ビデオでは、インビトロで膀胱癌細胞に由来する細胞外小胞の凍結破砕のためのプロトコルを提示する。細胞外小胞は、細胞に由来する膜限定小胞であり、細胞外空間に放出され、細胞間通信において役割を有する。細胞外小胞内では、エキソソーム、微小小胞、アポトーシス小体の3つの集団を、その起源、大きさ、分子組成によって異なるもの判別します。
細胞外小胞の分子組成は、ドナー細胞の分子プロファイルを反映し、レシピエント細胞における生物学的プロセスを妨害する。しかしながら、細胞小胞の制限膜の組成は、レシピエント細胞膜との相互作用にとって極めて重要である。制限膜の組織を分析するには、細胞外小胞を最初に単離し、次いで凍結破壊技術にアプローチしなければならない。
凍結破壊は、小胞を含む生体膜の2次元組織を研究することに専念する電子顕微鏡技術である。凍結破砕のステップは、試料の急速凍結、標本の破砕、凍結破断面のレプリカの作成、および生物学的物質を除去するためのレプリカの洗浄である。レプリカは最終的に透過型電子顕微鏡で可視化されます。
私たちの目的は、凍結破壊技術を使用して、膜の形状、サイズ、および組成の観点から微小小胞を特徴付けることでした。細胞インキュベーター内で細胞を成長させることから始めます。顕微鏡下で細胞を検査し、その変動性とコンフルエントを確認します。
マイクロベシクルを含む培養培地をチューブに集め、300g力で10分間遠心分離する。上清を採取する。続いて、上清を2000g力および10,000g力で遠心分離する。
その後、微小小胞を示す白っぽいペレットについてチューブの先端を観察します。上清を慎重に取り除きます。1.5ミリリットルのPBSを加え、微小小胞を含むペレットを再懸濁する。
その後、10, 000 g力で遠心分離します。白っぽいペレットを観察します。上清を取り除き、固定液を静かに加える。
摂氏4度で20分間放置する。次に固定液を取り出し、洗浄バッファーを加えてペレットを再懸濁せずにすすいでください。摂氏4度で10分間放置する。
洗浄バッファーを除去し、ペレットに30%グリセロールを加えます。ペレットを均質な懸濁液に再懸濁し、摂氏4度で30分間インキュベートする。センターピットできれいな銅キャリアを準備し、しかめ面と液体窒素でフラスコを現像します。
顕微鏡下で、試料を銅キャリアの中心ピットに移す。固化したフロンを混ぜて液化する。ピンセットでキャリアの外輪をつかみ、冷却されたフロンに浸します。
8秒後、担体を液体窒素で展開フラスコに素早く移す。クライオを卑劣にマークし、それを冷やす。液体窒素下で担体を卑劣な場所に集めて閉じ、凍結破砕するまで液体窒素容器に保管する。
メーカーの取扱説明書に従って凍結分率ユニットを準備します。真空システムを起動し、ユニットチャンバをマイナス150°Cまで冷却します。凍結サンプルを含む銅キャリアを凍結分別ユニットに移します。
ナイフの温度をマイナス100°Cに設定し、真空になるまで待ちます。サンプルの表面が滑らかになるまでナイフの電動運動をオンにして、サンプルの切片化を開始します。破砕のためにナイフの電動運動をオフにし、ナイフのゆっくりとした手動制御で進んでください。
プラチナシャドウイングを45度の角度で進めます。ハイテンションをオンにして、プラチナガンへの電流を増やします。プラチナの火花がサンプルに影を落とし始めるはずです。
水晶振動子の厚さモニター上の白金の位置を監督します。白金の推奨厚さは2.5ナノメートルです。電流とハイテンションをオフにします。
90度の角度でカーボンシャドウイングを進めます。ハイテンションをオンにし、カーボンガンへの電流を増やします。炭素の火花がサンプルに影を落とし始めるはずです。
2.5ナノメートルの炭素が得られたら、電流と高張力をオフにします。レプリカを含むサンプルを凍結破壊ユニットから二重蒸留水で満たされた12バルブプレートに移します。レプリカは、キャリアが沈む間、水面に浮かびます。
ワイヤーループでレプリカをハイポクロライトナトリウムで満たされた12バルブプレートに移し、一晩インキュベートします。レプリカを二重蒸留水で洗う。それらをメッシュ銅TM格子に集め、空気中で2時間乾燥させます。
透過型電子顕微鏡を使用してレプリカを画像化し、顕微鏡写真を取得します。レプリカと顕微鏡写真を正確に解釈するには、命名法に関する適切な向きのガイドラインに従ってください。レプリカの分析は、単離馴化培地が小胞の富化画分を含むことを示した。
単離された小胞は、3つ以上のクラスターに集められるか、または非常に個々に分布した。小胞は球状であった。小胞の直径は、微小小胞の直径に対応していた。
凍結破砕はまた、微小小胞膜の2次元組織を明らかにした。微小小胞の外胞期は滑らかで均一な外観を有し、プロトプラスト相では膜間粒子を観察した。膜間粒子は散発的に現れ、これは、癌物質細胞から単離された微小小胞が低量の膜タンパク質またはタンパク質集合体のみを含むことを意味する。
要約すると、提示されたプロトコールにおいて使用される凍結破壊技術は、細胞外小胞の特性評価のための最適な技術であることが証明され、細胞外小胞の他の集団の評価に使用することができる。凍結破壊技術の重要な利点は、細胞外小胞の生物学的機能を決定する小胞制限膜の内部組織を解決するその力である。
