Name: preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation
Uploaded: 2017-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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この研究は、Dong、X.に対するNIH R03 NS087322-01によって支持された。

注：すべての手順に含まれている動物試験は、ノーステキサス保健科学センターの施設動物実験および使用委員会の承認を受けています。 1.NGF HDL模倣ナノ粒子の調製<ol><li>賦形剤、ホスファチジルコリン（PC）、スフィンゴミエリン（SM）、ホスファチジルセリン（PS）、オレイン酸コレステリル（CO）およびD-α-トコフェリルポリエチレングリコールサクシネート（TPGS）をエタノールに溶解して1mg / mLの原液を調製する。 注：ストック溶液を等分し、-20℃で保存した。オレイン酸コレステリルは暗いボトルに貯蔵した。 PC、SM、PS、およびCOストック溶液は、それぞれ-20℃で6,13,12および12ヶ月間安定であった。 TPGS溶液は、-20℃で少なくとも12ヶ月間安定であった。 </li><li> NGF（水中1mg / mL）10μLをプロタミンUSP（水中1mg / mL）10μLと1.5mLマイクロ遠心チューブで混合し、室温で10分間放置する複合体を形成する。 注：NGFおよびプロタミン原液を等分し、-20℃で保存した。繰返し凍結および解凍はNGFストックには推奨されません。 </li><li>ガラスバイアルに、59μLのPC、11μLのSM、4μLのPS、15μLのCO、および45μLのTPGSをガラスバイアルに加える。エタノールを穏やかな窒素気流下で約5分間混合し、蒸発させる。すべての賦形剤は、ガラスバイアルの底部に油状の薄いフィルムを形成すべきである。 </li><li>バイアルに1 mLの超純水（1型）を加え、室温で5分間9,500 rpm（8,600 xg）でホモジナイズしてプロトタイプNPを形成する。 </li><li> ステップ1.2で調製した複合体をプロトタイプNPに添加し、ガラスバイアル中の小さな撹拌棒を用いて撹拌しながら37℃で30分間インキュベートする。 <ol><li>室温でさらに30分間撹拌することによりNPを冷却する。これが冷えた後、106μLのApo AI（1.49mg / mL）を添加し、室温で一晩撹拌して最終NGF HDLを模倣したNP。 </li></ol></li></ol> 2.NGF HDL模倣ナノ粒子のキャラクタリゼーション<ol><li> 製造元の指示に従って、粒子分析器（材料表を参照）を使用して、粒子サイズおよびゼータ電位を測定する。 </li><li>架橋アガロースゲルろ過クロマトグラフィーカラムを使用して、非負荷NGFをNGF HDL模倣NPから分離し、NGFの封入効率を決定する。 <ol><li>カラム調製のために、セファロース4B-CL懸濁液15mLを50mLビーカーに移す。ガラス棒を用いてビーズ懸濁液を撹拌し、カラム（30cm長さ×直径1cm、ガラスフリットを底にして）にいくらかを注ぐ。穏やかにカラムをタップして気泡を取り除く。溶媒を排出させ、ビーズを数分間静置する。 </li><li>残りのサスペンションを追加し続けます。カラムの内壁をすすいでビーズを洗浄します。溶媒レベルがわずかにaになるまで溶媒を排出する固定相の上部に位置する。 1×リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、137mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na 2 HPO 4 、および2mM KH 2 PO 4を含有するPBS）20mLでカラムを洗浄し、調整する。 </li><li>無負荷NGFを含む画分を決定するために、200μLのNGF溶液（10μg/ mL）をゲル濾過カラム（長さ25cm×直径1cm）に負荷し、1×PBSで溶出する。 </li><li>合計12の画分（各画分につき1mL）を集め、NGFについてのサンドイッチELISAキットを用いて各画分中のNGFの濃度を測定する。 </li><li>サンドイッチELISAキットを使用して、画分6〜10からNGFを検出する。カラムに負荷されていないNGFのクロマトグラムを取得する。 20mLのPBSでカラムを洗浄する。 </li><li> NGF HDL模倣NPを含有する画分を決定するために、200μLのNPをカラムに負荷し、1×PBSで溶出する。合計12の画分（各画分につき1mL）を集め、各画分の粒子の強度を測定する。粒度分析器を呼び出す。画分2から4までのNGF NPを検出する。 注：強度は、粒子分析装置によって測定されるパラメータであり、試験溶液中にいくつのナノ粒子が存在し得るかを示す。溶液中に存在するNPが多いほど強度は高くなります。このアプローチによって、本発明者らは、カラムが無負荷NGFからNGF NPを分離できることを確認することができる。 </li><li> NGFの捕捉効率を測定するために、200μLのNGF HDL模倣NPをカラムに負荷し、1×PBSで溶出する。合計12の画分を集める（各画分につき1 mL）。 </li><li>サンドイッチELISAキットを使用して、画分6〜10から無負荷NGF濃度を測定する。 </li><li>画分6〜10から測定したNGF量を無負荷NGFとして加え、次の式を用いてNGFの捕捉効率を計算する。 ％EE =（1-無負荷NGF / NPに添加された総NGF）×100％式（1） </li></ol></li></ol> 3.NGF HDLのインビトロ放出- ナノ粒子を真似る<ol><li> NGF（水中10μg/ mL; n = 4）およびNGF HDL-模倣NP（10μg/ mL; n = 4）を並行して調べる。 </li><li>製造者の指示に従って、8つの透析チューブ（分子量カットオフ：300kDa）を前処理する。 </li><li>放出培地としてPBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）を調製する。 30 mLの放出培地を50 mLの遠心チューブに加え、振とう速度が135 rpmのシェーカーで37℃まで温めます。交換のためにシェーカーに放出培地をさらに50mL入れる。 </li><li> 400μLの放出培地を透析チューブに加え、迅速に200μLの試験サンプルを加えて、透析に十分な容量を作ります。 </li><li>チューブを閉じ、迅速に透析チューブをリリース培地（遠心チューブ）に入れます。即座に、時間0のサンプルとして、外部透析チューブから放出培地100μLを抜き取る。後で分析するためにサンプルを直ちに-20℃に置く。新鮮な100μLを加える遠心分離管に培地をリースして取り出されたサンプルを交換する。タイマーを開始します。 </li><li> 1,2,4,6,8,24,48および72時間で、100μLの放出培地を回収し、100μLの新鮮な培地と交換する。後で分析するために取り出したサンプルを直ちに-20℃に置く。 </li><li> 72時間後、すべてのサンプルを-20℃から取り出し、室温で解凍する。サンドイッチELISAキットを用いて放出サンプルのNGF濃度を測定する。 </li></ol> 4. NGF HDL模倣ナノ粒子の生理活性（神経突起伸長試験） <ol><li> 10％熱不活性化ウマ血清、5％ウシ胎児血清、100μg/ mLストレプトマイシンおよび100単位/ mLペニシリンを補充したRPMI-1640培地中の培養PC12細胞。加湿インキュベーター内で37℃、5％CO 2で細胞を維持する。 </li><li>細胞が約70〜80％コンフルエンスに達すると、培養培地を除去し、細胞を1×PBS（10cm 2あたり約2mL）で洗浄し、2つの培養表面積）。洗浄液を除去する。 0.25％トリプシン-EDTA溶液（0.25％トリプシンおよび1mM EDTA;培養表面積10cm 2あたり0.5mL）をフラスコに添加し、37℃でインキュベートしてほとんどの細胞が剥がれるまで細胞をトリプシン処理します。 </li><li> 2倍量の培地を添加し、5分間180xgでスピンダウンする。上清を除去し、5mLの培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞クラスターを破壊するために、22G、1/2インチの針を通して細胞をろ過する。 </li><li>新しい細胞培養フラスコに1：3の比率で細胞を分割する。一晩インキュベートした後、結合していないPC12細胞を除去する。付着した細胞をさらなる成長のために残す。 </li><li>この手順を3回繰り返すことにより、強い接着性を有するPC12の継代培養を選択する。 6ウェルプレートに800μL/ウェルのラット尾コラーゲンI型（100μg/ mL）を予めコートする。 </li><li>ステップ4.2で説明したように、選択したPC12細胞をトリプシン処理し、22 G、1/2インチ針で細胞クラスターを破壊する。血球計数器で細胞を数える。細胞をプレートに付着させるために、ステップ4.5のプレコートされた6ウェルプレートに10,000細胞/ウェルの密度で細胞を一晩シードする。 </li><li> 0.5,1,5,10,50、および100 ng / mLの濃度を調製するために、培地（手順4.1に記載）で遊離NGF（10μg/ mL）およびNGF HDL模倣NP（10μg/ mL）を希釈する。各ウェルから2mLの培地を除去し、2mLの希釈した遊離NGFまたはNGF HDL模倣NPと交換する。 4日間培養する。 </li><li> 4日目に、対応する処置を含む新鮮な培地（ステップ4.1に記載）に培地を交換し、さらに3日間処置を続ける。 </li><li> 7日目に、倒立光学顕微鏡で細胞を視覚化し、各ウェルを10倍の倍率でランダムスポットで画像化する。 </li></ol> 5.NGF HDL模倣ナノ粒子の生体内分布<ol><li>大人のBALB / cマウス（雄、25〜30 g）を用いてNGF NPの組織分布を推定する。グループあたり3匹のマウスからなる3つのグループに無作為にマウスを分ける。マウスを拘束し、尾部をエタノールで拭いて血管拡張および静脈の可視性を促進するために、円錐形のプラスチック拘束具（ 例えば、デカプリコーン）を使用する。 </li><li> 100μLの生理食塩水、遊離NGF、またはNGF HDL模倣NPをマウスの各群（3群）に尾静脈を通して40μg/ kgのNGFの用量で注射する。 1 mLシリンジに付属の30 1/2 G針を使用してください。 </li><li> 注射30分後に、3％吸入イソフルラン（2L /分の流速で酸素中）を用いてマウスを麻酔する。麻酔の深さを決定するために尾とつまみを実行します。心臓穿刺によって血液を採取する。 <ol><li>心臓から約1mLの血液を抜き取る。頸部脱臼によって各マウスを安楽死させる。 </li></ol></li><li>背臥位にマウス屠体を置きます。外科用はさみを使用して腹部を開き、脂肪と腸を別に移動する肝臓、脾臓、および腎臓を暴露するために綿棒を使用する。これらの組織を採取し、血液をきれいにするために1×PBSですすいでください。 </li><li>直ちに3,400 xgと4℃で5分間血液サンプルを遠心分離して血漿を得る。分析まで血漿および組織を-80℃で保存する。 </li><li>組織サンプルを分析するには、サンプルを-80℃から4℃に移動させ、10倍量の抽出緩衝液（0.05M酢酸ナトリウム、1.0M塩化ナトリウム、1％トリトンX-100、 1％BSA、0.2mMフェニルメタンスルホニルフルオライド、および0.2mM塩化ベンゼトニウム）。 10,000 rpmおよび4℃で5分間ホモジナイズする。 </li><li>手順5.3および5.4に記載されているように、未処置の2匹のマウスを犠牲にして、空の血漿および組織を収集する。空の血漿またはブランク組織ホモジェネートを用いてNGF標準溶液を調製する。 </li><li>上記のように、サンドイッチELISAキットを使用して、血漿および組織ホモジェネート中のNGFの濃度を決定する。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

この研究では、NGFカプセル化のためにHDL模倣NPを調製する簡単な方法を実証する。様々なNP送達系がタンパク質を送達するために研究されている。現在、多くのNP調製物は、透析、溶媒沈殿、および膜水和を含む。これらのプロセスは一般に複雑であり、スケールアップには困難が伴う。このNP発達の間、脂質は容器のガラス壁に強い接着性を有し、薄膜を水​​和させ、賦形剤を効率的に混?...

タンパク質、ペプチド、および核酸などの高分子は有望な投薬として出現しており、過去数十年間でかなりの注目を集めています1,2 。彼らの高い有効性と特定の行動様式のために、彼らは癌、免疫疾患、HIV、および関連する病気の治療のための大きな治療可能性を示す3,4。しかしながら、それらの大きな分子サイズ、三次元構造、表面電荷、および親水性のような物理化学的性質は、これらの高分子のin vivo送達を非常に困難にする。これは彼らの臨床的使用を著しく妨げる4 。マイクロ粒子、ポリマーナノ粒子（NP）、リポソーム、および脂質NPなどの薬物送達システムにおける最近の進歩は、これらの課題を克服し、巨大分子のin vivo送達を有意に改善した。ホこれらの送達貨物に関するいくつかの欠点が明らかにされており、薬物負荷能力が低く、捕捉効率が低く、半減期が短く、生物活性が低下し、望ましくない副作用があることが明らかにされている5,6,7,8。有効なキャリアシステムは依然として研究の関心領域である。さらに、薬物を含むNPを特徴付ける分析方法の開発は、小分子よりも巨大分子にとってより困難である。 高密度リポタンパク質（HDL）は、アポリポタンパク質およびリン脂質単分子膜で被覆された脂質コアからなる天然NPである。内在性HDLは、SR-BI、ABCAI、およびABCG1などの標的受容体とのその相互作用を介して、脂質、タンパク質および核酸の輸送において重要な役割を果たす。それは、異なる治療剤の送達のための媒体として探求されている9、 10,11,12 。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。透析は一般的なアプローチです。この方法において、NPは、コール酸ナトリウム溶液を用いて脂質膜を水和させることによって形成される。次に、塩を3つの緩衝液で2日間透析することにより除去する（ 13） 。超音波処理法は、加熱条件下で脂質混合物を60分間超音波処理することによりNPを製造する。 NPはゲルクロマトグラフィーによりさらに精製される14 。マイクロフルイディクスは、マイクロ流体デバイスを介してNPを生成し、マイクロ流体デバイスは、リン脂質およびアポリポタンパク質AI（Apo AI）溶液を、集束パターンで微小渦を生成することによって混合する。明らかに、これらの方法は、工業規模でのスケールアップには時間がかかり、厳しく、困難な場合があります。 この記事では、神経のための新規なHDL模倣NPの調製および特徴付けを紹介する成長因子（NGF）カプセル化。 NGFは、2つの13.6kDaポリペプチドモノマーを含むジスルフィド結合ポリペプチドホモダイマーである。ホモジナイゼーションによってNPを調製し、続いてNGFをNPにカプセル化する新規手順を開発した。 NGF HDL模倣NPは、粒子サイズ、サイズ分布、ゼータ電位、およびインビトロ放出に関して特徴付けられた 。それらの生物活性を、PC12細胞における神経突起伸長について評価した。マウスの静脈内注射後のNGF HDL模倣NPの体内分布を遊離NGFの体内分布と比較した。

<table><tbody><tr><td>Recombinant Human Beta-NGF</td><td>Creative Biomart</td><td>NGF-05H</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine (PC)</td><td>Avanti</td><td>131601P</td><td>95%, Egg, Chicken</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (SM)</td><td>Avanti</td><td>860062P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Phosphatidylserine (PS)</td><td>Avanti</td><td>840032P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Cholesteryl oleate (CO)</td><td>Sigma</td><td>C9253</td><td></td></tr><tr><td>D-&amp;alpha;-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)</td><td>BASF</td><td>9002-96-4</td><td>Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate</td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>meets USP testing specifications</td></tr><tr><td>Apolipoprotein A1, Human plasma</td><td>Athens Research &amp;amp; Technology</td><td>16-16-120101</td><td>1 mg in 671 &amp;micro;L 10 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Sepharose 4B-CL</td><td>Sigma</td><td>CL4B200</td><td>Cross-linked agarose,&amp;nbsp; gel filtration chromatography column filling material</td></tr><tr><td>Sandwich ELISA Kit for NGF</td><td>R&amp;amp;D system</td><td>DY008</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30096.02</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>PC12 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>31414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzethonium chloride</td><td>Sigma</td><td>B8879</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Tekmar</td><td>T 25-S1</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano HC particle analyzer</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Delsa Nano HC</td><td></td></tr><tr><td>Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>G235036</td><td>Molecule Cutoff 300 kDa</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendoff</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>PT 1200C</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCone</td><td>&amp;nbsp;Braintree Scientific Inc.</td><td>DC-M200</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation

この記事の目的は、神経成長因子（NGF）負荷、高密度、リポタンパク質（HDL）模倣性ナノ粒子（NP）の調製および特徴付け方法を紹介することである。 HDLは内因性NPであり、治療剤の送達のための媒体として研究されている。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。しかしながら、それらは一般に複雑で時間がかかり、工業規模では困難である。この研究では、一段階ホモジナイゼーションを用いて賦形剤を混合し、プロトタイプNPを形成した。 NGFは26kDaの水溶性タンパク質である。 HDL模倣NPの脂質環境へのNGFの封入を容易にするために、プロタミンUSPを用いてNGFとイオン対複合体を形成し、NGF表面の電荷を中和した。次いで、NGF /プロタミン複合体をプロトタイプNPに導入した。アポリポタンパク質AIを最終的にNPの表面上に被覆した。 NGF HDL模倣NPは、長期間に好ましい特性を示した粒度分布、捕捉効率、 インビトロ放出、生物活性、および生体内分布が含まれる。 HDL模倣NPにおけるホモジナイゼーションの注意深い設計と探索により、手順は大幅に単純化され、NPはスケーラブルに作られました。さらに、NPから無負荷NGFを分離し、 in vitro放出試験を確実に行い、NPの生物活性を測定するなどの様々な課題が克服された。

イオン対戦略によって調製されたHDL模倣、α-トコフェロール被覆NGF NPの工学的スキームを図1に示す 。 NGFの表面電荷を中和するために、プロタミンUSPをイオン対剤として用いてNGFと複合体を形成させた。生物活性を保護するために、プロトタイプのHDL模倣NPを、最初にホモジナイゼーションを用いて操作した。次いで、NGF /プロタミン複合体をプロトタイ?...

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Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

単純なホモジナイゼーションを用いて、神経成長因子を封入するための新規な高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子を調製した。課題、ナノ粒子の調製、 インビトロの特性評価、およびインビボ研究の詳細なプロトコールがこの記事で説明されています。

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K ビュー.  University of North Texas Health Science Center. 単純なホモジナイゼーションを用いて、神経成長因子を封入するための新規な高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子を調製した。課題、ナノ粒子の調製、 インビトロの特性評価、およびインビボ研究の詳細なプロトコールがこの記事で説明されています。 

ビデオ: Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

SDF-1α-キトサン硫酸デキストランナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

化学

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

生物工学

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

生化学

<meta charset="utf8"></head><body>マウス神経膠芽腫における画像誘導治療送達のための酸化鉄ナノ粒子

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:膠芽腫治療のための酸化鉄ナノ粒子による革新的ながん治療

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

がん研究

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

要約

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SDF-1α-キトサン硫酸デキストランナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

神経成長因子のキャリアとしてポーラスシリコン膜の設計

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

神経成長因子カプセル化のための新規HDL模倣ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

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繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

神経成長因子のキャリアとしてポーラスシリコン膜の設計