Este trabalho foi suportado por NIH R03 NS087322-01 a Dong, X.

NOTA: Os estudos em animais incluídos em todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte de Texas. 1. Preparação de nanopartículas NGF HDL-imitando <ol><li> Dissolver os excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) e succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol (TPGS), em etanol para preparar soluções-mãe a 1 mg / mL. NOTA: As soluções stock foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O oleato de colesterilo foi armazenado em garrafas escuras. As soluções mãe PC, SM, PS e CO foram estáveis ​​até 6, 3, 12 e 12 meses, respectivamente, a -20 ° C. A solução de TPGS foi estável durante pelo menos 12 meses a -20 ° C. </li><li> Misturar 10 μL de NGF (1 mg / mL em água) com 10 μL de protamina USP (1 mg / mL em água) num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixar repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente paraForma o complexo. NOTA: As soluções stock de NGF e protamina foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O congelamento e descongelamento repetidos não são recomendados para o stock de NGF. </li><li> Adicionar 59 μL de PC, 11 μL de SM, 4 μL de PS, 15 μL de CO e 45 μL de TPGS num frasco de vidro. Misturar e evaporar o etanol sob uma corrente de azoto suave durante cerca de 5 min; Todos os excipientes devem formar uma película fina e oleosa na parte inferior do frasco de vidro. </li><li> Adicionar 1 mL de água ultrapura (tipo 1) ao frasco e homogeneizar a 9.500 rpm (8.600 xg) durante 5 min à temperatura ambiente para formar o protótipo NPs. </li><li> Adicionar o complexo preparado no passo 1.2 ao protótipo de NPs e incubar a 37 ° C durante 30 min com agitação utilizando uma pequena barra de agitação no frasco de vidro. <ol><li> Arrefecer os NPs por agitação à temperatura ambiente durante mais 30 min. Após esta arrefecer, adicionar 106 μL de Apo AI (1,49 mg / mL) e agitar à temperatura ambiente durante a noite para formar a solução finalNGF HDL imitando NPs. </li></ol></li></ol> 2. Caracterização de nanopartículas NGF HDL-imitando <ol><li> Medir o tamanho de partícula eo potencial zeta usando um analisador de partículas (veja a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Utiliza-se uma coluna de cromatografia de filtração em gel de agarose reticulada para separar o NGF não carregado das NPs que imitam o HDL de NGF e determinar a eficiência de retenção do NGF. <ol><li> Para a preparação da coluna, transferir 15 mL de suspensão de Sepharose 4B-CL para um copo de 50 mL. Agitar a suspensão de pérolas usando uma haste de vidro e despejar um pouco em uma coluna (30 cm de comprimento x 1 cm de diâmetro, com uma frita de vidro na parte inferior). Toque suavemente a coluna para se livrar das bolhas. Permitir que o solvente para drenar e as pérolas para resolver por alguns minutos. </li><li> Continue adicionando a suspensão restante. Enxágüe a parede interna da coluna para limpar os grânulos. Drenar o solvente até o nível de solvente ser ligeiramenteBove o topo da fase estacionária. Lavar e condicionar a coluna com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS, contendo NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM e KH2PO4 2 mM). </li><li> Para determinar as fracções contendo NGF não carregado, introduzir 200 μL de solução de NGF (10 μg / mL) na coluna de filtração em gel (25 cm de comprimento x 1 cm de diâmetro) e eluir com 1x PBS. </li><li> Recolher um total de 12 fracções (1 mL para cada fracção) e medir a concentração de NGF em cada fracção utilizando um kit ELISA de Sandwich para NGF. </li><li> Detectar NGF a partir das fracções 6 a 10 utilizando o kit Sandwich ELISA. Obter um cromatograma de NGF não carregado na coluna. Lavar a coluna com 20 mL de PBS. </li><li> Para determinar as fracções contendo NPs que imitam o HDL de NGF, carregue 200 μL dos NPs sobre a coluna e elui-se com 1x PBS. Recolher um total de 12 frações (1 mL para cada fração) e medir a intensidade de partículas em cada fração uO analisador de tamanho de partícula. Detectar os NGF NPs das fracções 2 a 4. NOTA: A intensidade é um parâmetro medido pelo analisador de partículas, que indica quantas nanopartículas podem existir na solução de teste. Quanto mais NPs existem em solução, maior a intensidade é. Por esta abordagem, podemos confirmar que a coluna pode separar NGF NPs de NGF não carregado. </li><li> Para medir a eficiência de retenção de NGF, carregue 200 μL de NPs que imitam o NGF HDL para a coluna e elui-se com 1x PBS. Recolher um total de 12 fracções (1 mL para cada fracção). </li><li> Medir a concentração de NGF não descarregada das fracções 6 a 10 utilizando o kit Sandwich ELISA. </li><li> Adicionar as quantidades de NGF medidas a partir das fracções 6 a 10 juntas como o NGF não carregado e calcular a eficiência de retenção de NGF utilizando a equação seguinte. % EE = (1 - NGF não carregado / NGF total adicionado ao NP) x 100% Equação (1) </li></ol></li></ol> 3. Libertação in vitro de NGF HDL-mimicando nanopartículas <ol><li> Estudo de NGF livre (10 μg / mL em água, n = 4) e NGF HDL imitando NPs (10 μg / mL, n = 4) em paralelo. </li><li> Pre-treat 8 tubos de diálise (peso molecular de corte: 300 kDa), seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Preparar 5% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS como meio de libertação. Adicionar 30 mL de meio de libertação a um tubo de centrífuga de 50 mL e aquecer até 37 ° C num agitador com uma velocidade de agitação de 135 rpm. Coloque mais 50 ml de meio de liberação no agitador para substituição. </li><li> Adicionar 400 μL de meio de libertação ao tubo de diálise e adicionar rapidamente 200 μL da amostra testada para obter volume suficiente para diálise. </li><li> Feche o tubo e coloque rapidamente o tubo de diálise no meio de libertação (o tubo de centrífuga). Retire rapidamente 100 μL do meio de libertação do tubo de diálise exterior como amostra para o tempo 0. Coloque imediatamente a amostra em -20 ° C para análise posterior. Adicionar 100 μL deLeasing no tubo de centrifugação para substituir a amostra retirada. Inicie o temporizador. </li><li> A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, retirar 100 μL do meio de libertação e substituí-lo por 100 μL de meio fresco. Colocar imediatamente as amostras retiradas em -20 ° C para análise posterior. </li><li> Após 72 h, retirar todas as amostras de -20 ° C e descongelá-las à temperatura ambiente. Meça as concentrações de NGF das amostras de libertação utilizando o kit Sandwich ELISA. </li></ol> 4. Bioatividade de nanopartículas que simulam HDL de NGF (Estudo de Crescimento de Neurite) <ol><li> Células PC12 de cultura em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro de cavalo inactivado pelo calor, 5% de soro de bovino fetal, 100 μg / mL de estreptomicina e 100 unidades / mL de penicilina. Manter as células numa incubadora humidificada a 37 ° C e com 5% de CO2. </li><li> Quando as células atingem ~ 70-80% de confluência, remover o meio de cultura e lavar as células com 1x PBS (aproximadamente 2 mL por 10 cm &lt;Sup&gt; 2 área de superfície de cultura). Remover a solução de lavagem. Trypsinize as células por adição de 0,25% de solução de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina e 1 mM EDTA, 0,5 mL por 10 cm 2 área de superfície de cultura) para o frasco e incubar a 37 ° C até a maioria das células são destacados. </li><li> Adicionar dois volumes de meio de cultura e girar para baixo a 180 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 5 mL de meio de cultura. Filtrar as células através de uma agulha de 22 G, ½ polegada para quebrar clusters de células. </li><li> Dividir as células numa proporção de 1: 3 num novo frasco de cultura de células. Após incubação durante a noite, remover as células PC12 não ligadas. Permitir que as células anexadas para permanecer para o crescimento. </li><li> Repita este procedimento para 3 passagens para selecionar a subcultura de PC12 que tem uma forte propriedade de adesão. Pré-revestir uma placa de 6 poços com 800 μL / poço de colágeno de cauda de rato tipo I (100 μg / mL). </li><li> Trypsinize as células PC12 selecionadas como descrito no passo 4.2 e filtrá-las através de um22 G, agulha de ½ polegada para quebrar os aglomerados de células. Conte as células com um hemocitômetro. Semear as células durante a noite a uma densidade de 10.000 células / poço na placa de 6 poços pré-revestida no passo 4.5 para permitir que as células se liguem à placa. </li><li> Diluir NPs (10 μg / mL) com NGF livre (10 μg / mL) e NGF HDL com o meio de cultura (descrito no passo 4.1) para preparar concentrações de 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 ng / mL. Remover 2 mL de meio de cada poço e substituir com 2 mL do NGF livre diluído ou NGF HDL imitando NPs. Cultura durante 4 dias. </li><li> No dia 4, mude o meio para meio fresco (descrito no passo 4.1) contendo o tratamento correspondente e continue o tratamento durante mais 3 dias. </li><li> No dia 7, visualize as células com um microscópio de luz invertida e imagem cada poço em pontos aleatórios sob ampliação 10X. </li></ol> 5. Biodistribuição de nanopartículas NGF HDL-imitando <ol><li> Utilizar ratos BALB / c adultos (macho, 25-30 g) para tÉ a distribuição tecidual de NGF NPs. Distribua aleatoriamente os ratinhos em três grupos de 3 ratinhos por grupo. Use um sistema de retenção em forma de cone plástico ( por exemplo, decapicone) para restringir um mouse e limpe a cauda com etanol para promover a vasodilatação ea visibilidade da veia. </li><li> Injectar 100 μL de NPs de solução salina, NGF livre ou NGF HDL-imitando cada grupo de ratinhos (3 grupos) através das veias da cauda numa dose de 40 μg / kg de NGF. Use uma agulha de 30½ G presa a uma seringa de 1 mL. </li><li> Aos 30 minutos após a injecção, anestesiar os ratinhos utilizando isoflurano inalado a 3% (em oxigénio a uma taxa de fluxo de 2 L / min). Executar uma pinça de cauda e dedo do pé para determinar a profundidade da anestesia. Recolher sangue por punção cardíaca. <ol><li> Retirar aproximadamente 1 mL de sangue do coração. Eutanizar cada rato por deslocamento cervical. </li></ol></li><li> Coloque a carcaça do mouse em decúbito dorsal. Abra o abdômen com tesoura cirúrgica e mova a gordura eo intestino de ladoUsando um cotonete para expor o fígado, baço e rim. Colher estes tecidos e enxaguá-los em 1x PBS para limpar o sangue. </li><li> Centrifugar imediatamente as amostras de sangue a 3,400 xg e 4 ° C durante 5 min para se obter o plasma. Armazenar o plasma e tecidos a -80 ° C até as análises. </li><li> Para analisar as amostras de tecido, mover as amostras de -80 ° C para 4 ° C e suspender 100 mg de amostra de tecido num volume 10x de tampão de extracção (acetato de sódio 0,05 M, cloreto de sódio 1,0 M, 1% de triton X-100, 1% de BSA, 0,2 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo e 0,2 mM de cloreto de benzetónio). Homogeneizar a 10 000 rpm e 4 ° C durante 5 min. </li><li> Sacrifique dois ratinhos não tratados para recolher plasma e tecidos em branco, como descrito nos passos 5.3 e 5.4. Preparar soluções padronizadas de NGF utilizando homogeneizados de plasma em branco ou de tecido em branco. </li><li> Determine as concentrações de NGF nos homogeneizados de plasma e de tecido utilizando o kit ELISA de Sandwich, como descrito acima. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+and+recent+advances+in+peptide+and+protein+drug+delivery.">Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery.</a> Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).</li><li>Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-density+lipoprotein-mediated+drug+delivery+system.">A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).</li><li>Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL+as+a+drug+and+nucleic+acid+delivery+vehicle.">HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle.</a> Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).</li><li>Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+delivery+of+protein+therapeutics.">Long-term delivery of protein therapeutics.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).</li><li>Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Medical application of liposomes. , (1998).</li><li>Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+an+update+review.">Liposomal drug delivery systems: an update review.</a> Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).</li><li>Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspheres+for+protein+delivery+prepared+from+amphiphilic+multiblock+copolymers:+2.+Modulation+of+release+rate.">Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate.</a> J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).</li><li>Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+protein+and+peptide+drug+delivery:+a+special+emphasis+on+polymeric+nanoparticles.">Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles.</a> Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).</li><li>Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoproteins:+nature's+multifunctional+nanoparticles.">High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles.</a> ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).</li><li>Gursky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+stability+and+functional+remodeling+of+high-density+lipoproteins.">Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).</li><li>McMahon, K. M., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+lipoproteins+for+the+systemic+delivery+of+short+interfering+RNA.">High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA.</a> Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).</li><li>McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+as+cancer+therapy.">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy.</a> Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).</li><li>Lerch, P. G., F&#246;rtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+a+reconstituted+high+density+lipoprotein+for+therapeutic+applications.">Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications.</a> Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).</li><li>Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mimicking+peptide-lipid+nanoparticles+with+improved+tumor+targeting.">HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting.</a> Small. 6 (3), 430-437 (2010).</li><li>Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+step+reconstitution+of+multifunctional+high-density+lipoprotein-derived+nanomaterials+using+microfluidics.">Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics.</a> ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).</li><li>Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+HDL-mimicking+&#945;-tocopherol-coated+nanoparticles+to+encapsulate+nerve+growth+factor+and+evaluation+of+biodistribution.">Development of novel HDL-mimicking &#945;-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution.</a> Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste estudo, demonstramos um método simples para preparar NPs que imitam o HDL para o encapsulamento de NGF. Vários sistemas de libertação de NP foram estudados para fornecer proteínas. Atualmente, muitas preparações de NP envolvem diálise, precipitação com solvente e hidratação de filme. Esses processos são geralmente complicados e desafiadores na escala-up. Durante este desenvolvimento de NP, determinou-se que os lípidos tinham uma forte aderência à parede de vidro do recipiente, o que levou às dific...

As macromoléculas, como proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos, têm emergido como medicamentos promissores e ganharam considerável atenção nas últimas décadas 1 , 2 . Devido à sua alta eficácia e modos de ação específicos, eles apresentam grande potencial terapêutico para os tratamentos de câncer, doenças imunes, HIV, e condições relacionadas 3 , 4 . No entanto, as propriedades físico-químicas, tais como o seu grande tamanho molecular, estrutura tridimensional, cargas de superfície e natureza hidrofílica, tornam a introdução in vivo destas macromoléculas muito desafiadora. Isto dificulta consideravelmente o seu uso clínico 4 . Avanços recentes em sistemas de libertação de fármacos, tais como micropartículas, nanopartículas de polímero (NPs), lipossomas e NPs lipídicos superaram estes desafios e melhoraram significativamente a administração in vivo de macromoléculas. HoAlgumas desvantagens quanto a estas cargas de entrega foram reveladas, incluindo baixa capacidade de carga de droga, baixa eficiência de aprisionamento, meia-vida curta, perda de bioatividade e efeitos colaterais indesejáveis 5 , 6 , 7 , 8 . Sistemas portadores eficazes continuam a ser uma área de interesse de pesquisa. Além disso, o desenvolvimento de métodos analíticos para caracterizar NPs carregados de fármaco é mais desafiador para macromoléculas do que para moléculas pequenas. A lipoproteína de alta densidade (HDL) é um NP natural composto de um núcleo lipídico que é revestido por apolipoproteínas e uma monocamada de fosfolípidos. O HDL endógeno desempenha um papel crítico no transporte de lípidos, proteínas e ácidos nucleicos através da sua interacção com receptores alvo, tais como SR-BI, ABCAI e ABCG1. Foi explorado como um veículo para a distribuição de diferentes agentes terapêuticos 9, 10 , 11 , 12 . Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. A diálise é uma abordagem popular. Neste método, os NPs são formados por hidratação de um filme lipídico utilizando solução de colato de sódio. O sal é então removido através de uma diálise de 2 dias com três tampões 13 . Os métodos de sonicação fabricam NPs por sonicação de uma mistura de lípidos durante 60 min sob uma condição de aquecimento; As NPs são ainda purificadas através de cromatografia em gel 14 . Microfluídica gera NPs através de um dispositivo microfluídico, que mistura fosfolipídios e apolipoproteína AI (Apo AI) soluções, criando microvórtices em um padrão de focalização [ 15] . Claramente, estes métodos podem ser demorados, duros, e difíceis para o scale-up industrial. Neste artigo, apresentamos a preparação e caracterização de novos NPs simuladores de HDL paraEncapsulamento de factor de crescimento (NGF). O NGF é um homodímero de polipéptido ligado por dissulfureto contendo dois monómeros de polipéptido de 13,6 kDa. Foi desenvolvido um novo procedimento para preparar as NPs por homogeneização, seguido pela encapsulação de NGF nas NPs. As NPs simuladoras de HDL de NGF foram caracterizadas quanto ao tamanho de partícula, distribuição de tamanho, potencial zeta e libertação in vitro . A sua bioactividade foi avaliada quanto ao crescimento de neurites em células PC12. A biodistribuição de NGF HDL-imitando NPs foi comparada com a de NGF livre após injecção intravenosa em ratinhos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Beta-NGF</td>
			<td>Creative Biomart</td>
			<td>NGF-05H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-a-Phosphatidylcholine (PC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>131601P</td>
			<td>95%, Egg, Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (SM)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Brain, Porcine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylserine (PS)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840032P</td>
			<td>Brain, Porcine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl oleate (CO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-&#945;-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)</td>
			<td>BASF</td>
			<td>9002-96-4</td>
			<td>Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>meets USP testing specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apolipoprotein A1, Human plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology</td>
			<td>16-16-120101</td>
			<td>1mg in 671 &#181;l 10 mM NH4HCO3, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 4B-CL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CL4B200</td>
			<td>Cross-linked agarose,&#160; gel filtration chromatography column filling material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich ELISA Kit for NGF</td>
			<td>R&#38;D system</td>
			<td>DY008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>SH30074.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzethonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Tekmar</td>
			<td>T 25-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delsa Nano HC particle analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Delsa Nano HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>G235036</td>
			<td>Molecule Cutoff 300 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytron homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>PT 1200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DecapiCone</td>
			<td>&#160;Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>DC-M200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation

O objetivo deste artigo é introduzir métodos de preparação e caracterização de nanopartículas (NPs) de nanopartículas de alta densidade, lipoproteínas (NPs) carregadas com fator de crescimento nervoso (NGF). As HDLs são NPs endógenas e foram exploradas como veículos para a administração de agentes terapêuticos. Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. No entanto, eles são geralmente complicados, demorados e difíceis para a escala industrial up. Neste estudo, a homogeneização em uma etapa foi utilizada para misturar os excipientes e formar o protótipo NPs. O NGF é uma proteína solúvel em água de 26 kDa. Para facilitar a encapsulação de NGF no ambiente lipídico de NPs que imitam HDL, utilizou-se protamina USP para formar um complexo de pares de iões com NGF para neutralizar as cargas na superfície de NGF. O NGF / complexo de protamina foi então introduzido no protótipo NPs. A apolipoproteína AI foi finalmente revestida na superfície dos NPs. NGF HDL imitando NPs mostraram propriedades preferíveis em termosS de tamanho de partícula, distribuição de tamanho, eficiência de aprisionamento, liberação in vitro , bioatividade e biodistribuição. Com o cuidadoso desenho e exploração da homogeneização em NPs que imitam HDL, o procedimento foi grandemente simplificado e as NPs foram feitas escalonáveis. Além disso, foram superados vários desafios, como separar o NGF não carregado dos NPs, realizar estudos confiáveis ​​de liberação in vitro e medir a bioatividade dos NPs.

O esquema de engenharia de NGF NPs revestidos com α-tocoferol, imitando o HDL, preparado por uma estratégia de pares de iões é mostrado na Figura 1 . Para neutralizar as cargas superficiais de NGF, utilizou-se a protamina USP como um agente de pares de iões para formar um complexo com NGF. Para proteger a bioatividade, os protótipos de NPs simuladores de HDL foram projetados, primeiro usando homogeneização; Depois, o complexo NGF / protamina foi encapsulado no pr...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation at JoVE.com

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Utilizou-se homogeneização simples para preparar novas nanopartículas imitando lipoproteínas de alta densidade para encapsular o factor de crescimento nervoso. Desafios, protocolos detalhados para a preparação de nanopartículas, caracterização in vitro e estudos in vivo são descritos neste artigo.

Preparação e caracterização de novas nanopartículas simuladoras de HDL para encapsulação de fatores de crescimento nervoso

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

preparation-characterization-novel-hdl-mimicking-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K visualizações.  University of North Texas Health Science Center.  Utilizou-se homogeneização simples para preparar novas nanopartículas imitando lipoproteínas de alta densidade para encapsular o factor de crescimento nervoso. Desafios, protocolos detalhados para a preparação de nanopartículas, caracterização in vitro e estudos in vivo são descritos neste artigo. 

Vídeo: Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Entrega de genes e Transfection em células pancreáticas humanas Cancer usando Fator de Crescimento Epidérmico Receptor-alvo à base de gelatina Nanovectors Engineered

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Bioengenharia

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

A protocol for the preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug loaded 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG) micelles is described.

Preparação e caracterização de Lipofílica Doxorrubicina micelas Pro-drogas

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Projetar filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento do nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...