この作品は、ジョンズホプキンス大学（SW）からの資金によってサポートされていました。私たちは、彼らの技術支援のための医学顕微鏡施設のジョンズホプキンス大学に感謝します。私たちは、エリックヨルゲンセンとクリスチャン・ローズンマンドと技術の発展のために自分の研究室のメンバーに感謝します。私たちは、最初のデバイスの設計のためのM. ウェイン・デイビス感謝します。私たちは、彼らの技術支援のためにポール・ワージンガー、クベータ・トモバ、およびDelgermaa Luvsanjavに感謝します。また、原稿の彼らの重要な読書のためにナタリー・R.ハミルトンとグラント・F・クジック感謝します。

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この記事のオープンアクセス出版は、ライカMikrosysteme社が主催ました。

「フラッシュおよび凍結」のアプローチは、光遺伝学で、特定の細胞事象を誘導することにより刺激19の後に定義された時点で細胞を凍結することにより、膜のダイナミクスを可視化します。このデモでは、我々は、神経細胞を刺激するために、チャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを使用し、シナプス末端で融合し、シナプス小胞の回復を捕獲しました。近年では、多くの光遺伝学的ツールは、フラッシュおよび凍結と互換性があるすべては、23、22を開発されています。例えば、オルガネラ輸送はクリプトとCIB1 24の光誘起ヘテロを用いて誘導することができます。同様に、原形質膜の脂質組成は、原形質膜25ホスホイノシチドホスファターゼの光誘起転座によって変化させることができます。また、アゾベンゼンCHような小さな、光感受性化合物照明波長に応じアンジュコンホメーション。このコンホメーション変化は、リガンド依存性チャネルを活性化するか、または膜26,27における脂質組成を変更するために使用することができます。ケージド化合物はまた、細胞活性を誘導するために使用することができます。しかし、現在のセットアップに使用されるLEDはアンケージングのために十分なエネルギーを生成しないことができます。このように、システムのさらなる最適化はおそらく必要です。それにもかかわらず、これらの光活性化ツールの用途は柔軟-多くの細胞事象は、光のフラッシュによって誘導することができるしています。 「フラッシュと凍結は、」得られた膜のダイナミクスをキャプチャすることができます。 「フラッシュおよび凍結」方法には2つの主な制限があります。まず、それは別の細胞から特定のイベントの「スナップショット」をキャプチャします。言い換えれば、時間をかけて一つのセル内膜のダイナミクスを追跡することはできません。このように、あらゆる細胞の再構築のためにもT、一つは各試料から、各時点で多数の画像を取得し、分析しなければなりません。マウス海馬ニューロンにおけるシナプスの30％の18、28 -シナプス小胞の融合がわずか20に場所を取るので、ニューロンにおいて、画像のより大きな数が必要です。このような大規模なデータセットの分析は、時間の膨大な量を必要とします。将来的には、画像取得と解析が29、30のアプローチは、より効率的にするために自動化する必要があります。 第2の制限は、高圧凍結技術の性質によって課されます。細胞が凍結するとき、細胞水が凍結速度は100 K / sの21未満である場合に氷結晶を形成するために再配置します。これらの氷晶は、膜を貫通または膜の破裂をもたらす、局所浸透圧を変えるための溶質を濃縮することができます。氷の結晶を避けるために、HIGH圧力（約2,000気圧）試料に適用されます。過冷却効果により、100 K /秒の凍結速度は、この圧力21で氷晶の形成から水を防止するのに十分です。理論的には、試験片として厚さ500μmの氷結晶なしで凍結することができるが、氷の立方体の形態が形態を損なう、厚い組織に形成される傾向があるように200μm程度は、おそらく実用的限界です。 5ミクロンより厚い試料を処理するときに、BSAなどの適切な凍結保護剤の使用は、必要です。しかし、BSAは、溶液の浸透圧を変化させると、細胞の生理学的応答に影響を及ぼし得ます。したがって、広範囲の対照実験は、特定のシステムにおけるBSAの使用を検証するために必要とされます。試料は誤っ液体窒素浴から除去された場合に氷結晶はまた、高圧凍結後に形成することができます。このように、すべての回で、液体窒素中に標本を維持するとの予冷した鉗子を使用することが重要ですそれらを操作。 実験を計画する場合は、以下の3点を考慮する必要があります。 8.0ミリワット/ mm 2で-まず、光の最大強度（460 nmのライン）が5.5です。この強度は活性を誘導するのに十分であるかどうかをフラッシュし、凍結実験に先立って、蛍光顕微鏡でのライブセルイメージングを用いて検証する必要があります。第二に、実験は、生理的な温度で行われなければなりません。高圧フリーザーの段階は、マウス海馬ニューロン31との実験のために37℃まで加温します。最後に、時間ポイントは慎重にメンブレンダイナミクスをキャプチャするために選択されなければなりません。初期の研究は、エンドサイトーシスが刺激の100ミリ秒後に完了していることが示されました。したがって、三つの追加の時点（15、30、および50ミリ秒）は、膜ダイナミクス17、18に従うように調べました。これらの時点は膜輸送のイベントを可視化するために必要でしたシナプス伝達中の。しかしながら、時間点の数のための要件は、各細胞事象で異なります。そのため、いくつかの時点では大規模なデータセットの収集を開始する前にサンプリングする必要があります。

細胞内膜およびタンパク質動態を可視化することは、特定のプロセスの細胞生物学を理解することに向けた重要なステップです。ダイナミックな人身売買のイベントは、光や蛍光顕微鏡を用いて撮影することができます。細胞内構造は完全に色素または蛍光プローブにより「塗装」と空間的およびスペクトル1,2解決できないのでしかし、細胞内のコンテキストは、主にこのような画像に欠けています。電子顕微鏡は、絶妙な詳細に亜細胞アーキテクチャを描くことができながら、試料を撮像する前に固定しなければならないので、一方、それは、細胞ダイナミクスを捕捉することができません。したがって、典型的には、完全にのみ1つの撮像モダリティを使用して細胞のダイナミクスを理解するのに十分ではありません。 光と電子顕微鏡の限界を克服するために、相関顕微鏡技術が開発されています。相関光と電子顕微鏡（CLEM）は、光学顕微鏡と電子顕微鏡との根本的な細胞内構造を使用して細胞内動態を可視化します。 CLEMでは、そのような分裂およびエンドサイトーシス3、4、5、6のような様々なプロセス、に従事した細胞は、ライブ画像化され、その後、電子顕微鏡のために処理されます。 CLEMは、細胞内ダイナミクスの特定の側面をキャプチャしますが、このアプローチの有用性を制限する4つの要因があります。固定剤7の遅い拡散および反応による分-まず、時間分解能は、細胞は、典型的には、Sをとる、固定化することができる方法を迅速によって制限されます。第二に、細胞内のアーキテクチャは、8 事後観察されます。従って、動的形態学的変化は、このアプローチを使用してキャプチャすることができません。第三に、蛍光および電子顕微鏡写真は、正確に起因する組織SHに整列することはできません電子顕微鏡9、10のためのサンプル調製時の脱水によって引き起こさrinkage。第四に、細胞質分裂およびエンドサイトーシスなどのイベントは、すべてのセル5、11で同時に行われていない、ため、イベントに従事している特定の細胞は、細胞の大集団から識別されなければなりません。このプロセスは、多くの場合、面倒です。従って、新しい方法は、すべてのセル内の特定のイベントを誘発することと定義された時点での細胞の急速な固定化によって得られた細胞ダイナミクスを捕捉する必要があります。 最近、いくつかのツールは、光（光遺伝学）を使用して、特定の細胞動態を誘導するために開発されています。チャネルロドプシンは、 コナミドリムシ 12、13から単離された感光性、非選択的カチオンチャネルです。チャネルロドプシンはneuronaで発現された場合L膜は、光の短いフラッシュは、ニューロンへのナトリウムイオンの流入を誘導し、14、15の潜在的作用を誘発します。活動電位は、その後、シナプス小胞18はしたがって、チャネルロドプシンは、神経活動を誘導し、ミリ16、17内に融合シナプス末端へ伝播します。シナプス末端膜のダイナミクスを追跡するために、ニューロンはミリ秒精度での刺激後に定義された時点で固定化されなければなりません。 神経活動を誘導した後の膜のダイナミクスをキャプチャするために、我々は、高圧凍結17、18、19で光刺激を結合しました。高圧凍結を低減氷晶形成20を有する細胞のほぼ瞬間的固定化を可能にします。氷の結晶CAN膜を破裂させ、細胞内のアーキテクチャ21を混乱させる。刺激および凝固の間の時間間隔を変化させることにより、シナプス端末内膜輸送は、活動電位の誘導後に捕捉しました。 ここでは、そのカップル、高圧凍結と光刺激のミリ秒時間的な制御を商品化し、高圧の冷凍庫を使用して実験手順を示しています。光刺激及び凝固を制御する外部装置を必要とする他の機器とは異なり、光刺激は完全にこのシステムに統合され、MSの精度19を適用することができます。このプロセスは複数のステップを必要とします。 1）マウスの海馬ニューロンは、サファイアディスク上で培養し、チャネルロドプシン18のための発現ベクターを保有するレンチウイルスに感染しています。 2）ニューロンが刺激され、刺激後定義された時点で凍結されています。 3）ガラス化水で代替され有機溶媒とD、脂質及びタンパク質は、細胞内のアーキテクチャを維持するために固定剤によって架橋されています。 4）サンプルをエポキシ樹脂に浸透し、埋め込まれています。 5）超薄切片をウルトラミクロトームを使用して収集されます。 6）薄切片を透過型電子顕微鏡で撮像されます。 7）画像取得及び分析は、時間点又は遺伝子型に対して盲目的に行われます。細胞動態は、時間分解画像17、18の再構成によって決定することができます。サンプル調製は、（2ステップ - 上記5）の週が必要ですが、その後の画像解析は、年に数ヶ月を要します。

<table><tbody><tr><td>Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System&amp;nbsp; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Gonotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome UC7</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Blue M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Personna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16530</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>EMS</td><td>RT19132</td><td>Toxic, open only under certified chemical hood</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>EMS</td><td>RT10016</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Emdmillipore</td><td>391340-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>49159-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>746436-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>21115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T.Baker</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td><td>Ted Pella</td><td>18241</td><td></td></tr><tr><td>Special embedding (BEEM) capsule</td><td>EMS</td><td>70021</td><td></td></tr><tr><td>Copper Grid</td><td>Ted Pella</td><td>1GC12H</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td><td>Ted Pella</td><td>19244</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td><td>Scotch</td><td>170497</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Themo scientific</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium)</td><td>Thermo scientific</td><td>10569-044</td><td>Should be warmed to 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Thermo scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Thermo scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slip</td><td>Fisher</td><td>S175223</td><td>Should be acid-washed</td></tr><tr><td>Sapphire disc</td><td>Technotrade</td><td>616-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Emdmillipore</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen</td><td>Thermo scientific</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Fisher</td><td>10888022</td><td>Should be warmed to 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td><td>Fisher</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Seraum free supplement&amp;nbsp; (B-27)&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039;-balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>Active Unit should be calculated for each batch</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Tocris</td><td>03-731-0</td><td></td></tr><tr><td>Bicculine</td><td>Tocris</td><td>01-091-0</td><td></td></tr><tr><td>Whatman I filter paper</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>Philips CM20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

細胞は、絶えず彼らの膜構造およびタンパク質分布を変更するが、それぞれ、MSおよびナノメートルのオーダーの時間および空間分解能でこれらのイベントを視覚化することは極めて困難です。私たちは、光遺伝学と細胞事象を誘導し、刺激後定義された時点で細胞を凍結することにより得られた膜の動態を可視化する時間分解電子顕微鏡技術、「フラッシュや凍結を」を開発しました。この技術を実証するために、我々は、マウスの海馬ニューロンにおけるチャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを発現しました。光のフラッシュは、ニューロン活動を刺激し、シナプス小胞の融合を介してシナプス終末からの神経伝達物質の放出を誘発します。ニューロンの光遺伝学的刺激は、シナプス伝達中の形態学的変化に追従して高圧凍結に連結されています。商業用器具を用いて、我々は、シナプス小胞の融合とSYNAの回復を捕獲しましたPTIC小胞膜。形態学的変化を時間をかけて別の細胞に続いていたので、一連のイベントを可視化するために、大規模なデータセットは、生成され、盲目的に分析しました。それにもかかわらず、フラッシュや凍結はミリ秒の時間分解能を持つ電子顕微鏡写真でメンブレンダイナミクスの可視化を可能にします。

上記のプロトコルを使用して、我々は、チャネルロドプシンを発現するマウス海馬神経細胞に「フラッシュおよび凍結」の実験を行いました。これらのニューロンは、光発症後15ミリ秒または100ミリ秒のいずれかを凍結しました。我々は以前に18それぞれ、シナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは、15ミリ秒と100ミリ秒の時点でシナプス末端で起こることを示しています。これらのイベントは、正常にフラッシュおよび凍結実験がうまく選択を行うことができることを示唆し、適切な時間（ 図2）で撮影した（ 材料の表を参照）高圧フリーザーを専門。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> 高圧冷凍庫図1.サンプル・ロードとプログラミング。高PのA）サンプルローディングテーブルressure冷凍庫。構造の詳細は、挿入図に示す中間プレートは、サンプルローディング用クレム・ホルダー内に配置されます。半円筒の一つは、試料載置台の底部に配置され、他方はトップカバーにクリップで取り付けられています。サンプルがロードされると、中間プレートは、底部半円筒に前方に押され、カバーが凍結を開始するために閉じられます。 B）試料のアセンブリ。ニューロンを含むサファイアディスクは、細胞側を上に向けて、中間プレートのウェル内に配置されます。 100μmの環が直接ウェル内部サファイアディスクの上方に配置されています。その後、生理食塩水に浸漬空サファイアディスクは溶液側と下方に配置されます。気泡は避けなければなりません。最後に、100μmのリングと400μmのリングがぴったりと上方に配置されています。余分な液体を濾紙で除去されます。 C）エポキシ樹脂に浸漬サファイアディスクと埋め込みカプセルの断面図。 SAPP雇うディスクは、細胞側を上に向けて、カプセルの底に配置され、浸潤および埋め込み用エポキシ樹脂で覆われています。単一、10ミリ秒の刺激のための高圧フリーザープログラミングD）。標本は、90ミリ秒の光パルスの後に凍結されています。 E）20 Hzで10の刺激のための高圧フリーザーのプログラミング。標本は5ミリ秒、最後の光パルスの後に凍結されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> マウスの海馬神経細胞におけるエキソサイトーシスとエンドサイトーシスの2可視化図。海馬の神経細胞は一度刺激され、示された時間で凍結されています。電子顕微鏡写真は、シナプス小胞Aのエキソサイトーシス）及び超高速エンドサイトーシスを表示します<strong&gt; B）。 PSD、シナプス後密度。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

flash-freeze-novel-technique-to-capture-membrane-dynamics-with

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K ビュー.  Johns Hopkins School of Medicine. 私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。 

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

生化学

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

生物工学

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular communication. EVs consist of three populations of vesicles, namely microvesicles (MVs), exosomes, and apoptotic bodies. The limiting membrane of EVs is crucially involved in the interactions with the recipient cells, which could lead to the transfer of biologically active molecules to the recipient cells and, consequently, affect their behavior. The freeze-fracture electron microscopy technique is used to study the internal organization of biological membranes. Here, we present a protocol for MV isolation from cultured cancerous urothelial cells and the freeze-fracture of MVs in the steps of rapid freezing, fracturing, making and cleaning the replicas, and analyzing them with transmission electron microscopy. The results show that the protocol for isolation yields a homogenous population of EVs, which correspond to the shape and size of MVs. Intramembrane particles are found mainly in the protoplasmic face of the limiting membrane. Hence, freeze-fracture is the technique of choice to characterize the MVs' diameter, shape, and distribution of membrane proteins. The presented protocol is applicable to other populations of EVs.

We present a protocol for the isolation and freeze-fracturing of extracellular vesicles (EVs) originating from cancerous urothelial cells. The freeze-fracture technique revealed the EVs' diameter and shape and-as a unique feature-the internal organization of the EV membranes. These are of immense importance in understanding how EVs interact with the recipient membranes.

細胞外小胞分析のための凍結破壊電子顕微鏡

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular ...

がん研究

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

免疫・感染学

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

生物学

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...