Name: histological analyses of acute alcoholic liver injury in zebrafish
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
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著者はZebrafish International Resource CenterのKaty Murray博士に感謝したいと思います。 CCHMCのStacey Huppert博士とKari Huppert博士は、プロトコルに関する有益な助言を得た。魚のケアのためのCCHMC獣医サービス。この研究はNIH助成金R00AA020514とCCHMCの小児ゲノミクスセンター（CY）の研究助成金によって支えられました。また、シンシナティの消化器疾患研究コアセンターのNIH助成金P30 DK078392（統合形態学コア）も一部支持した。

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるその後の組織病理学的分析の詳細な手順を記載している。急性エタノール処理は、ゼブラフィッシュ肝臓がアルコール代謝酵素を発現し始める段階であるため、受精後96時間以内に行わなければならない。 2％エタノールは、幼虫が13,14を許容できる最大用量である。エタノール処理された幼虫は、8時間の処理によって肝脂肪症を示し始め、脂肪症を発症する幼虫の割合は、24時間の連続治療14まで上昇し続ける14 。ゼブラフィッシュの幼虫は、120 hpfまで卵黄のみから栄養素を吸収します。したがって、120 hpfを超えるエタノール処理は推奨されていません。なぜなら、断食は脂肪症14にも寄与することができるからです。他のラボで公開されたプロトコルと比較現在の議定書で主に行われた変更は、エタノール処理が14時間の光/ 10時間の暗サイクルを有する魚施設で行われることである。これは、インキュベーター中で暗所で処置を行った場合に見られるものよりも、より一貫した強力な脂肪族反応を生じる。これは、ゼブラフィッシュ肝臓の脂質代謝遺伝子が、明/暗サイクル25に応答して毎日のリズム発現を示すという事実に関連している可能性がある25 。 ALDは慢性疾患であり、何年ものアルコール乱用があります。現在のエタノール処理プロトコールの重要な制限は、それが肝臓へのアルコールの急性効果を誘発するだけであるということである。このような高いエタノール濃度で48時間以上処理すると、死亡率が高くなり、慢性肝障害の研究が妨げられます。最近の研究では、成人ゼブラフィッシュを1％エタノールで3回まで連続処理した脂肪症、脂肪性肝炎、および線維化を引き起こした12 。将来有望な方向の1つは、急性エタノール治療プロトコールを用いて潜在的なALDモジュレーターを同定し、次に慢性損傷モデルにおけるその効果を検証することである。 急性エタノール処理によって誘導される肝細胞障害を評価するためにH＆E染色を行う。ゼブラフィッシュにおける蛍光イメージングの容易さのために、H＆E染色は、ゼブラフィッシュの肝臓組織学において日常的に使用されておらず、その手順はそれほど十分に記載されていない。現在のプロトコールは、幼虫肝臓におけるH＆E染色の段階的記述を提供する。正しい固定剤を選択することは、H＆E染色のための最初の最も重要なステップです。組織ホルモンには10％の緩衝ホルマリンと4％のPFAが一般的に使用されますが、それらは両方とも組織の収縮を引き起こし、肝臓の部分は切片から脱落する。 10％ホルマリン固定は、肝臓の細胞質の損失をもたらすocytes。 4％PFA固定は、肝細胞間の人為的なギャップを生じる。エオシン染色は、いずれかの固定剤で固定された肝臓におけるヘマトキシリン染色よりもはるかに弱いようである。酸ベースのDietrich固定剤は、ゼブラフィッシュ肝臓のH＆E染色に適しています。細胞の細部を保存し、収縮を最小限に抑えるからです。また、肝臓などの脂肪組織にホルマリンやPFAよりも速く浸透しているようです。ヘマトキシリンとエオシンによる染色は、よりバランスがとれています。 Dietrichの固定剤の1つの警告は、それがゲノムDNA抽出に適合しないことである。試行実験では、10％ホルマリン、4％PFAまたはDietrich固定液26を用いて固定した幼虫からゲノムDNAを抽出した。幼虫を50μLの50mM NaOH中、95℃で20分間インキュベートし、次いで4℃に冷却した。次いで、1M Tris-HCl（pH8.0）5μLを添加して、塩基性溶液を中和した。簡単な遠心分離の後、上清wPCRで使用される。同じPCRプライマーおよびPCRプログラムを用いて、ホルマリンおよびPFA固定幼虫の両方からのゲノムDNAは予測サイズのPCR産物を生じたが、Dietrich固定固定幼虫のゲノムDNAはPCR産物を産生しなかった。 パラフィン切片および凍結切片の両方でH＆E染色を行うことができる。しかし、パラフィン切片は、凍結切片よりも以下の利点があります。1）パラフィン切片は室温で無期限に保存できますが、凍結切片は-80°Cで1年まで保存できます。 2）凍結切片の場合、細胞内の氷結晶の形成は、細胞の形態学および細胞内の詳細を混乱させる可能性がある。さらに、凍結切片は、しばしば、パラフィン切片よりも厚い。これは、パラフィン切片から産生される組織形態と比較して組織形態の画像が貧弱になる可能性がある。 肝臓組織のパラフィンブロックを調製する場合、現在のプロトコール幼虫をアガロースに包埋する。幼虫は、体の左側が下向きになり、型の底に平らに横たわって横方向に配置される。これにより、肝臓の方向を確実に一致させることができ、セクションを連続して切断すると、肝臓の等価な領域を魚と魚27と比較することができます27 。成功したH＆E染色を保証するもう1つの重要なステップは、発色です。所望の色強度に達するまで頻繁に染色をチェックすることが重要である。 H＆E染色は、肝臓損傷の予備的評価を得るために使用されるべきである。エタノール処理された幼虫は、肝細胞における丸い液滴の過剰な​​沈着を示し、脂肪症を示唆する13,14,18。これらの液滴が実際に脂質であることを確認するためには、オイルレッドOおよびナイルレッドなどの脂質染料で標識することが必要である。肝臓の血管治療された動物のelsは膨張して腫れて見える。正弦波の超微細構造変化を調べるために、走査型電子顕微鏡法と透過型電子顕微鏡法を実施すべきである。以前に、細胞外マトリックスタンパク質沈着は、免疫蛍光18によって検出されたように、エタノール処理されたゼブラフィッシュ肝臓において増加することが報告されている18 。しかし、フィブリノゲン遺伝子の発現レベルが処理された魚18において穏やかに増加するだけであるので、H＆Eは、このような少量の細胞外マトリックスタンパク質を検出するほどには敏感でないかもしれない。慢性的に損傷した成体ゼブラフィッシュ肝でも同じ固定液法および染色法を試験し、線維症の検出には十分であった（陰、未発表データ）。 現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫における肝臓組織学の検査に合わせて調整されていますが、ゼブラフィッシュの研究コミュニティには、サムeプロトコールは、他の組織および成体ゼブラフィッシュに適用することができる。

アルコール過多によって引き起こされるアルコール性肝疾患（Alcoholic Liver Disease：ALD）は、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因である。米国では、肝疾患の死亡のほぼ半分がアルコール1を含み、ALDは3回の肝臓移植2のほぼ1つを担っている2 。 ALDには広いスペクトルがあります。肝細胞における過剰脂質蓄積を特徴とする脂肪症は、飲酒の初期段階で起こり、アルコール使用の停止時に可逆的である。遺伝的および環境的要因および継続的アルコール摂取の影響下で、肝臓脂肪症はアルコール性肝炎および結局は肝硬変に進行することがある3 。げっ歯類のALDモデルを用いた研究では、この疾患に対する十分な洞察が得られているが、限界がある（文献3 ）。アルコール飼料の経口給餌は、げっ歯類4 、5 。炎症および線維化の発症には、侵襲的かつ技術的に挑戦的な第2の傷害6,7または慢性胃内注入が必要である8,9 。また、腸骨ジストロフィーは、慢性および急性のアルコール処置10,11,12,13,14,15の両方に応答して肝損傷を発症する。特に、幼虫ゼブラフィッシュは、急性アルコール性肝臓損傷10,11,13,15を研究するための魅力的な補完的モデル生物である。ゼブラフィッシュの肝臓は機能的であり、エタノール代謝の主要な酵素を4日で産生するゼブラフィッシュ幼虫13,15 で肝臓脂肪症および線維形成反応を誘発するには、エタノールを2％エタノールに24時間暴露すれば十分です。 2％エタノールで24時間処理すると、ゼブラフィッシュの幼虫13の組織エタノール濃度が80mMになることが報告されている13 。他の者は、幼虫がこの濃度を許容し、処置動物に見られる肝表現型がエタノール暴露に特異的であることを示した11,13,15,18。しかしながら、ヒトでは80mMがほぼ致命的であるため、エタノール処理されたゼブラフィッシュの肝組織像を評価し、人間との生理学的関連性を明らかにする。 ゼブラフィッシュの幼虫の急速な外部発生および半透明は、肝臓内のアルコールの作用をリアルタイムおよび固定サンプルで特徴付けることを可能にする。細胞型特異的蛍光トランスジェニック系統の利用可能性と共焦点顕微鏡法の最近の進歩により、異なる肝細胞型が急性エタノール処理11,15に応答して形態および挙動をどのように変化させるかの研究が容易になる。しかし、蛍光トランスジェニックゼブラフィッシュの共焦点イメージングは​​、肝臓組織学を研究する場合、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を完全に代用することはできない。トランスジェニックゼブラフィッシュを用いて全ての肝臓細胞型を同時にマーキングするには、個々のトランスジェニック系統を作製する必要があり、それぞれが固有のフルオロフォアを有する肝臓細胞型を標識する。異なるトランスジェニック背景を同じ魚に導入するには、ブリーディングが必要ですg世代を必要とし、時間とコストがかかる。細胞外マトリックス成分を検出するためには、さらなる免疫蛍光染色が必要である。一方、H＆E染色は、同時に全ての肝臓細胞型および細胞外マトリックス成分を標識し、肝臓の概要を提供する。さらに、肝細胞死、脂肪症および線維症などの肝疾患のいくつかの組織病理学的特徴を容易に明らかにする。 H＆Eは哺乳動物の肝臓組織学におけるルーチンの染色であるが、ゼブラフィッシュの肝臓研究では一般的に使用されておらず、プロトコールはあまり確立されていない。 この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるフォローアップ組織学的分析のためのプロトコールを記載する。 H＆E染色プロトコールは、肝臓の発達および機能に関するすべての研究に使用することができる。さらに、パラフィン切片は、免疫組織化学ならびに他の特別なスタチンのために使用することができるTrichrome stain、reticulin stain などの肝臓の病理学的特徴

<table><tbody><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>E &amp;amp; K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Newcomer Supply</td><td>10010A</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum jar rack holder</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological petri dishes with lid</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy pads</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>Charged slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>Clear mounting media</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Can be substituted with other clear mounting media</td></tr><tr><td>Commercial sea salts</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Disposable microtome blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>Enclosed tissue processor</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Phloxine stain set</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>A suspected carcinogen; irritant</td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>A suspected carcinogen; irritant</td></tr><tr><td>Graduated media bottle</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Poly Scientific R&amp;amp;D Corp.</td><td>s212</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Histology molds</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate/Stirrer</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>Inverted compound microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Newcomer Supply</td><td>12094E</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutating mixer</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>A suspected carcinogen; irritant</td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pump (10 mL)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate, monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Slide Staining Kit</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>S318-500</td><td>Very hazardous</td></tr><tr><td>Sodium phosphate, dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel strainer (5 inch diameter)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>Tissue cassettes</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding center</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>Tissue wipers, 1-Ply</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Tris base, primary standard and buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Irritant</td></tr></tbody></table>

histological analyses of acute alcoholic liver injury in zebrafish

アルコール性肝疾患（ALD）は、急性または慢性のアルコール乱用による肝臓の損傷を指す。これは、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因の1つであり、米国では200万人を超える人々に影響を与える。アルコール誘発肝障害の根底にある細胞および分子メカニズムのより良い理解は、ALDの有効な治療法を開発するために重要である。ゼブラフィッシュの幼虫は、2％エタノールへのわずか24時間の曝露後に肝脂肪症および線維形成を示し、急性アルコール性肝障害の研究に有用である。この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理の手順を記述し、それが肝臓血管の脂肪症および腫脹を引き起こすことを示している。ゼブラフィッシュの幼虫肝臓の組織学的分析のために最適化されたヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色の詳細なプロトコールも記載されている。 H＆E染色は、免疫蛍光よりもいくつかのユニークな利点があります。細胞外成分を同時に検出することができ、脂肪症および線維症などの肝障害を容易に検出することができる。毒素およびウイルス誘発肝臓損傷ならびに遺伝性肝疾患のモデリングにおけるゼブラフィッシュの使用が増加していることを考えると、このプロトコールは、これらの研究すべてにおいて実施された組織学的分析の参考となる。

10％緩衝ホルマリンおよび4％パラホルムアルデヒド（PFA）は、組織学的プラクティスに使用される最も一般的な固定剤の2つである。しかし、ゼブラフィッシュの肝臓組織の最適な固定結果は得られません（ 図1および表1 ）。 10％ホルマリンまたは4％PFAによる固定は、しばしば収縮をもたらし、肝臓と周囲組織との間に大きなギャップを生じさせる（ 図1A 、 B ; 図1Bは組織収縮の例を提供する）。肝組織の一部もまた切片から脱落することがある。肝細胞の細胞質はしばしば失われる（ 図1A 、 1B ）。両方の固定剤は、それらが収縮または膨潤し、もはや上皮細胞に特徴的な円柱形態を維持しないので、肝細胞の変形を引き起こし得る。 PFAの固定に関するもう1つの問題は、実際には存在しない肝細胞間には空間があり、組織が骨折しているように見える（ 図1B ）。さらに、これらの2つの固定剤のいずれかを使用すると、肝細胞はヘマトキシリンで良好に染色されるが、エオシンではほとんど染色されない（ 図1A ）。酸ベースのDietrichの固定剤は、ホルマリンとPFA固定剤の問題を克服しています（ 図1C ）。 ヒトALDでは、小滴および大滴の脂肪からなる脂肪症が中心静脈の近くで最も顕著であり、重症度22の増加とともに門脈の三枝に向かって外側に伸びる。ゼブラフィッシュでは、96-120hpfの2％エタノールで処理すると、肝脂肪症が誘発され、これは肝細胞中に丸い液滴が過剰に沈着することによって示唆される（ 図2B 、矢印）。しかし、液滴は出現しないヒトALDに見られるのと同様の分布パターンであり、ゼブラフィッシュ肝臓23における門脈および中央静脈の明確な区別がないためである。エタノール処理した幼生肝臓の肝臓の血管は、対照の肝臓の肝臓に比べて膨潤している（ 図2B 、星印）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55630/55630fig1.jpg" /> 図1 ： 120hpfで異なるフィラメントで固定されたゼブラフィッシュ幼虫の肝臓におけるH＆E染色の比較。 （ A ）RT O / Nでの10％ホルマリン; （ B ）4％CO / Nで4％PFA; （ C ）室温で24時間、Dietrich固定液。 10％ホルマリンでは、肝細胞はしばしば細胞質（A）を失う。組織はエオシンで適切に染色されず、紫色に見える。フィクラ後4％PFAを用いた場合、肝細胞間にギャップが見られる（B）。 4％PFAは肝臓組織を収縮させるので、肝臓と周囲組織との間に大きな隙間があるように見える。 Bの点線は、周囲の組織の境界を示す。 Dietrichの固定剤は、3つの中で最適な結果を提供します（C）。スケールバー=20μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55630/55630fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55630/55630fig2.jpg" /> 図2 ： 急性エタノール治療は、ゼブラフィッシュの幼虫の肝臓における肝臓の角化症および血管の腫脹を引き起こす。 （ A ）対照、未処理、WT幼虫における肝臓のH＆E染色。 （ B ）2％エタで処置したワイル型幼虫における肝臓のH＆E染色nolは96~120hpfである。両方の動物を120 hpfでDietrich固定液で固定した。 （B）の矢印は、丸い液滴の過剰沈着を伴う肝細胞を指す。アスタリスクは、腫れた肝臓の血管に印を付ける。スケールバー=20μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55630/55630fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 10％ホルマリン </td><td> 4％PFA </td><td> Dietrichの固定剤 </td></tr><tr><td>定着条件</td><td> RTで少なくとも24時間</td><td> RTで3時間、または4℃でO / N </td><td> RTで少なくとも24時間</td></tr><tr><td>サンプル保存後の固定</td><td>無期限にRT </td><td> 4℃で2週間まで</td><td> RTで2ヶ月まで</td></tr><tr><td> CompatibゲノムDNA抽出による能力</td><td>はい</td><td>はい</td><td>いいえ</td></tr><tr><td>収縮</td><td>はい</td><td>はい</td><td>最小</td></tr><tr><td>細胞の歪み</td><td>はい</td><td>はい</td><td>最小</td></tr><tr><td>携帯電話の詳細の損失</td><td>はい</td><td>適度</td><td>最小</td></tr><tr><td>バランスのとれたH＆E染色</td><td>弱いエオシン染色</td><td>弱いエオシン染色</td><td>はい</td></tr><tr><td>免疫組織化学との適合性</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td></tr></tbody></table> 表1： 10％ホルマリン、4％PFA、およびジベレフ肝臓組織学に対するDietrich固定剤の比較。

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Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

このプロトコールは、2％エタノールで24時間処理したゼブラフィッシュ幼虫からの肝臓の組織学的分析を記載する。このような急性エタノール処理は、肝臓脂肪症および肝臓血管系の腫脹をもたらす。

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.2K ビュー.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. このプロトコールは、2％エタノールで24時間処理したゼブラフィッシュ幼虫からの肝臓の組織学的分析を記載する。このような急性エタノール処理は、肝臓脂肪症および肝臓血管系の腫脹をもたらす。 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

発生生物学

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

医学

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

がん研究

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies and neurological impairments. With a complex pathology, FASD affects approximately 1 in 100 children born in the United States each year. Due to the highly variable nature of FASD, animal models have proven critical in our current mechanistic understanding of ethanol-induced development defects. An increasing number of laboratories has focused on using zebrafish to examine ethanol-induced developmental defects. Zebrafish produce large numbers of externally fertilized, genetically tractable, translucent embryos. This allows researchers to precisely control timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts and quantify the impact of embryonic ethanol exposure through live imaging techniques. This, combined with the high degree of conservation of both genetics and development with humans, has proven zebrafish to be a powerful model in which to study the mechanistic basis of ethanol teratogenicity. However, ethanol exposure regimens have varied between different zebrafish studies, which has confounded the interpretation of zebrafish data across these studies. Here is a protocol to quantify ethanol concentrations in zebrafish embryos using head space gas chromatography.

This work describes a protocol to quantify ethanol levels in a zebrafish embryo using head space gas chromatography from proper exposure methods to embryo processing and ethanol analysis.

ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

行動学

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy livers are capable of regenerating from toxic damage, but in advanced liver disease, the natural ability of the liver to regenerate is impaired. Zebrafish have emerged as a powerful experimental system for studying regeneration. They are an ideal model for studying liver regeneration from partial hepatectomy, a procedure with direct clinical relevance in which part of the liver is surgically removed, leaving the rest intact. There is no standard protocol for partial hepatectomy; previous studies using this model have used slightly different protocols and reported disparate results. Described here is an efficient, reproducible protocol for performing a partial hepatectomy in adult zebrafish. We use this technique to demonstrate that zebrafish are capable of epimorphic regeneration of the resected lobe. This protocol can be used to further interrogate the mechanisms required for liver regeneration in zebrafish.

This protocol describes the procedure for removing the ventral lobe of the liver in adult zebrafish to enable the study of liver regeneration.

成虫ゼブラフィッシュの部分肝切除術

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...