この研究は、中国国立自然科学財団（助成金21576279、20906076）およびKRIBB研究イニシアチブプログラム（KGM2211531）によって支持された。

1.竹の加水分解物の調製<ol><li> 5gの竹粉を40mLのNaOH溶液に添加して、250mLフラスコ中で最終濃度10％（g / g）にする。 0.05Mから0.50Mの範囲の一連のNaOH溶液を0.05M刻みで使用する。 <ol><li>混合物を水浴中で60℃または100℃で60分間インキュベートする。 121℃でオートクレーブ中でインキュベートする。 </li></ol></li><li> インキュベーション後、混合物を室温で4時間放置する。次に、上清を除去する。 100mLの新鮮な水を加え、混合する。 <ol><li>上清のpHが6.8に達するまで、この洗浄を5〜6回繰り返す。得られた固体を酵素加水分解の次の工程に使用する。 </li></ol></li><li>加水分解のために、98％H 2 SO 4を用いて50mLの上記混合物をpH5.0に調整する。次に、200枚の濾紙活性（FPU）/ mLセルラーゼを0.5mL加える。 注：セルラーゼとバンブーシュウの最終比竹1g当たり20FPUとする。 </li><li>混合物をシェーカーで50℃で36時間インキュベートする。 注：加水分解後、いくらかの固体が混合物中に残る。 </li><li> 7,690×gで5分間遠心分離して透明な加水分解物を得る。 </li><li>屈折率検出器とフォトダイオードアレイ検出器を備えた高圧液体クロマトグラフシステムでグルコース、キシロースなどの化学物質を定量する。 HPX-87Hカラム（300 mm×7.8 mm）および5 mM H 2 SO 4溶液の移動相を0.8 mL / minの流速で使用してください。 </li><li> 大量の加水分解物を調製するには、30Lステンレススチールタンク内で2kgの竹粉と18Lの0.25M NaOHを混合します。 <ol><li>タンクをオートクレーブ内で121℃で60分間インキュベートする。インキュベーション後、混合物を60Lのプラスチックタンク中の40Lの水で洗浄する。この洗浄を5回繰り返す。 </li><li>洗浄した竹の総量を20Lに調整するには水を使用します。98％H 2 SO 4を用いて混合物のpHを5.0に調整する。 </li><li>混合物が十分に分配されることを確実にするために機械的撹拌機を備えた改変振盪水浴中で混合物を酵素的に加水分解する。 200 FPU / mLセルラーゼ200 mLを添加し、混合物を50℃で36時間インキュベートする。 </li><li>加水分解後、混合物を4,700×gで10分間遠心分離する。 </li></ol></li></ol> 2.野生型K.ニューモニエによる2,3-ブタンジオール産生<ol><li>培地調製のための溶媒として3Lの竹加水分解物を使用する。 </li><li> 4g / Lのコーンスティープリカー、2g / L（NH 4 ） 2 SO 4、6g / LK 2 HPO 4,3g / L KH 2 PO 4および0.2g / L MgSO 4を含有する発酵培地を調製する。 2.5M NaOHを用いて培地のpHを中性に調整する。発酵のために3Lのオートクレーブ発酵培地を含む5Lバイオリアクターを使用する。 </li><li> K. pneumoniaeを使用する細胞を-80℃の低温冷蔵庫に保存した。 </li><li>種培養のために、50mLのLuria-Bertani（LB）培地を含む250mLフラスコを200rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートする。トリプトン10g / L、酵母エキス5g / L、NaCl 10g / Lを含むLB培地を使用する。 注：種培養物の細胞密度はOD 2（600nmでの光学密度）に達するはずです。 </li><li> 50mLの種培養液の1つのフラスコにバイオリアクターを接種する。 pH 6.0および37℃で培養液を維持する。 2L /分の空気補充速度および250rpmの攪拌速度を使用して、微好気性条件を作り出す。 </li><li> 発酵中に2時間ごとに5 mLの試料を採取し、高圧液体クロマトグラフィーで分析して、ブロス中の化学物質濃度を決定する。 <ol><li> MFCS / DAを使用してオンラインでバイオリアクターに加えたアルカリをモニターする。 注：有機酸は発酵プロセスで生成されます。培養物のpHを安定に保つためにNaOHを添加する。添加されるアルカリの量は、生成される酸の量を表す。アルカリ添加ラインが不安定になると、炭素源の枯渇または細胞死のためにプロセスが終了する。 </li></ol></li></ol> 3. K. pneumoniaeの budC変異体によるR-アセトイン生産<ol><li> 4g / Lのコーンスティープリカー、2g / L（NH 4 ） 2 SO 4,3g / L酢酸ナトリウム、0.4g / L KCl、0.1g / L MgSO 4を含有するアセトイン生成用培地を調製する。 </li><li> R-アセトイン産生にはK.pneumoniae-ΔbudCを用いる。ステップ2.4-2.5を繰り返します。 注： budCは2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをコードする。 K. pneumoniae-ΔbudCは、2,3-ブタンジオール脱水素酵素活性を失い、2,3-ブタンジオールの代わりにR-アセトインを生成する。 </li><li> pH 6.0および37℃で培養液を維持する。 4L /分の空気補給速度と摂食量好気的条件である450rpmの速度。 注：酸素補給は、2,3-ブタンジオール製造よりも高い。 </li><li>ステップ2.6のようにサンプルをアッセイする。 </li></ol> K. pneumoniaeの budA変異体による2-ケトグルコン酸生産<ol><li> 2-ケトグルコン酸の生産には、 R-アセトイン生産と同じ培地を使用する。 </li><li> 2-ケトグルコン酸の製造にはK. pneumoniae-ΔbudAを使用する。ステップ2.4-2.5を繰り返します。 注： budAはα-アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする。 K. pneumoniae-ΔbudAは、α-アセトラクテート脱炭酸酵素活性を失い、グルコースを基質として2-ケトグルコン酸を生成する。 注：2-ケトグルコン酸合成は、酸性条件依存プロセスである。 2-ケトグルコン酸生産のための2段階発酵が開発されている10 。第1段階では、種培養液をバイオリアクターに接種する。 </li><li&gt; pH 7.0および37℃で培養液を維持する。空気補給速度4L /分および500rpmの攪拌速度を使用する。 注：これらの条件では、細胞は非常に速く増殖する（細胞密度は約4時間でOD 7に達する）。次に、発酵は第2段階に進み、その間、培養pHは5.0に低下する。酸は添加されない。培養物中で産生される有機酸は自然にpHを低下させる。これらの酸性条件では、細胞増殖は停止するが、2-ケトグルコン酸が合成され、ブロス中に蓄積する。 </li><li>ステップ2.6のようにサンプルをアッセイする。炭素源として竹の加水分解物を使用する。 注：培地中のグルコースは2-ケトグルコン酸に変換され、キシロースはキシロン酸に変換されます。こうして、2-ケトグルコン酸とキシロン酸との混合物が得られる。 </li></ol>

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	<li>Zeng, A. P., Biebl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+chemicals+from+biotechnology:+the+case+of+1,+3-propanediol+production+and+the+new+trends.">Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).</li><li>Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dihydroxyacetone+kinases+I+and+II+in+the+dha+regulon+of+Klebsiella+pneumoniae.">Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae.</a> J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).</li><li>Celi&#324;ska, E., Grajek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+2,3-butanediol-current+state+and+prospects.">Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects.</a> Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).</li><li>Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+2,+3-butanediol+stereoisomer+formation+in+Klebsiella+pneumoniae.">Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).</li><li>Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+recombinase+assisted+gene+replacement+in+Klebsiella+pneumoniae.">Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).</li><li>Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategy+to+improve+efficiency+for+gene+replacement+in+Klebsiella+pneumoniae.">New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RecBCD+in+Klebsiella+pneumoniae+by+Gam+and+its+effect+on+the+efficiency+of+gene+replacement.">Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement.</a> J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-acetoin+accumulation+and+dissimilation+in+Klebsiella+pneumoniae.">R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).</li><li>Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Ketogluconic+acid+production+by+Klebsiella+pneumoniae+CGMCC+1.6366.">2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+fermentation+for+2-ketogluconic+acid+production+by+Klebsiella+pneumoniae.">Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae.</a> J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconic+acid+production+by+gad+mutant+of+Klebsiella+pneumoniae.">Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae.</a> World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+xylonic+acid+by+Klebsiella+pneumoniae.">Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).</li><li>Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+pretreatment+of+lignocellulosic+biomass+for+efficient+hydrolysis+and+biofuel+production.">Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production.</a> Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).</li><li>Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genus+Klebsiella.">The genus Klebsiella.</a> The Prokaryotes. , 159-196 (2006).</li><li>Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+microorganisms+able+to+produce+1,+3-propanediol+under+aerobic+conditions.">Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions.</a> World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).</li><li>Hong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+alkaline+pretreatment+on+corn+stover+for+enhanced+production+of+1.3-propanediol+and+2,+3-butanediol+by+Klebsiella+pneumoniae+AJ4.">Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4.</a> Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).</li><li>Pienkos, P. T., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pretreatment+and+conditioning+processes+on+toxicity+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysates.">Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates.</a> Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

K. pneumoniaeは、 Enterobacteriaceae科のKlebsiella属に属する。 K. pneumoniaeは土壌、植生、水などの自然環境に広く分布している14 。本研究で用いた野生型K. pneumoniae株は土壌から分離され、1,3-プロパンジオール生産に用いられた15 。 K. pneumoniaeおよびこの種の突然変異体は、異なる条件下で多くの化学物質を産生する。 <p c...

Klebsiella pneumoniaeは、好気性および嫌気性条件下で良好に生育する細菌である。 K. pneumoniaeは、多くの化学物質を生産するために使用される重要な産業微生物です。 1,3-プロパンジオールは、ポリトリメチレンテレフタレートを合成するためのモノマーとして主に使用される貴重な化学物質である。ポリトリメチレンテレフタレートは、1,2-プロパンジオール、ブタンジオールまたはエチレングリコール1よりも優れた特性を示す生分解性ポリエステルです。 1,3-プロパンジオールは、酸素制限条件下で基質としてグリセロールを用いて肺炎桿菌によって産生される2 。 2,3-ブタンジオールおよびその誘導体は、プラスチック、溶剤製造および合成ゴムの分野で用途があり、バイオ燃料として使用される可能性がある3 。グルコースを基質とすると、2,3-ブタンジオールは野生型株4の主要代謝産物である。 2,3-ブタンジオールはシンセシスピルビン酸から得た。まず、ピルビン酸の2分子が凝縮してα-アセト乳酸を産生する。この反応はα-アセト乳酸シンターゼによって触媒される。 α-アセトラクテートは、α-アセトラクテート脱炭酸酵素によってアセトインに変換される。ブタンジオール脱水素酵素によって触媒されると、 R-アセトインはさらに2,3-ブタンジオールに還元され得る。 K. pneumoniaeに適した効率的な遺伝子置換法が検討されており、多くの変異体が構築されている5,6,7。その2,3-ブタンジオール脱水素酵素活性を失ったbudC変異体は、培養液中に高レベルのアセトインを蓄積する。アセトインは、食品の風味を向上させるための添加剤として使用されます8 。 α-アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードするbudAが変異すると、2-ケトグルコン酸がブロス中に蓄積する。 2-ケトグルコン酸は、エリソルビン酸（イソアスコルビン酸）の合成に使用され、食品業界で使用される酸化防止剤9 。 2-ケトグルコン酸はグルコース酸化経路の中間体であり;ペリプラズム空間に位置するこの経路では、グルコースはグルコン酸に酸化され、さらに酸化されて2-ケトグルコン酸になる。ペリプラズムで産生されたグルコン酸および2-ケトグルコン酸は、さらなる代謝のために細胞質に輸送することができる。 2-ケトグルコン酸の蓄積は酸性条件に依存し、より高い空気補給は2-ケトグルコン酸産生に有利である10 。 gadによってコードされるグルコン酸脱水素酵素は、 グルコン酸の2-ケトグルコン酸への変換を触媒する。 K. pneumoniaeのgad突然変異体は、2-ケトグルコン酸の代わりに高レベルのグルコン酸を産生し、このプロセスもまた酸性条件に依存する。グルコン酸はバルク有機酸であり、セメント1の性質を高める添加剤として使用される1。グルコン酸へのグルコース酸化は、グルコース脱水素酵素によって触媒される。キシロースは、グルコースデヒドロゲナーゼの適切な基質でもある。キシロースが基質として使用される場合、 肺炎桿菌はキシロン酸12を産生する。 バイオマスを原料とした化学生産は、バイオテクノロジーの重要なテーマです13 。バイオマスの主成分は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンである。しかしながら、これらの巨大分子化合物は、ほとんどの微生物（ K. pneumoniaeを含む）によって直接的に異化されることはできない。バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースは、グルコースおよびキシロースに加水分解されなければならず、微生物によって使用されなければならない。リグノセルロース中のリグニンの存在は、酵素によるバイオマス加水分解を防止する保護バリアを作り出す。したがって、リグニンおよびヘミセルロースを除去し、セルロースの結晶化度を低下させる前処理工程は、常にマイクによるバイオマス利用中に行われるルーニズム。多くの前処理方法が開発されている：酸性、アルカリ性、アンモニアおよび蒸気の前処理が一般的である。 竹は熱帯および亜熱帯地域で豊富であり、重要なバイオマス資源です。ここでは、竹の加水分解物の調製と竹の加水分解物を用いた化学生産が提示されている

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">autoclave</td>
			<td style="width:136px;">SANYO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3780</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">bioreactor</td>
			<td style="width:136px;">Sartorius stedim biotech</td>
			<td style="width:119px;">Bostat Aplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">agitator</td>
			<td style="width:136px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">RW 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath shaker</td>
			<td style="width:136px;">Zhicheng</td>
			<td style="width:119px;">ZWY-110X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">high performance liquid chromatograph system</td>
			<td style="width:136px;">Shimadzu Corp</td>
			<td style="width:119px;">20AVP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">CR22G III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bamboo powder</td>
			<td style="width:136px;">purchased from Zhejiang Province, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>mesh number, 50</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">cellulase</td>
			<td style="width:136px;">Youtell Biochemical, Shandong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 PFU/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of chemicals by klebsiella pneumoniae using bamboo hydrolysate as feedstock

竹は重要なバイオマスであり、竹の加水分解物は化学生産の原料としてクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）によって使用される。ここでは、竹粉をNaOHで前処理し、中性pHになるまで洗浄した。前処理した竹粉にセルラーゼを添加して30g / Lのグルコースと15g / Lのキシロースを含む加水分解物を生成させ、炭素源として化学製造用の培地を調製した。微好気条件で培養すると、12.7g / Lの2,3-ブタンジオールが野生型K.ニューモニエによって産生された。好気的条件では、 K. pneumoniaeの budC突然変異体により13.0g / LのR-アセトインが生成された。 25.5g / Lの2-ケトグルコン酸と13.6g / Lのキシロン酸との混合物を、高空気補給を伴う2段階pH制御発酵におけるK.pneumoniaeのbudA突然変異体によって産生させた。発酵の第1段階では、培養物を中性pHに維持した。細胞増殖後、発酵nは第2段階に進み、その間に培養物は酸性になった。

このプロトコールでは、竹をアルカリで前処理した。 121℃および0.25M NaOHの最適インキュベーションパラメータを図1および2で決定した。前処理された竹を酵素的に加水分解し、加水分解物中で得られたグルコースおよびキシロース濃度を測定した。より高い温度が砂糖生産を好んだので、121℃が最適温度として選択された。加水分解物中で?...

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Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

竹粉をNaOHで前処理し、酵素加水分解した。竹の加水分解物は、 Klebsiella pneumoniaeによる2,3-ブタンジオール、 R-アセトイン、2-ケトグルコン酸およびキシロン酸生産のための原料として用いられた。

化学薬品の製造<em&gt;クレブシエラ・ニューモニエ</em&gt; Bamboo加水分解物を原料として使用する

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

production-chemicals-klebsiella-pneumoniae-using-bamboo-hydrolysate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

8.9K ビュー.  Chinese Academy of Sciences. 竹粉をNaOHで前処理し、酵素加水分解した。竹の加水分解物は、 Klebsiella pneumoniaeによる2,3-ブタンジオール、 R-アセトイン、2-ケトグルコン酸およびキシロン酸生産のための原料として用いられた。 

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

生物工学

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

生産と一価量子ドットの標的

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの生産

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

アデノウイルス産生のための効率的な方法

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...