、リポソーム、および脂質NPなどの薬物送達システムにおける最近の進歩は、これらの課題を克服し、巨大分子のin vivo送達を有意に改善した。ホこれらの送達貨物に関するいくつかの欠点が明らかにされており、薬物負荷能力が低く、捕捉効率が低く、半減期が短く、生物活性が低下し、望ましくない副作用があることが明らかにされている5,6,7,8。有効なキャリアシステムは依然として研究の関心領域である。さらに、薬物を含むNPを特徴付ける分析方法の開発は、小分子よりも巨大分子にとってより困難である。 高密度リポタンパク質（HDL）は、アポリポタンパク質およびリン脂質単分子膜で被覆された脂質コアからなる天然NPである。内在性HDLは、SR-BI、ABCAI、およびABCG1などの標的受容体とのその相互作用を介して、脂質、タンパク質および核酸の輸送において重要な役割を果たす。それは、異なる治療剤の送達のための媒体として探求されている9、 10,11,12 。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。透析は一般的なアプローチです。この方法において、NPは、コール酸ナトリウム溶液を用いて脂質膜を水和させることによって形成される。次に、塩を3つの緩衝液で2日間透析することにより除去する（ 13） 。超音波処理法は、加熱条件下で脂質混合物を60分間超音波処理することによりNPを製造する。 NPはゲルクロマトグラフィーによりさらに精製される14 。マイクロフルイディクスは、マイクロ流体デバイスを介してNPを生成し、マイクロ流体デバイスは、リン脂質およびアポリポタンパク質AI（Apo AI）溶液を、集束パターンで微小渦を生成することによって混合する。明らかに、これらの方法は、工業規模でのスケールアップには時間がかかり、厳しく、困難な場合があります。 この記事では、神経のための新規なHDL模倣NPの調製および特徴付けを紹介する成長因子（NGF）カプセル化。 NGFは、2つの13.6kDaポリペプチドモノマーを含むジスルフィド結合ポリペプチドホモダイマーである。ホモジナイゼーションによってNPを調製し、続いてNGFをNPにカプセル化する新規手順を開発した。 NGF HDL模倣NPは、粒子サイズ、サイズ分布、ゼータ電位、およびインビトロ放出に関して特徴付けられた 。それらの生物活性を、PC12細胞における神経突起伸長について評価した。マウスの静脈内注射後のNGF HDL模倣NPの体内分布を遊離NGFの体内分布と比較した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Beta-NGF</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>NGF-05H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-a-Phosphatidylcholine (PC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>131601P</td>
			<td>95%, Egg, Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (SM)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Brain, Porcine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine (PS)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840032P</td>
			<td>Brain, Porcine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl oleate (CO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-&#945;-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)</td>
			<td>BASF</td>
			<td>9002-96-4</td>
			<td>Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>meets USP testing specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apolipoprotein A1, Human plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology</td>
			<td>16-16-120101</td>
			<td>1mg in 671 &#181;l 10 mM NH4HCO3, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 4B-CL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CL4B200</td>
			<td>Cross-linked agarose,&#160; gel filtration chromatography column filling material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich ELISA Kit for NGF</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>DY008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30074.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzethonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Tekmar</td>
			<td>T 25-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delsa Nano HC particle analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Delsa Nano HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>G235036</td>
			<td>Molecule Cutoff 300 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytron homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT 1200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DecapiCone</td>
			<td>&#160;Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>DC-M200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation

この記事の目的は、神経成長因子（NGF）負荷、高密度、リポタンパク質（HDL）模倣性ナノ粒子（NP）の調製および特徴付け方法を紹介することである。 HDLは内因性NPであり、治療剤の送達のための媒体として研究されている。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。しかしながら、それらは一般に複雑で時間がかかり、工業規模では困難である。この研究では、一段階ホモジナイゼーションを用いて賦形剤を混合し、プロトタイプNPを形成した。 NGFは26kDaの水溶性タンパク質である。 HDL模倣NPの脂質環境へのNGFの封入を容易にするために、プロタミンUSPを用いてNGFとイオン対複合体を形成し、NGF表面の電荷を中和した。次いで、NGF /プロタミン複合体をプロトタイプNPに導入した。アポリポタンパク質AIを最終的にNPの表面上に被覆した。 NGF HDL模倣NPは、長期間に好ましい特性を示した粒度分布、捕捉効率、 インビトロ放出、生物活性、および生体内分布が含まれる。 HDL模倣NPにおけるホモジナイゼーションの注意深い設計と探索により、手順は大幅に単純化され、NPはスケーラブルに作られました。さらに、NPから無負荷NGFを分離し、 in vitro放出試験を確実に行い、NPの生物活性を測定するなどの様々な課題が克服された。

イオン対戦略によって調製されたHDL模倣、α-トコフェロール被覆NGF NPの工学的スキームを図1に示す 。 NGFの表面電荷を中和するために、プロタミンUSPをイオン対剤として用いてNGFと複合体を形成させた。生物活性を保護するために、プロトタイプのHDL模倣NPを、最初にホモジナイゼーションを用いて操作した。次いで、NGF /プロタミン複合体をプロトタイ?...

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Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

単純なホモジナイゼーションを用いて、神経成長因子を封入するための新規な高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子を調製した。課題、ナノ粒子の調製、 インビトロの特性評価、およびインビボ研究の詳細なプロトコールがこの記事で説明されています。

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K ビュー.  University of North Texas Health Science Center. 単純なホモジナイゼーションを用いて、神経成長因子を封入するための新規な高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子を調製した。課題、ナノ粒子の調製、 インビトロの特性評価、およびインビボ研究の詳細なプロトコールがこの記事で説明されています。 

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Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

生物工学

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

A protocol for the preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug loaded 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG) micelles is described.

親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

要約

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上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニリムラスライセート (ラル) 試金を使用して

神経成長因子のキャリアとしてポーラスシリコン膜の設計

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

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上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

親油性ドキソルビシンプロドラッグミセルの調製とキャラクタリゼーション

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニリムラスライセート (ラル) 試金を使用して

神経成長因子のキャリアとしてポーラスシリコン膜の設計