This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

1。システムのキャリブレーション<ol><li>点広がり関数（PSF）のキャリブレーション<ol><li>蒸留水90μlの中で30nmの蛍光ビーズ溶液10μl（約5μM）を希釈し、次いで20分間溶液を超音波処理する。四角（1センチ×1cm）にアガロースゲル（10％）と預金ゲルの上に溶液10μlの部分をカット。 2センチメートルペトリ皿の底ガラスのゲルの一部を覆す、ガラスのドロップを絞る。 </li><li>買収の設定をオンにし、ホルダーにサンプルを入れ、カメラの露出とEMgainを設定（100ミリ1000は良いパラメータであるが、システムに応じて最適化）とクールダウンするためにカメラを待つ。 </li><li> 100ミリ秒、1000カメラEMgain、取得モードに設定し、カメラの露出はセーブの設定の転送、100反復と自動フレームに。 </li><li>ゲルの境界に接眼レンズと透過光のフォーカスを使用して、その後、ゲルの中央に目標を移動し、フォーカスとSTAを調整レーザーアライメント手順RT（LAS AFで、「TIRFのセットアップ」を選択し、オートアライメント手順に従ってください）​​。 </li><li> 100フレームを取得し、複数の単一のスポットを獲得するために、ステップを5-6回繰り返し、基準として、（通常はビーズの集合体を表していること）明るいスポットに焦点を正確に、孤立した単一のスポットを有する視野を検索します。 </li><li>データ処理プログラムに獲得したシリーズをインポートし、時間内に（ 図1A）スタックを平均化し、単一の孤立したビーズを選択します。粒子凝集を回避するために、最小のものを選択するように注意してください。 </li><li> （Matlabの中で材料におけるICS-Matlabのツールでの）コマンド「gaussfit」を使用してガウス関数で選択された強度分布（単一ビーズプロファイルの一例を図1Bに示されている）を取り付け。得られた残差を調べることによって適合度を確認します（対応する残差と当てはめられたガウス分布の例は、私が提示されているn 図1B）。 </li></ol></li><li>カメラ較正<ol><li>カメラの電源を入れ、カメラが冷えるのを待ちます。 （32×128にトリミングモード、ROIサイズにつまり 、使用したカメラのために私たちは1,000 0.5ミリ秒、カメラEMgainへの露出を設定し、取得モード、万回の繰り返し）の設定、カメラの取得を、設定し、カメラの背景の取得を開始信号。 </li><li>インポートは、データ処理プログラムにフレームシリーズを取得しました。カメラの背景は、チップの選択された領域でほぼ平坦であることを確認するために、各画素内の平均強度を計算し、検査します。カメラの背景は通常、境界線にバイアスされているため、クロップドモードでは、各フレームの最初と（ROIのサイズに応じて3から10）最後の数本の水平線を削除します。 </li><li> （Matlabのコマンド「シーッ」を使用して）スタック取得された画像に（また、デジタルレベル、DLが定義されている）値のヒストグラムを作成し、対数をプロットする（Matlabの中でsemilogyのコマンドを使用して）周波数を生じたの。カメラ背景のDL分布の一例を図2に示されている。 注：カメラがうまく機能している場合は、プロットは対数スケールで指数関数的減衰（負の傾きを持つ行が続くゼロの光子に関連付けられた値の分布を表す約ガウスピーク（対数スケールで放物線プロファイル）を表示します1）光子（ 図2）に関連付けられた値の分布を表す。指数部の減衰定数は、それぞれ単一光子をカメラによって割り当てられたDLの推定を表している、特に、中心とガウス関数の分散は、それぞれ、カメラのオフセットとの誤差を表す。 MATLABで材料をサポートするスクリプトのセクション「CalibrateCamera &quot;を使用します。 </li><li>選択したすべてのカメラEMGainとゲインのための操作を繰り返します。 </li></ol></li></ol>ラベル付き2。細胞調製<ol><li> （1,2-dioleoyl- のsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン）、脂質取り込み36に必要なリポソームを調製DOPEの別途の1mgを溶解するために、DOTAP（1,2 -ジオレオイル-3 -トリメチルアンモニウム-プロパン）1mgを、クロロホルム1ml中PPE-ATTO488 1mgの。 24時間、真空下で一緒に0.5 DOPE溶液を加え、DOTAP溶液0.5ml、及びPPE-ATTO488溶液25μlとドライを混ぜる。 HEPES緩衝液を20mM、40℃で15分間、15分間、超音波処理のための渦の0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>セルを製造するために、PBSでコンフルエントCHO-K1（チャイニーズハムスター卵巣）のP100ディッシュを3回洗浄、5分間インキュベーター内トリプシンおよびストアの1ミリリットルを追加します。 10％のFBSを補充したDMEM / F12培地9mlを加える剥離細胞を一時停止し、同培地800μLを含むペトリ皿に細胞溶液150μlをシード。 </li><li> 37℃で24時間、5％CO 2インキュベータで保管してください。脂質取り込みのために、500細胞培地を交換してください無血清培地μL; 30分後、リポソーム溶液2μlを追加します。およびPSBで15分間洗浄した後に画像化するための新しいDMEM / F12培地を追加します。 </li><li>トランスフェクションのために、イメージングの前にインキュベーター内でのTfR-GFPプラスミドとストアの24時間を使用して、リポフェクタミンプロトコル（メーカーの指示）に従って、細胞をトランスフェクト。 </li></ol> 3。データ収集<ol><li>セットアップの準備<ol><li>顕微鏡をサーモスタットするためには、実験前の24時間は、培養器の電源をオンにします。 </li><li>最速の達成可能な取得時間を適用するためには、トリミングセンサーモードでの作業（導入を参照）、電池（カメラ2）を選択するイメージング（カメラ1）と第2のカメラのための最初のカメラを使用しています。セットアップ設定の方式は補足図S1に示す。その後、顕微鏡上の2台のカメラのターンを合わせ、カメラが冷えるまで待ちます。 </li><li>両方のカメラ透過光イメージングのためのパラメータに設定します（ つまり、 </em露光時間&gt;、20ミリ秒、EMゲインのための1）、明視野モードで顕微鏡を置く。 </li><li>ホルダーにサンプルを入れて、接眼レンズを使用して焦点を合わせる、カメラ1に光を送信し、静かにのみ細胞イメージング（ここでは32×32ピクセルのROI）に使用されるROIに光を可能にするスリットを押してください。 </li><li>その後の参照を持つために、カメラ2を制御するソフトウェアでROIを描き、選択した領域内のセルを移動し、カメラ2に光を送る。 </li></ol></li><li>イメージング（ 図3A） <ol><li>まず第一に、あなたのセットアップの手順に従って全反射レーザーの位置を合わせます。私たちのセットアップでは、「TIRFのセットアップ」を選択し、オートアライメント手順を開始します。レーザーが整列されると浸透深さ（約70℃）の70ナノメートルに設定してください。 </li><li>カメラ1とカメラ2の両方に100に70ミリ秒とEMGainに露光時間を設定します。次に、カメラ1を用いて細胞を選択し、カメラ2に光を送信し、正確に細胞膜を当てる。 CAの最小露出を設定しますメラ2、千EMGain、クロップドセンサーモード、10 5回の繰り返しとファイル（柔軟なイメージ輸送システム、容易に管理できる形式）が収まるように自動保存を設定しますが。 </li><li>画像シリーズを記録する取得を開始します。 8-10細胞を取得するために最後の2つの手順を繰り返し、その後、新しいセルを取得する前に温度安定化を可能にするためにゲインとトリミングされたモードを解除してください。 </li></ol></li></ol>イメージングから平均二乗変位の4。計算（I MSD） 注：以下のプロトコルは、直接生データに適用することができる。同時に、全体のプロトコルは、MATLABでかつSimFCSの両方でシミュレートされたデータの取得のために有効です。対応するチュートリアルへのリンクが「マテリアル」のセクションに記載されています。 <ol><li> MATLABが計算<ol><li> ImportImageSeriesスクリプトを使用してMATLABに獲得したシリーズをインポートします。共同を使用して時間内に各画像の平均輝度を計算するmmand最初の2次元上の意味と、得られたベクターを見るために、プロットを使用しています。 </li><li>光退色の10％以上が存在する場合、一連の破棄またはそれらの最初の部分を取り除く。それが低い場合は、37の前に示したように、各画像の平均輝度を減算することにより相関関数への影響を補正しようとする。 </li><li>第三の次元に平均値を用いて各ピクセルの平均強度を計算し、画像を生じた参照。 注：特に注意人工相関を避けるために必要とされる。実際、以前に同様の技術38、セルの枠線のためだけでなく、フォーカス小胞の外に示したように強い相関をもたらす可能性があります。平均画像の検査がセルの枠線やフォーカス小胞の外に明らかになった場合、それ以外の買収を破棄関与する領域を除外してみてください。この不動の構造の影響を補正するために、各画素39からの平均時間的強度を差し引く。 </li><li> Tを計算する機能CalculateSTICScorrfuncを使用して、彼の時空間相関（G（ξ、χ、τ））。 Gは（ξ、χは、0）が低いため、光領域におけるショットノイズの相関は、Gを支配しているため（0,0,0）を外します。による検出器への相関が測定され、腰を大きくすることにより、τ= 0のため、G（ξ、χ、τ）を変形させることができ、露光時間の間にG（±1,0,0）、および粒子の動きを支配する（この効果はτのために消える&gt; 0）34。 </li><li>平均G（ξ、χ、τ&gt; 0）材質のサポートに「LogBinStack」機能を使用することにより、ノイズを低減してから関数を使用して結果G（ξ、χ、τ）に合うように対数時間ビンを使用して「gaussfit」の私 MSD（結果の配列の2番目の列）を回収するための材料におけるICS-Matlabのツール。 </li><li>時間の関数として得られ腰σ（τ）2（I MSD）をプロットします。データがあまりにもうるさいであれば、acquの数を増やそう赤外発光ダイオードのフレームは、一緒にレーザーパワー、平均よりG（ξ、χ、τ）を増加させる。 </li></ol></li><li> SimFCSによる計算<ol><li> BioFormatインポータープラグインを使用してImageJを、取得したファイルを開き、Tiffをシーケンスとして取得されたシリーズを保存します。 </li><li>オープンSimFCSとRICSツールと[ファイル]&gt; [インポート複数の画像（補足図S2）を選択します。 </li><li>フィットを選択し、正しい収集パラメータを挿入し、フィットウィンドウ（補足図S3）を閉じる。 </li><li>ディスプレイ&gt;平均強度&gt; CH1を選択して、（補足図S4）の光退色の存在を確認。 </li><li>光退色の10％以上が存在する場合は、シリーズを破棄するか、再びシリーズの最初の部分を除去し、画像シーケンスの可能な負荷である場合。 </li><li>それを漂白すると10％未満の[ツール]の場合&gt; 私は 、MSD&gt;パラメータの設定、左への投資効果（ROI）]パネルで設定、「使用して、移動平均」をチェック特派時間は（粒子が1μm2秒-1 10秒の時間が良い移動平均である時に移動するための）特性拡散時間よりも高いことが、移動平均気をつけて、フレームのアンバー</li><li> [ツール]&gt; [iMSD&gt; 私 MSD（補足図S5）とフィット感を計算し、メモ帳から私 MSDをエクスポート（補足図S6）。 </li></ol></li></ol> 私 MSDから拡散法第5の計算<ol><li>インターセプト（σ0 2）を外挿する最初のいくつかのポイントを取り付け（5ポイントが通常は十分ですが、より多くのポイントは、彼らが線形挙動を示す場合装着することができる）と、以前に測定されたPSF 2で、この値を比較します。それらが同等である場合、単離されたフルオロフォアのダイナミクスが守られている。これとは対照的に、σ0 2 &gt;&gt; PSF 2トライのことを確実にするために高速取得する場合は、隠れダイナミクスは34存在しない。 </li><li> （概要を参照）、式3および4を使用して、見かけの拡散係数（D アプリ ）と平均変位（R）を計算します。 </li><li> FCS 12（ 図3D）ベースのスポット変動を用いて測定されるものと同程度の拡散の法則を得るためのRの関数としてプロットD アプリ 。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

単一粒子追跡（SPT）は、分子動力学を研究するための最も一般的な戦略の1つを表し、それは粒子軌道を測定するという大きな利点を有する。これは、複雑なシステムでさえ、いくつかの標識された粒子の挙動をプロービングを可能にする。しかし、SPTは、典型的には、プローブと、非常に明るいラベルの低密度を必要とするこの利点に到達する。特に、高い時間分解能（マイクロ秒の範囲）...

シンガーとニコルソンによるオリジナル「流体モザイク」モデルから始めて、携帯形質膜の画像を連続的に細胞骨格と脂質ドメイン1,2の新たな役割を含めるために、過去数十年の間、更新されています。 最初の観察は、膜タンパク質のかなりの割合が不動3-5であることを発表（FRAP）の光退色後蛍光回復により得た。これらの先駆的な研究は、非常に有益なものの、FRAPのセットアップの比較的乏しい空間での分解能（ミクロン）と時間（秒）に苦しんだ。また、アンサンブル平均測定値である、FRAP、単一分子の挙動についての情報を与えることに欠けている。 この文脈において、特に非常に明るいタグ（一度に拡散工程つの分子の研究を可能にする）を有する単一の分子を標識する可能性は非常に成功している。特に、押してマイクロ秒の時間スケールへの単一粒子追跡（SPT）アプローチの時間分解能、楠見ら大幅に膜生理学6におけるアクチンベースの膜骨格の役割の認識に貢献した脂質とタンパク質ダイナミクスの未知の機能へのアクセスを獲得7。これらの知見は、脂質およびタンパク質の拡散がアクチン系骨格によって調節される、いわゆる「ピケットフェンス」モデルが、生成された。しかし、SPT多くの実験の問題によって提供される情報の膨大な量にアクセスするためにアドレス指定されなければならない。特に、標識操作は、一般的に、生産、精製、およびシステムへの標識種の導入のような多くのステップによって構成されています。さらに、大きなラベルは、量子ドット、または金属ナノ粒子のような、多くの場合、ミリ秒以下の時間スケールに達するために必要とされ、ラベルによる標的分子の架橋は、多くの場合において回避することができなかった。最後に、多くの軌跡統計的基準に適合するために記録されなければならないし、同時にラベルの低密度は、追跡を可能にするために必要とされている。 SPT、蛍光相関分光法（FCS）と比較して、これらの欠点の多くを克服し、分子動力学を研究するための非常に有望なアプローチを表す。実際には、FCSが一過性にトランスフェクションされた細胞に蛍光タンパク質タグ化分子のダイナミクスを研究するために有効に、薄暗い、緻密なラベルでもうまく動作します。また、限られた時間の中で高い統計を達することができます。最後に、ラベルの「高」密度にもかかわらず、FCSが単一分子情報を提供します。おかげで、これらすべての特性のために、FCSは非常に簡単なアプローチを表し、広範囲にモデル膜において、生細胞8-10に両方の脂質およびタンパク質のダイナミクスを研究するために適用されている。多くの異なるアプローチは、分子拡散の詳細を明らかにするためにFCSの能力を増加させるために提案されている。例えば、それはshにあっ異なるサイズの観察領域にFCSを実行することによって、一つは分子運動11,12の「FCS拡散法」啓発隠された機能を定義できることを自分自身。サイズが多様であることに加え、焦点領域も13重複した行14-20または高速カメラ21,22共役一緒に空間内を移動。これらの「時空間」相関アプローチを用いて、いくつかの膜成分の関連する生物学的パラメータを定量的にこのようにして、膜の空間的組織への洞察をもたらす、モデル膜と実際の生物学的なものの両方に記載されている。 しかし、すべてのFRAPとFCS用途でこれまでに説明した焦点領域の大きさを克服することができない空間分解能の限界を表している。いくつかの超解像画像化方法は、最近、この制限を回避するために開発されている。いくつかは、そのような確率論的光学再構築顕微鏡（STORM）として、ローカライズの精度に基づいています&lt;SUP&gt; 23,24、光活性化局在化顕微鏡（PALM）25、蛍光PALM（FPALM）26、及び単一粒子追跡PALM（sptPALM）27：各スナップショットに必要な光子の比較的大きな量が、しかしながら、時間分解能を制限する少なくとも数ミリ秒、これらの方法は、従って、インビボでのそれらの適用を妨げる。 対照的に、超解像イメージングのための有望な代替手段は、空間的に誘導放出の枯渇法（STEDまたは可逆的飽和性光学蛍光遷移（RESOLFT））28,29で蛍光発光を変調することによって開かれている。これらのアプローチは、高速走査型顕微鏡および検出システムを使用する可能性を有するだけでなく、回折限界以下の観察体積の整形を組み合わせる。蛍光変動解析と組み合わせて、STED顕微鏡を直接脂質およびpのナノスケール時空間的動態を探査することができ生細胞膜30,31中roteins。 STED顕微鏡ベースの同一の物理量は、生細胞中の蛍光標識膜タンパク質及び/又は脂質のダイナミクスを研究するのに適している改変された時空間画像相関分光法（STICS 32,33）の方法によって得ることができるや商業顕微鏡による。ここで紹介する実験プロトコルは、いくつかの手順によって構成されています。最初のものは膜上の関心領域の高速撮像を必要とします。そして、画像の得られる積層体は、平均空間 - 時間相関関数を計算するために使用される。 -平均変位プロット対 -相関関数のシリーズを嵌合することにより、分子の「拡散法は、「見かけの拡散係数（D アプリ ）の形態の撮像から直接得ることができる。このプロットは、批判的に分子によって探求、環境に依存しており、直接、実際の拡散モードを認識することができます興味のある脂質/タンパク質の。 より詳細には、先に示した34ように、取得した画像シリーズの時空間的自己相関関数は、批判的に収集された画像シリーズ内を移動する分子のダイナミクスに依存する（同じ論法がラインの取得に適用することができることに注意してください空間内のただ一つの次元が考慮されている）。特に、本発明者らは、のように、相関関数を定義する。 <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> （1） どこ<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" />位置xで測定された蛍​​光強度を表し、yおよび時間tにおける、 <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" />そして<img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> x方向の距離を表し、それぞれy方向、 <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" />タイムラグを表し、そして<img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" />平均を表す。この関数は、のように表すことができる。 <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> （2） &#39;N&#39;は、観察領域内の分子の平均数を表す<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" />空間における畳み込み演算を表し、そして<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" />楽器の腰の自己相関を表しています。この後者は、光学/録画設定に単一の発光体の光子が空間に広がっているかの尺度として解釈することができる（いわゆる点広がり関数、PSF、遺伝子よくガウス関数で近似ラリー）。最後に、 <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" />距離で粒子を見つけるために確率を表す<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" />そして<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" />時間遅延の後に<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> 。私たちは、粒子が全ての方向にランダムに移動し、正味フラックスは存在せず、この関数はまた、よく分散が移動する粒子の平均二乗変位（MSD）として識別することができ、ガウス関数で近似される拡散動力学を考慮した場合。従って、相関関数（の腰とも呼ば<img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ）、粒子のMSDの和楽器の腰のように定義することができ、ガウスフィットによって測定することができる各時間遅延のための相関関数のティン。測定された私 MSD移動分子の見かけの拡散係数を計算するために使用することができ<img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" />と平均変位<img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" />として： <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> （3） <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> （4） 使用された実験のセットアップには、いくつかの考慮事項は、次のセクションを通して読者を導くことができる。選択的に生細胞の基底膜上のフルオロフォアを励起するために、私たちは、商業のTIR蛍光（TIRF）顕微鏡（詳細は材料セクションを参照のこと）を使用して、全反射（TIR）照明を使用します。また、順番​​に目を収集する電子蛍光当社は高倍率の対物レンズ（100X NA 1.47、高開口数を全反射照明に必要とされる）と、EMCCDカメラ（内蔵さ16μmの画素の物理サイズ）を使用します。 100nmのピクセルサイズに到達するために、私たちは、1.6Xのさらなる拡大レンズを適用する。以下に説明するように、1ミリ秒以下の時間分解能を適切に100nm未満の速い膜脂質の動力学を記述するために必要とされるであろう。この時間分解能を達成するために、私たちは、カメラ（512×512）のチップ全体よりも小さい関心領域（ROI）を選択する必要があります。このように、カメラは、時間分解能を増加線の数の減少を読み取る。しかし、この読み出し領域でフレーム時間は、カメラの読み出しチップへの暴露からの電荷をシフトするために必要な時間によって制限されると、512×512ピクセルEMCCDミリ秒のオーダーで通常である。この制限を破ったために、新しい技術は、wは、ROIラインのみの代わりに、フレーム全体をシフトできます（私たちのEMCCDにクロップドセンサーモードと呼ばれる）が露出し、チップサイズの実用的な効果的な減少番目。この設定を有効にするには、ROIの外側のチップは、光路に取り付けられたスリットのカップルによってカバーされなければならない。時間分解能ダウン10 -4秒にこのセットアップのおかげで達成することができる。 「議論」のセクションで説明したように、このアプローチは、多くの異なった実験装置と結合することができること、しかし、注意してください。 この方法の実証は両方ATTO488を使用することにより、生きた細胞内で提供される1 -パルミトイル-2-ヒドロキシのsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン（ATTO488-PPE）及びトランスフェリン受容体のGFP標識された変異体（GFP-標識されたのTfR）。以前に30,35を報告したようにATTO488-PPEの場合、このアプローチは成功し、大部分は自由拡散を示す平均変位の関数としてほぼ一定のD アプリを回復することができます。対照的に、TfRは-GFPは減少Dを示している<su部分的に閉じ込められた拡散6を示唆して平均変位の関数としてb&gt;のアプリ。また、後者の場合には、ローカル拡散定数と膜面上の多数のミクロンを超える平均閉じ込め領域を定量化することが可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

それは、空間分布および脂質やタンパク質のような膜成分の動きが多くの細胞機能の調節に重要な因子であることがますます明らかになった。ただし、高速ダイナミクスと関係する小さな構造に起因し、非常に高い時空間的分解能は、分子の実際の行動をキャッチするために必要とされている。ここでは、高時空間分解能で生きた細胞内の蛍光標識形質膜タンパク質や脂質のダイナミクスを研究するための実験プロトコルを提示する。注目すべきことに、このアプローチは、各分子を追跡する必要がないが、それは、膜の所定の領域内のすべての分子を用いて母集団の挙動を計算する。出発点は、膜上の所定の領域の高速撮像である。その後、完全な空間時間的自己相関関数は、例えば、それぞれ2個、3個、nは繰り返しの時間遅延を増加させるで取得された画像を相関計算される。それは、幅があることを証明することができます空間的自己相関関数のピークの拡散による粒子移動の関数として増加する時間遅延で増加する。そのため、自己相関関数の一連のフィッティング（iMSD）を画像化するから、正方形の変位を意味し、実際のタンパク質を抽出することができ、ここでは平均変位対見掛け拡散係数の形で提示。これは、ナノメートルの精度で単一分子の平均ダイナミクスの定量的な見解が得られます。標識されたトランスフェリン受容体（TfRは）及びATTO488のGFPタグ付き変異体を用いて、1 -パルミトイル-2 -ヒドロキシ- のsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン（PPE）は、上のタンパク質および脂質拡散の時空間レギュレーションを観察することが可能であるマイクロ対ミリ秒の時間範囲の程度の大きさの膜領域を含む。

楽器の腰を較正するために、単一の蛍光ナノビーズの画像は、プロトコルのステップ1.1に記載のように措置することができる。これらのビーズの典型的な蛍光画像を図1に示されている。2Dガウス関数による強度分布のフィッティングは、バック良い残差を提供し、270 nmでの楽器のウエストを測定することを可能にする。この値は、レイリーの式で推定し、予想される回折限界と?...

Watch this Scientific Journal Video about From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope at JoVE.com

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

from-fast-fluorescence-imaging-to-molecular-diffusion-law-on-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K ビュー.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

ビデオ: From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

生物工学

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.