脳に届けられたNGFは挑戦的です。ここでは、生体活性タンパク質の安全かつ長期放出を可能にする新しいタイプのキャリアを紹介します。この技術は多孔質のケイ素のキャリアにNGFの簡単で、有効な負荷を可能にする。
それは、室温で、強力な有機溶剤を使用せずに行われます。多孔質シリコンキャリア設計が調整可能であるため、キャリアは長期放出のためのNGF貯留インプラントとして機能することができるが、他の要因および薬物を運ぶためにも変更することができる。エンジニアや化学者にとって、製造プロセスは実行が容易になる場合があります。
生命科学者や臨床医にとって、細胞培養手順は比較的簡単に再現する必要があります。1点5を1点5センチメートルのシリコンウエハーで、十分に特徴付けられた抵抗率を持つシリコンウエハーを、背中の接触としてアルミニウム箔のストリップを使用してポリテトラフルロエタリンエッチングセルに取り付け、Oリングを使用してセルを密封します。この織物は、毎回同様の抵抗値を持つシリコンウェーハを使用するためにレレジスト性を有する。
電気化学的に、250mm平方メートルの一定電流密度で20秒間、アクレウスフッ化水素酸とエタノールの3~1溶液でシリコンサンプルをエッチングする。次に、得られた多孔質シリコンフィルムの表面をエタノールで3回リンスしてから、窒素気流で乾燥する。試料が乾燥すると、エッチングされたての多孔質シリコンサンプルをチューブ炉内で800°Cで周囲空気中で1時間熱的に酸化し、酸化された多孔質シリコン足場を形成する。
サンプルが冷却されたら、ダイシングソーを使用して8ミリメートルのサンプルにカットします。NGFでサンプルをロードするには、各サンプルの上に調製したNGFローディング溶液の52マイクロリットルを分配し、高湿度条件下で覆われた皿の室温で2時間サンプルをインキュベートします。2時間後、サンプルの上に溶液を回収し、NGFローディング溶液と回収後ローディング溶液サンプルをilizaキットの適切な濃度範囲に回収します。
すべてのサンプルが希釈されたら、NGF捕捉抗体の各ウェルに、室温で2時間のインキュベーションを行った96ウェルイリザプレートに、較正曲線サンプルに希釈サンプル100マイクロリットルを加えます。インキュベーションの終わりに、プレートを4回洗浄し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの100マイクロリットルのビオテン化検出抗体を各ウェルに100マイクロリットルを加え、室温で2時間インキュベーションします。4回の洗浄の後、実証したように、アビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシディスの100マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベーションし、続いて洗浄バッファーに4回洗浄します。
最後の洗浄後、各ウェルに100マイクロリットルの基質溶液を加え、室温で25分間の色発生インキュベーションを行います。次にマイクロプレートリーダーを使用して、650ナノメートルに設定された波の長さの補正で405ナノメートルで吸光度を測定し、キャリブレーション曲線に基づいて負荷溶液と収集されたポストローディング溶液の両方でNGF濃度を決定します。In Vitro NGFリリースでは、NGFに装填された酸化された多孔質シリコンキャリアを、ゼロポイントゼロ1モルPBSの2ミリリットルでインキュベートし、ゼロポイント0のボイビン血清アルバマンを1%のボイビン血清アルバマンで補い、摂氏37度で2%のナトリウムアミドを100回転とし、軌道切断の1分間に100回転を行います。
各吸引の後に新鮮なPBSの2ミリリットルでそれを置き換える2日ごとに溶液を収集します。その後、ちょうど実証したように、ilizaによるNGF分析まで、液体窒素中の回収された放出サンプルをマイナス20°Cの貯蔵のために凍結します。分化されたフェオクロモシトーマ12またはPC12を生成するために、細胞培養は、セントリプテーションにより細胞懸濁液を回収し、新鮮な塩基性増殖培地の5ミリリットルに再懸濁液を細胞に回収する。
2回目のsentribugationの後、口蓋を3ミリリットルの基本的な成長培地で再中断し、23ゲージシリンジを使用して細胞を10回吸引して細胞クラスターを分離する。カウント後、分化培地の存在下でコリゲンタイプ1のコートプレート上の第4の細胞/センチメートル平方作業領域に10回シードする。プレートをインキュベーターに入れ。
摂氏37度で24時間後、新鮮なマウスベータNGFまたはNGFが各プレートに多孔質シリコンキャリアを積み込み、プレートをインキュベーターに戻します。細胞生存率を評価するために、37°Cで5時間の代表ポイントで適切な生存率指標溶液の10%を用いて培養をインキュベートし、630ナノメートルに設定された波の長さの補正で490ナノメートルのスペクトルロープ計の吸光度を測定する。NGFに負荷された多孔質シリコンキャリアの存在下でPC 12細胞分化を評価するために、PC12細胞を細胞培養インキュベーターで24時間低コラーゲンコーティングされたプレートに播種し、以前に得られたIn Vitro放出サンプルを適切な実験井戸に導入する。
24時間のインキュベーションの後、光顕微鏡で細胞を画像化し、各ウェルにアルクロヌライトを含む細胞の数を手動で数えます。分化したPC12細胞の形態解析では、NGFで処理してから3日後まで培養細胞の位相画像を取得し、ニューロンJ.8ビット形式に画像ファイルを変換し、画像スケールバーを使用してピクセル対マイクロメートル比を測定する。分析と尺度の設定を使用して、尺度を設定し、各ニューライトの長さを測定します。
次に、分岐点の数と各細胞ソーマから発生する小数を手動でカウントします。得られた酸化された多孔質シリコン膜の高分解能走査電子顕微鏡画像が示される。フィルムのトップビュー顕微鏡写真は直径約40ナノメートルの細孔を持つその非常に多孔質な性質を明らかにする。
切断されたフィルムの断面顕微鏡写真は、円筒状の細孔を相互接続することを特徴とする2点9マイクロメートルの多孔質層厚さを明らかにする。バースト効果のないNGFの持続的な放出は、リリース期間の後半にはるかに遅いリリース速度と比較して、最初の週の間に速いNGFリリースで1ヶ月間達成される。NGFを搭載した多孔質シリコンキャリアによる処理は、PC12細胞培養における特徴的な分岐ニューロンネットワークにおける神経突起の形成を誘導する。
なお、26日後でさえ、放出されたNGFは、多孔質宿主内でNGF封入が約1ヶ月間タンパク質の生物学的活性を維持することを示す50%以上の細胞分化を誘導する。NGFが1日目および3日目に多孔質シリコン処理細胞集団を処理した形態測定解析は、NGF負荷多孔質シリコンで処理されたPC12細胞が、試験された3つのパラメータすべてについて制御された処理培養物で観察されたものと同様の形態値を示すことを明らかにした。以下の十分に達成し、提示されたステップは、神経細胞の生存と分化を維持することができる有利なNGF送達システムを提供します。
我々は現在、正常な保護効果を研究し、アルツハイマー病などの変性疾患を知るために、脳内のインプラントを長期間放出するNGF多孔質シリコンキャリアの使用を調査している。この手順に従って、NGFが多孔質シリコンキャリアを装填したドーサル木材壊疽細胞の正常な増殖に及ぼす影響も検討できる。多孔質シリコンは、幅広い用途に利用できる有望なナノ材料です。
ここで提示されたもの以外は、生物学的または化学的センサー、診断、およびイメージングを含む。多孔質シリコンキャリアの潜在的な毒性を排除するには、セルラインに向かって、耐久性エッセイを実行し、多孔質シリコンサンプルを殺菌してください。
