Name: histological analyses of acute alcoholic liver injury in zebrafish
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish at JoVE.com

Yazarlar, Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi&#39;ndeki Dr. Katy Murray&#39;ı kabul etmek istiyor; Protokol hakkında faydalı tavsiyeler için Dr. Çavuşoğlu Stacey Huppert ve Kari Huppert; Ve CCHMC veterinerlik hizmetleri, balık bakımı için. Bu çalışma, NIH hibe R00AA020514 tarafından desteklendi ve CCHMC&#39;deki Pediatrik Genomik Merkezi&#39;nden (CY&#39;ye) bir araştırma ödeneği aldı. Ayrıca kısmen Cincinnati&#39;deki Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi Merkezinin NIH hibe P30 DK078392 (Bütünleştirici Morfoloji Çekirdeği) tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).</li><li>Singal, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+frequency+and+outcomes+of+liver+transplantation+based+on+etiology+of+liver+disease.">Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease.</a> Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).</li><li>Louvet, A., Mathurin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcoholic+liver+disease:+mechanisms+of+injury+and+targeted+treatment.">Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).</li><li>Ki, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-22+treatment+ameliorates+alcoholic+liver+injury+in+a+murine+model+of+chronic-binge+ethanol+feeding:+role+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3.">Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3.</a> Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).</li><li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+differences+in+liver+injury+and+one-carbon+metabolism+in+alcohol-fed+mice.">Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice.</a> Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).</li><li>Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+ethanol+exposure+potentiates+lipopolysaccharide+liver+injury+despite+inhibiting+Jun+N-terminal+kinase+and+caspase+3+activation.">Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation.</a> J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).</li><li>Leo, M. A., Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis+after+long-term+administration+of+ethanol+and+moderate+vitamin+A+supplementation+in+the+rat.">Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat.</a> Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).</li><li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+and+progressive+steatosis+and+focal+necrosis+in+rat+liver+induced+by+continuous+intragastric+infusion+of+ethanol+and+low+fat+diet.">Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet.</a> Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).</li><li>Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intragastric+ethanol+infusion+model+in+rodents.">Intragastric ethanol infusion model in rodents.</a> Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).</li><li>Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drinks+like+a+fish:+using+zebrafish+to+understand+alcoholic+liver+disease.">Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).</li><li>Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+hepatic+dysfunction+parameters+in+two+models+of+fatty+liver+disease+in+zebrafish+larvae.">Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).</li><li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Animal+Model+for+Alcoholic+Liver+Disease+in+Zebrafish.">Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish.</a> Zebrafish. , (2015).</li><li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation.">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li><li>Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+metabolism+and+oxidative+stress+are+required+for+unfolded+protein+response+activation+and+steatosis+in+zebrafish+with+alcoholic+liver+disease.">Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bHLH+transcription+factor+Hand2+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+Analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. , (2012).</li><li>Lassen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+baculovirus+expression,+and+tissue+distribution+of+the+zebrafish+aldehyde+dehydrogenase+2.">Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2.</a> Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).</li><li>Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zebrafish+alcohol+dehydrogenases+share+common+ancestry+with+mammalian+class+I,+II,+IV,+and+V+alcohol+dehydrogenase+genes+but+have+distinct+functional+characteristics.">Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics.</a> J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).</li><li>Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+signaling+facilitates+liver+repair+from+acute+ethanol-induced+injury+in+zebrafish.">Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish.</a> Dis Model Mech. , (2016).</li><li>Vonghia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alcohol+intoxication.">Acute alcohol intoxication.</a> Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).</li><li>Wittekind, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+staining+for+routine+diagnostic+pathology+including+the+role+of+tannic+acid.+1.+Value+and+limitations+of+the+hematoxylin-eosin+stain.">Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain.</a> Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).</li><li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+alcoholic+liver+disease.">Histopathology of alcoholic liver disease.</a> Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).</li><li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Jagged-mediated+Notch+signaling+disrupts+zebrafish+biliary+development+and+generates+multi-organ+defects+compatible+with+an+Alagille+syndrome+phenocopy.">Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy.</a> Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).</li><li>Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Ethanol-induced+Fibrotic+Liver+Model+in+Zebrafish+to+Study+Progenitor+Cell-mediated+Hepatocyte+Regeneration.">Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+rhythms+of+lipid+metabolic+gene+expression+in+zebra+fish+liver:+Response+to+light/dark+and+feeding+cycles.">Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles.</a> Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).</li><li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues.">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li><li>van der Velden, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serine-threonine+kinase+LKB1+is+essential+for+survival+under+energetic+stress+in+zebrafish.">The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Mevcut protokol, zebrafish larvalarında akut etanol muamelesi ve ardından H &amp; E boyaması ile yapılan histopatolojik analizler için ayrıntılı bir prosedürü açıklamaktadır. Akut etanol tedavisi döllenmeden 96 saat önce yapılmalıdır, zebra balığı karaciğeri alkol metabolize eden enzimleri 13 ifade etmeye başlar. % 2 etanol, larvaların tolere edebileceği azami doz 13 , 14&#39;tür . Etanol ile işlemden geçirilen larva, 8 saatlik tedaviyle hepatik steatozu göstermeye başlar ve sürekli tedaviden 24 saat sonra da larva gelişen steatoz yüzdeleri yükselmeye devam eder. Zebra balığı larvaları, 120 hpf&#39;ye kadar yalnızca sarıktan gelen besin maddelerini emer. Bu nedenle, 120 hpf&#39;nin ötesinde etanol tedavisi önerilmemektedir, çünkü açlık aynı zamanda steatoz 14&#39;e katkıda bulunmaktadır. Diğer laboratuarlar tarafından yayınlanan protokollerle karşılaştırıldığındaOratories 13 , 24 , mevcut protokolde yapılan ana tadilat, etanol muamelesinin 14 saat aydınlık / 10 saat karanlık döngüsü olan bir balık tesisinde yürütülmesidir. Bu, tedavi inkübatörde karanlıkta yapıldığında görülenlerden daha tutarlı ve sağlam steatoz yanıtlara neden olur. Bu, zebra balığı karaciğindeki lipid metabolik genlerinin, açık / karanlık döngüye 25 yanıt olarak günlük ritim ifadesini göstermesi ile ilişkili olabilir. ALD kronik bir hastalıktır ve alkol bağımlılığının yıllarca sürer. Mevcut etanol tedavi protokolünün kritik sınırlaması, alkolün karaciğer üzerindeki akut etkilerini tetiklemesidir. 48 saatten daha uzun süren böyle yüksek bir etanol konsantrasyonu ile tedavi, yüksek ölüm oranına neden olur ve kronik karaciğer hasarının araştırılmasını engeller. Yakın zamanda yapılan bir araştırmada yetişkin zebra balığının% 3&#39;e kadar etanol ile devamlı tedavisininAylar steatoz, steatohepatit ve fibroz yol açtı 12 . Gelecekte umut vaat eden bir yön, akut etanol muamele protokolünü kullanarak olası bir ALD modülatörünü tanımlamak ve daha sonra kronik hasar modeli üzerindeki etkisini doğrulamak olabilir. H &amp; E boyaması, akut etanol tedavisi ile uyarılan hepatoselüler hasarları değerlendirmek için yapılır. Zebrafish&#39;de flüoresans görüntüleme kolaylığı nedeniyle, H &amp; E boyaması zebra bağı karaciğer histolojisinde rutin olarak kullanılmaz ve işlem daha az açıklanmıştır. Mevcut protokol, larva karaciğindeki H &amp; E boyanmasının adım adım açıklaması sağlar. Doğru fiksatif seçimi, H &amp; E boyamasında ilk ve en önemli adımdır. Histolojide yaygın olarak% 10 tamponlu formalin ve% 4 PFA kullanılırken, her ikisi de doku küçülmesine ve karaciğer bölümlerinin kesit dışında kalmasına neden olur. % 10 formalin fiksasyonu, hepatte sitoplazmanın kaybına yol açarocytes. % 4 PFA fiksasyonu, hepatositler arasındaki yapay boşluklara neden olur. Eozin boyama, hem fiksatif ile sabitlenmiş hematoksilin boyamaya göre çok daha zayıf gözükmektedir. Asit temelli Dietrich fiksatifi, hücresel ayrıntıları korur ve büzülmeyi en aza indirgemek için zebra balığı karaciğerinin H &amp; E boyaması için daha uygundur. Karaciğer gibi yağlı dokulara formalin ve PFA&#39;dan daha hızlı nüfuz ediyor gibi görünüyor. Hematoksilen ve eozin ile boyanma daha dengelidir. Dietrich fiksatifinin bir uyarı olarak, genetik DNA ekstraksiyonu için uyumlu değildir. Deneme deneyinde,% 10 formalin,% 4 PFA veya Dietrich fiksatif 26 kullanılarak tespit edilen larva genomik DNA ekstre edildi. Larvalar 50 uL 50 mM NaOH içerisinde 95 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edildi ve daha sonra 4 ° C&#39;ye soğutuldu. Bazik çözeltiyi nötrleştirmek için 5 uL 1 M Tris-HC1, pH 8.0 ilave edildi. Kısa bir santrifüjden sonra, süpernatant wPCR&#39;de kullanıldığı gibi. Aynı PCR primerleri ve PCR programı ile hem formalin hem de PFA sabitlenmiş larva genomik DNA&#39;sı, tahmin edilen boyutlara sahip PCR ürünleriyle sonuçlanırken, Dietrich fiksatif sabit larva genomik DNA&#39;sı herhangi bir PCR ürünü üretemedi. H &amp; E boyaması hem parafin bölümleri hem de donmuş bölümler üzerinde yürütülebilir. Bununla birlikte, parafin bölümlerinin dondurulmuş bölümlere göre aşağıdaki avantajları vardır: 1) Parafin bölümleri oda sıcaklığında süresiz olarak depolanabilirken, donmuş bölümler yalnızca bir yıla kadar -80 ° C&#39;de saklanabilir. 2) Donmuş kesitler için, hücrelerde buz kristalleri oluşması, hücre morfolojisini ve hücre altı ayrıntısını bozabilir. Dahası, donmuş bölümler çoğunlukla parafin bölümlerinden daha kalıntır. Bu, parafin bölümlerinden üretilenlere kıyasla zayıf doku morfolojisi görüntülerine neden olabilir. Karaciğer dokuları için parafin blokları hazırlarken, mevcut protokolLarva agaroz içine gömer. Larvalar, vücudun sol tarafı aşağı bakacak ve kalıbın tabanına düz olacak şekilde yanal olarak konumlandırılır. Bu, karaciğerlerin tutarlı yönlendirilmesini sağlar, böylece bölümler sırayla kesildiğinde, karaciğerin eşdeğer bölgeleri balıktan balıkla karşılaştırılabilir 27 . Başarılı H &amp; E boyamayı sağlayan bir diğer önemli adım renk gelişimidir. İstenen renk yoğunluğuna ulaşılana kadar boyayı sık sık kontrol etmek çok önemlidir. Karaciğer hasarının ön değerlendirmesini yapmak için H &amp; E boyası kullanılmalıdır. Etanol ile muamele edilen larvalar, hepatositlerde aşırı miktarda yuvarlak damlacık birikimi gösterirler ki bu durum steatozu düşündürür 13,14,18. Yağ Kırmızı O ve Nil Kırmızısı gibi lipid boyaları ile etiketleme, bu damlacıkların gerçekten lipid olduğunu doğrulamak için gereklidir. Karaciğer kan damarıTedavi gören hayvanlarda büyümüş ve şişmiş görünürler. Sinüsoidlerdeki ultrastrüktürel değişiklikleri incelemek için taramalı elektron mikroskopisi ve transmisyon elektron mikroskopisi yapılmalıdır. İmmünofloresans 18 ile saptanan etanolle işlemden geçirilmiş zebra balığı karaciğeri içinde ekstrasellüler matriks protein depolanmasının arttığı daha önce bildirilmiştir. Bununla birlikte, fibrojenik genlerin ekspresyon seviyelerinin, işlenmiş balık 18&#39;de ılımlı bir şekilde arttığı göz önüne alındığında, H &amp; E, bu kadar az miktarda hücre dışı matris proteinleri tespit etmek için yeterince duyarlı olmayabilir. Aynı fiksatif ve boyama yöntemleri, kronolojik olarak hasar gören yetişkin zebra branşı karaciğerlerinde test edildi ve fibrozun tespiti için yeterli idi (Yin, yayınlanmamış veriler). Mevcut protokol, zebra balığı larvalarında karaciğer histolojisinin incelenmesine uyarlanmış olmasına rağmen, zebra balığı araştırma topluluğuna samE protokolü diğer dokulara ve yetişkin zebra balığına uygulanabilir.

Alkol tüketimi nedeniyle oluşan Alkolik Karaciğer Hastalığı (ALD), alkol ile ilişkili morbidite ve mortalitenin ana nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde karaciğer hastalığının ölümlerinin yaklaşık yarısında alkol 1 ve ALD 3 karaciğer naklinde neredeyse 1&#39;den sorumludur 2 . ALD geniş bir spektruma sahiptir. Hepatositlerde aşırı lipid birikimi ile karakterize olan steatoz, ağır içmenin erken evresinde ortaya çıkar ve alkol kullanımının durması üzerine geri döndürülebilir. Genetik ve çevresel faktörlerin etkisi altında ve devam eden alkol alımıyla hepatik steatoz alkolik hepatite ve nihayetinde siroza ilerleyebilir. Kemirgen ALD modellerini kullanan çalışmalar, hastalığa dair önemli bilgiler sağlamıştır, ancak sınırlamaları vardır (referans 3&#39;de gözden geçirilmiştir). Bir alkol diyetinin oral yemi sadece kemirgenlerde steatoza neden olur 4 , &lt;/ Sup&gt; 5 . İnflamasyon ve fibroz gelişiminde 6 , 7 ya da invaziv ve teknik açıdan zorlayıcı olan kronik intragastrik infüzyon ikinci bir hakaret gerektirir ( 8 , 9) . Teleost zebrafish ayrıca hem kronik hem de akut alkol tedavisine yanıt olarak karaciğer hasarını geliştirir 10,11,12,13,14,15. Özellikle larval zebra balığı, akut alkollü karaciğer hasarının 10 , 11 , 13 , 15 incelerken çekici bir tamamlayıcı model organizmayı temsil eder. Zebra balığı karaciğeri fonksiyoneldir ve etanol metabolizması için 4 gün boyunca anahtar enzimler üretir(Dpf) 13 , 16 , 17.Etanol doğrudan suya eklenebilir ve 24 saat süreyle% 2 etanol ile maruz bırakılması, zebrafish larvalarında hepatik steatoz ve fibrojenik yanıtları indüklemek için yeterlidir 13,15. 24 saat süreyle% 2 etanol ile işlemden geçirildiğinde zebra balığı larvaları 13&#39;de 80 mM&#39;lik bir etanol etanol konsantrasyonu ortaya çıktığı bildirilmiştir. Diğerleri larvaların bu konsantrasyonu tolere ettiğini ve tedavi edilen hayvanlarda görülen karaciğer fenotiplerinin etanol maruziyetine özgü olduğunu 11 , 13 , 15 , 18 göstermiştir. Bununla birlikte, 80 mM, insanlarda 19 ölümcül olduğu için, etanol ile işlemden geçirilmiş zebra balığı ve karaciğer histolojisini değerlendirmek önemlidirİnsanlara fizyolojik olarak uygunluğunu söyleyin. Zebra balığı larvalarının hızlı harici gelişimi ve yarı saydamlığı, karaciğerdeki alkolün gerçek zamanlı ve sabit numunelerde oluştuğunu karakterize etmeyi mümkün kılar. Hücre tipine spesifik fluoresan transgenik çizgilerin varlığı ve konfokal mikroskopide son gelişmeler akut etanol tedavisine yanıt olarak farklı karaciğer hücre tiplerinin morfolojilerini ve davranışlarını nasıl değiştirdiklerini araştırmayı kolaylaştırır 11,15. Bununla birlikte, floresan transgenik zebra bifsiğinin konfokal görüntülemesi, karaciğer histolojisini incelerken Hematoksilen ve Eozinin (H &amp; E) boyamasının tamamen yerini alamaz. Transgenik zebra balığı kullanarak tüm karaciğer hücre tiplerini aynı anda işaretlemek, her biri bir karaciğer hücresi türünü benzersiz bir florofor ile etiketleyen bireysel transgenik çizgilerin üretilmesini gerektirir. Aynı balıkta farklı transgenik arka planlar getirmek breedin&#39;i gerektirirG çok kuşaktır, bu da zaman alıcı ve maliyetlidir. Ekstra immünofloresan boyama, hücre dışı matris bileşenlerini saptamak için gereklidir. Öte yandan, H &amp; E boyası, tüm karaciğer hücre tiplerini ve hücre dışı matris bileşenlerini aynı anda etiketlendirir, böylece karaciğer 20&#39;ye genel bir bakış sağlar. Dahası, karaciğer hastalıklarının, hepatosit ölümü, steatoz ve fibroz gibi çeşitli histopatolojik özelliklerini kolayca ortaya çıkarmaktadır. H &amp; E, memeli karaciğer histolojisinde rutin bir leke olmasına rağmen, zebra balığı karaciğer araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaz ve protokol daha az kuruludur. Bu çalışma, zebra balığı larvalarında akut etanol tedavisi için ve H &amp; E boyaması ile izlem histolojik analizleri için bir protokolü açıklamaktadır. H &amp; E boyama protokolü, karaciğer gelişimi ve işlevi ile ilgili tüm araştırmalarda kullanılabilir. Ayrıca, parafin bölümleri immünohistokimyasal olarak ve diğer özel staTrichrome boyası, retikülin lekesi vb . Dahil karaciğer patolojisinde ins.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>E &amp;amp; K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Newcomer Supply</td><td>10010A</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum jar rack holder</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological petri dishes with lid</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy pads</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>Charged slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>Clear mounting media</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Can be substituted with other clear mounting media</td></tr><tr><td>Commercial sea salts</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Disposable microtome blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>Enclosed tissue processor</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Phloxine stain set</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>A suspected carcinogen; irritant</td></tr><tr><td>Formalin, Buffered, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>A suspected carcinogen; irritant</td></tr><tr><td>Graduated media bottle</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Poly Scientific R&amp;amp;D Corp.</td><td>s212</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Histology molds</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate/Stirrer</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>Inverted compound microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Newcomer Supply</td><td>12094E</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutating mixer</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>A suspected carcinogen; irritant</td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pump (10 mL)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate, monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Slide Staining Kit</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>S318-500</td><td>Very hazardous</td></tr><tr><td>Sodium phosphate, dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel strainer (5 inch diameter)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>Tissue cassettes</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding center</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>Tissue wipers, 1-Ply</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Tris base, primary standard and buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Irritant</td></tr></tbody></table>

histological analyses of acute alcoholic liver injury in zebrafish

Alkolik Karaciğer Hastalığı (ALD), akut veya kronik alkol bağımlılığı nedeniyle karaciğerde hasar anlamına gelmektedir. Alkolle ilişkili morbidite ve mortalitenin başlıca nedenleri arasındadır ve Birleşik Devletler&#39;de 2 milyondan fazla kişiyi etkilemektedir. ALD&#39;ye etkili tedavi geliştirmek için alkolle indüklenen karaciğer hasarının altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması önemlidir. Zebra balığı larvaları akut alkollü karaciğer hasarının çalışması için yararlı olan% 2 etanolün sadece 24 saat maruz kaldıktan sonra hepatik steatoz ve fibrojenez sergilerler. Bu çalışma, zebra balığı larvalarında akut etanol tedavisi için prosedürü açıklamakta ve hepatit kan damarlarında steatoz ve şişmeye neden olduğunu göstermektedir. Hematoksilin ve Eozin (H &amp; E) boyama için zebra balığı iri karaciğerinin histolojik analizi için optimize edilmiş ayrıntılı bir protokol de açıklanmaktadır. H &amp; E boyaması, immünofloresansa kıyasla birçok benzersiz avantaja sahiptir, çünkü tüm canlıları işaretlemektedirEr hücreleri ve hücre dışı bileşenleri aynı anda tespit edebilir ve steatoz ve fibroz gibi hepatik hasarı kolayca tespit edebilir. Toksik ve virüs kaynaklı karaciğer hasarının ve kalıtsal karaciğer hastalıklarının modellenmesinde zebra bibinin artan kullanımı göz önüne alındığında, bu protokol bu çalışmaların tamamında yapılan histolojik analizler için bir referans görevi görür.

% 10 tamponlu formalin ve% 4 paraformaldehid (PFA), histoloji uygulamaları için kullanılan en yaygın sabitleştiricilerden ikisidir. Bununla birlikte, zebra balığı karaciğer dokusu için optimal fiksasyon sonuçları vermezler ( Şekil 1 ve Tablo 1 ). % 10 formalin veya% 4 PFA ile yapılan fiksasyon sıklıkla büzülmelere neden olur ve karaciğer ile çevreleyen dokular arasında büyük boşluklar oluşur ( Şekil 1A , B ; Şekil 1B , doku büzülmesine bir örnek sağlar). Karaciğer dokusu bölümleri de bölüm dışına düşebilir. Hepatositlerin sitoplazması çoğu zaman kaybolur ( Şekil 1A , 1B ). Her iki fiksatif madde de hepatositlerin bozulmasına neden olabilir, çünkü bunlar küçülür veya şişer ve epitel hücreleri için karakteristik olan kolumnar morfolojiyi artık korumazlar. PFA fiksasyonuyla ilgili bir diğer konu daHepatositler arasında, gerçek olmayan, dokunun kırık görünmesine neden olan boşluklar bulunduğunu gösterir ( Şekil 1B ). Ayrıca, bu iki fiksatif maddeden herhangi biri kullanıldığında, hepatositler hematoksilen ile iyi lekelenir, ancak eozin ile daha az lekelenir ( Şekil 1A ). Asit temelli Dietrich fiksatifi formalin ve PFA fiksatifleri ile ilgili konuları aşar ( Şekil 1C ). İnsan ALD&#39;sinde, küçük damlacık yağından ve büyük damlacık yağından oluşan steatoz, merkezi damarın yakınında belirgindir ve şiddet 22 artarak portal triadın dışına doğru uzanır. Zebra bifenisinde, 96-120 hpf&#39;den% 2 etanol ile tedavi, hepatositlerde yuvarlak damlacıkların aşırı birikimi ile ilişkilendirilen hepatik steatozu da uyarmaktadır ( Şekil 2B , oklar). Ancak, damlacıklar exhibi yokTA, insan ALD&#39;sinde görülen benzer dağılım modeline benzemektedir çünkü zebra balığı karaciğindeki portal ve merkez venler arasında net bir ayrım yoktur 23 . Etanol ile tedavi edilen larval karaciğerdeki karaciğer kan damarları, kontrol karaciğeri içindeki karaciğere kıyasla şişmektedir ( Şekil 2B , yıldız). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55630/55630fig1.jpg" /> Şekil 1 : 120 hpf&#39;de Farklı Fitikatörler ile Sabitlenmiş Zebra balığı Larvalarının Karaciğerlerinde H &amp; E Boyanmasının Karşılaştırılması. ( A ) oda sıcaklığında O / N&#39;de% 10 formaldeş; ( B ) 4 ° C / N&#39;de% 4 PFA; ( C ) 24 saat oda sıcaklığında Dietrich fiksatifi. % 10 formalin ile hepatositler sıklıkla sitoplazmalarını kaybederler (A). Doku eozin ile düzgün bir şekilde lekelenmemiş ve mor renkte görünüyor. Sonra fixa% 4&#39;lük PFA ile birlikte, hepatositlerin arasında boşluklar görülür (B). % 4 PFA karaciğer dokusunun küçülmesine neden olur, bu nedenle karaciğer ve çevresindeki dokular arasında büyük bir boşluk olduğu görülür. B&#39;deki kesikli çizgi çevreleyen dokuların sınırlarını işaret eder. Dietrich fiksatifi üç (C) arasında en iyi sonucu verir. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55630/55630fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55630/55630fig2.jpg" /> Şekil 2 : Akut Etanol Tedavisi, Zebra balığı Larvaları Karaciğerlerinde Hepatik Steatoz ve Kan Damarında şişmeye neden olur. ( A ) Karaciğerin bir kontrol, tedavi edilmemiş, WT larvalarında H &amp; E boyaması. ( B ) Karaciğerin% 2 eta ile muamele edilmiş bir wil tipi larvalarda H &amp; E boyaması96 - 120 hpf arasında değişir. Her iki hayvan, 120 hpf&#39;de Dietrich fiksatifiyle tespit edildi. (B) noktasındaki oklar, yuvarlak damlacıkların aşırı miktarda çökelmesi ile hepatositleri göstermektedir. Yıldız işareti şişmiş hepatik kan damarlarını işaretler. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55630/55630fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> % 10 formalin </td><td> % 4 PFA </td><td> Dietrich fiksatif maddesi </td></tr><tr><td> Tespit şartı </td><td> RT&#39;de en az 24 saat </td><td> RT&#39;de 3 saat veya 4 ° C&#39;de O / N </td><td> RT&#39;de en az 24 saat </td></tr><tr><td> Örnek saklama sonrası sabitleme </td><td> RT&#39;de belirsiz </td><td> 4 ° C&#39;de 2 haftaya kadar </td><td> RT&#39;de 2 aya kadar </td></tr><tr><td> compatibGenomik DNA ekstraksiyonu ile ilit </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Yok hayır </td></tr><tr><td> daralmalar </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> minimum </td></tr><tr><td> Hücrelerin bozulması </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> minimum </td></tr><tr><td> Hücresel ayrıntıların kaybedilmesi </td><td> Evet </td><td> mütevazi </td><td> minimum </td></tr><tr><td> Dengeli H &amp; E lekesi </td><td> Zayıf eosin boyası </td><td> Zayıf eosin boyası </td><td> Evet </td></tr><tr><td> İmmünhistokimya ile Uyumluluk </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Zebra balığı Karaciğer Histolojisi için% 10 formalin,% 4 PFA ve Dietrich&#39;in Fiksatiflerinin Karşılaştırılması.

Watch this Scientific Journal Video about Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish at JoVE.com

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Bu protokol 24 saat boyunca% 2 etanol ile işlenmiş zebrafish larva karaciğerlerinin histolojik analizlerini tanımlamaktadır. Böyle akut etanol tedavisi hepatik steatoz ve hepatik vaskülatürün şişmesi ile sonuçlanır.

Zebra balığıda Akut Alkollü Karaciğer Hasarının Histolojik Analizi

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.2K Görüntüleme.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center.  Bu protokol 24 saat boyunca% 2 etanol ile işlenmiş zebrafish larva karaciğerlerinin histolojik analizlerini tanımlamaktadır. Böyle akut etanol tedavisi hepatik steatoz ve hepatik vaskülatürün şişmesi ile sonuçlanır. 

Video: Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Tıp

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Kanser Araştırmaları

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies and neurological impairments. With a complex pathology, FASD affects approximately 1 in 100 children born in the United States each year. Due to the highly variable nature of FASD, animal models have proven critical in our current mechanistic understanding of ethanol-induced development defects. An increasing number of laboratories has focused on using zebrafish to examine ethanol-induced developmental defects. Zebrafish produce large numbers of externally fertilized, genetically tractable, translucent embryos. This allows researchers to precisely control timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts and quantify the impact of embryonic ethanol exposure through live imaging techniques. This, combined with the high degree of conservation of both genetics and development with humans, has proven zebrafish to be a powerful model in which to study the mechanistic basis of ethanol teratogenicity. However, ethanol exposure regimens have varied between different zebrafish studies, which has confounded the interpretation of zebrafish data across these studies. Here is a protocol to quantify ethanol concentrations in zebrafish embryos using head space gas chromatography.

This work describes a protocol to quantify ethanol levels in a zebrafish embryo using head space gas chromatography from proper exposure methods to embryo processing and ethanol analysis.

Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

Davranış

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy livers are capable of regenerating from toxic damage, but in advanced liver disease, the natural ability of the liver to regenerate is impaired. Zebrafish have emerged as a powerful experimental system for studying regeneration. They are an ideal model for studying liver regeneration from partial hepatectomy, a procedure with direct clinical relevance in which part of the liver is surgically removed, leaving the rest intact. There is no standard protocol for partial hepatectomy; previous studies using this model have used slightly different protocols and reported disparate results. Described here is an efficient, reproducible protocol for performing a partial hepatectomy in adult zebrafish. We use this technique to demonstrate that zebrafish are capable of epimorphic regeneration of the resected lobe. This protocol can be used to further interrogate the mechanisms required for liver regeneration in zebrafish.

This protocol describes the procedure for removing the ventral lobe of the liver in adult zebrafish to enable the study of liver regeneration.

Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...