Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Grant Nr. 21576279, 20906076) und dem KRIBB-Forschungsinitiative-Programm (KGM2211531) unterstützt.

1. Vorbereitung von Bambushydrolysat <ol><li> Füge 5 g Bambuspulver zu 40 ml einer NaOH-Lösung hinzu, um eine 10% ige (g / g) Endkonzentration in einem 250 ml-Kolben zu erreichen. Verwenden Sie eine Reihe von NaOH-Lösungen im Bereich von 0,05 M bis 0,50 M in Schritten von 0,05 M. <ol><li> Inkubieren Sie die Mischung für 60 min bei 60 ° C oder 100 ° C in einem Wasserbad. Inkubieren bei 121 ° C in einem Autoklaven. </li></ol></li><li> Nach der Inkubation die Mischung 4 h bei Raumtemperatur stehen lassen. Dann entfernen Sie den Überstand. 100 ml Frischwasser zugeben und mischen. <ol><li> Wiederholen Sie dieses Waschen 5-6 mal, bis der pH-Wert des Überstandes 6,8 erreicht hat. Verwenden Sie den erhaltenen Feststoff für den nächsten Schritt der enzymatischen Hydrolyse. </li></ol></li><li> Zur Hydrolyse 50 ml der obigen Mischung auf pH 5,0 unter Verwendung von 98% H 2 SO 4 einstellen. Dann fügen Sie 0,5 ml 200 Filterpapieraktivität (FPU) / ml Cellulase hinzu. HINWEIS: Das endgültige Verhältnis von Cellulase zu Bambus shSollte 20 FPU pro 1 g Bambus sein. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 50 ° C für 36 h in einem Shaker. HINWEIS: Nach der Hydrolyse bleibt ein Feststoff in der Mischung. </li><li> Man empfängt ein klares Hydrolysat durch Zentrifugieren bei 7,690 xg für 5 min. </li><li> Quantifizieren Sie die Glukose, Xylose und andere Chemikalien mit einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen-System, das mit einem Brechungsindex-Detektor und einem Photodioden-Array-Detektor ausgestattet ist. Verwenden Sie eine HPX-87H-Säule (300 mm x 7,8 mm) und eine mobile Phase von 5 mM H 2 SO 4 -Lösung mit einer Durchflussrate von 0,8 mL / min. </li><li> Für ein großes Volumen an Hydrolysatzubereitung werden 2 kg Bambuspulver und 18 l 0,25 M NaOH in einem 30-l-Edelstahlbehälter gemischt. <ol><li> Den Tank bei 121 ° C in einem Autoklaven für 60 min inkubieren. Nach der Inkubation die Mischung mit 40 l Wasser in einem 60 l Plastikbehälter waschen. Wiederholen Sie diese Reinigung 5 mal. </li><li> Verwenden Sie Wasser, um den gesamten gewaschenen Bambus auf ein Volumen von 20 L einzustellen.Den pH-Wert des Gemisches mit 98% H 2 SO 4 auf 5,0 einstellen. </li><li> Enzymatische Hydrolyse der Mischung in einem modifizierten Schüttelwasserbad, ausgestattet mit einem mechanischen Rührwerk, um sicherzustellen, dass die Mischung gut verteilt ist. Füge 200 ml von 200 FPU / ml Cellulase hinzu und inkubiere die Mischung bei 50 ° C für 36 h. </li><li> Nach der Hydrolyse wird die Mischung bei 4,700 xg für 10 min zentrifugiert. </li></ol></li></ol> 2. 2,3-Butandiol-Produktion von Wildtype K. pneumoniae <ol><li> Verwenden Sie 3 l Bambushydrolysat als Lösungsmittel für die mittlere Zubereitung. </li><li> Es wird ein Fermentationsmedium mit 4 g / l Maisquellwasser, 2 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / lK 2 HPO 4 , 3 g / l KH 2 PO 4 und 0,2 g / l MgSO 4 hergestellt . Den pH-Wert des Mediums mit 2,5 M NaOH neutralisieren. Verwenden Sie einen 5-L-Bioreaktor mit 3 l autoklaviertem Fermentationsmedium zur Fermentation. </li><li> Verwenden Sie K. pneumoniaeZellen, die in einem -80 ° C-Tiefkühlschrank gespeichert sind. </li><li> Für die Saatkultur inkubieren Sie einen 250 ml-Kolben, der 50 ml Luria-Bertani (LB) -Medium über Nacht bei 37 ° C enthält, unter Schütteln bei 200 U / min. Verwenden Sie LB-Medium, das 10 g / l Trypton, 5 g / l Hefeextrakt und 10 g / l NaCl enthält. HINWEIS: Die Zelldichte der Saatkultur sollte OD 2 erreichen (optische Dichte bei 600 nm). </li><li> Inokulieren Sie einen Kolben von 50 ml der Impfkultur im Bioreaktor. Die Kultur bei pH 6,0 und 37 ° C pflegen. Verwenden Sie eine Luftzufuhrrate von 2 L / min und eine Rührgeschwindigkeit von 250 U / min, wodurch eine mikroaerobe Bedingung entsteht. </li><li> Sammeln Sie 5 mL Proben alle 2 h während der Fermentation und analysieren sie mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, um die chemischen Konzentrationen in der Brühe zu bestimmen 4 . <ol><li> Überwachen Sie das Alkali, das dem Bioreaktor online unter Verwendung von MFCS / DA hinzugefügt wird. HINWEIS: Organische Säuren werden im Fermentationsverfahren hergestelltNd NaOH wird zugegeben, um die Kultur pH stabil zu halten. Das Volumen des zugegebenen Alkalis stellt die Menge der erzeugten Säure dar. Wenn die Alkali-Zuglinie Plateaus, der Prozess abgeschlossen ist, entweder wegen der Kohlenstoff-Quelle Erschöpfung oder Zelltod. </li></ol></li></ol> 3. R- Acetoin-Produktion durch die BudC- Mutante von K. pneumoniae <ol><li> Bereiten Sie ein Medium für die Acetinproduktion vor, das 4 g / l Maisquellwasser, 2 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g / l Natriumacetat, 0,4 g / l KCl und 0,1 g / l MgSO 4 enthält . </li><li> Verwenden Sie K. pneumoniae-ΔbudC für die R -Acetoin- Produktion. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5. ANMERKUNG : budC kodiert 2,3-Butandiol-Dehydrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC verliert die 2,3-Butandiol-Dehydrogenase-Aktivität und produziert R- Acetoin anstelle von 2,3-Butandiol. </li><li> Die Kultur bei pH 6,0 und 37 ° C pflegen. Verwenden Sie eine Luftzufuhrrate von 4 L / min und eine AgitatioN Rate von 450 U / min, ein aerobe Zustand. HINWEIS: Die Sauerstoffergänzung ist höher als die der 2,3-Butandiol-Produktion. </li><li> Assay die Proben wie in Schritt 2.6. </li></ol> 4. 2-Ketogluconsäure-Herstellung durch die budA- Mutante von K. pneumoniae <ol><li> Für die Herstellung von 2-Ketogluconsäure verwenden Sie dasselbe Medium wie für die R- Acetoin-Herstellung. </li><li> Verwenden Sie K. pneumoniae-ΔbudA für die Herstellung von 2-Ketogluconsäure. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5. HINWEIS : budA kodiert α-Acetolactat-Decarboxylase. K. pneumoniae-ΔbudA verliert die α-Acetolactat-Decarboxylase-Aktivität und produziert 2-Ketoglorkonsäure unter Verwendung von Glucose als Substrat. HINWEIS: Die 2-Ketoglasonsäure-Synthese ist ein saurer bedingungsabhängiger Prozess. Für die 2-Ketogluconinsäure-Produktion wurde eine zweistufige Fermentation entwickelt; In der ersten Stufe wird die Saatkultur im Bioreaktor geimpft. </li><lI&gt; Die Kultur bei pH 7,0 und 37 ° C pflegen. Verwenden Sie eine Luftzufuhrrate von 4 L / min und eine Rührgeschwindigkeit von 500 U / min. HINWEIS: Unter diesen Bedingungen wachsen die Zellen sehr schnell (die Zelldichte erreicht OD 7 in ca. 4 h). Dann geht die Fermentation zur zweiten Stufe über, während der der Kultur-pH-Wert auf 5,0 abfällt. Es wird keine Säure zugegeben; Die in der Kultur produzierten organischen Säuren führen natürlich zum pH-Abfall. Bei diesen sauren Bedingungen stoppt das Zellwachstum, aber 2-Ketogluconsäure wird synthetisiert und sammelt sich in der Brühe an. </li><li> Assay die Proben wie in Schritt 2.6. Mit dem Hydrolysat von Bambus als Kohlenstoffquelle. HINWEIS: Die Glukose im Medium wird in 2-Ketoglorkonsäure umgewandelt und die Xylose wird in Xylonsäure umgewandelt. So erhält man eine Mischung aus 2-Ketogluconsäure und Xylonsäure. </li></ol>

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	<li>Zeng, A. P., Biebl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+chemicals+from+biotechnology:+the+case+of+1,+3-propanediol+production+and+the+new+trends.">Bulk chemicals from biotechnology: the case of 1, 3-propanediol production and the new trends.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 74, 239-259 (2002).</li><li>Wei, D., Wang, M., Jiang, B., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dihydroxyacetone+kinases+I+and+II+in+the+dha+regulon+of+Klebsiella+pneumoniae.">Role of dihydroxyacetone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneumoniae.</a> J Biotechnol. 177, 13-19 (2014).</li><li>Celi&#324;ska, E., Grajek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+2,3-butanediol-current+state+and+prospects.">Biotechnological production of 2,3-butanediol-current state and prospects.</a> Biotechnol Adv. 27 (6), 715-725 (2009).</li><li>Chen, C., Wei, D., Shi, J., Wang, M., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+2,+3-butanediol+stereoisomer+formation+in+Klebsiella+pneumoniae.">Mechanism of 2, 3-butanediol stereoisomer formation in Klebsiella pneumoniae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 98 (10), 4603-4613 (2014).</li><li>Wei, D., Wang, M., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+recombinase+assisted+gene+replacement+in+Klebsiella+pneumoniae.">Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (8), 1219-1226 (2012).</li><li>Wei, D., Sun, J., Shi, J., Liu, P., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+strategy+to+improve+efficiency+for+gene+replacement+in+Klebsiella+pneumoniae.">New strategy to improve efficiency for gene replacement in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (5), 523-527 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RecBCD+in+Klebsiella+pneumoniae+by+Gam+and+its+effect+on+the+efficiency+of+gene+replacement.">Inhibition of RecBCD in Klebsiella pneumoniae by Gam and its effect on the efficiency of gene replacement.</a> J Basic Microbiol. 56 (2), 120-126 (2016).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-acetoin+accumulation+and+dissimilation+in+Klebsiella+pneumoniae.">R-acetoin accumulation and dissimilation in Klebsiella pneumoniae.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 42 (8), 1105-1115 (2015).</li><li>Wei, D., Xu, J., Sun, J., Shi, J., Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Ketogluconic+acid+production+by+Klebsiella+pneumoniae+CGMCC+1.6366.">2-Ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (6), 561-570 (2013).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+fermentation+for+2-ketogluconic+acid+production+by+Klebsiella+pneumoniae.">Two-stage fermentation for 2-ketogluconic acid production by Klebsiella pneumoniae.</a> J Microbiol Biotechnol. 24 (6), 781-787 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconic+acid+production+by+gad+mutant+of+Klebsiella+pneumoniae.">Gluconic acid production by gad mutant of Klebsiella pneumoniae.</a> World J Microbiol Biotechnol. 32 (8), 1-11 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+xylonic+acid+by+Klebsiella+pneumoniae.">Production of xylonic acid by Klebsiella pneumoniae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 100 (23), 10055-10063 (2016).</li><li>Kumar, P., Barrett, D. M., Delwiche, M. J., Stroeve, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+pretreatment+of+lignocellulosic+biomass+for+efficient+hydrolysis+and+biofuel+production.">Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production.</a> Ind Eng Chem Res. 48 (8), 3713-3729 (2009).</li><li>Brisse, S., Grimont, F., Grimont, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genus+Klebsiella.">The genus Klebsiella.</a> The Prokaryotes. , 159-196 (2006).</li><li>Hao, J., Lin, R., Zheng, Z., Liu, H., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+microorganisms+able+to+produce+1,+3-propanediol+under+aerobic+conditions.">Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1, 3-propanediol under aerobic conditions.</a> World J Microbiol Biotechnol. 24 (9), 1731-1740 (2008).</li><li>Hong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+alkaline+pretreatment+on+corn+stover+for+enhanced+production+of+1.3-propanediol+and+2,+3-butanediol+by+Klebsiella+pneumoniae+AJ4.">Optimization of alkaline pretreatment on corn stover for enhanced production of 1.3-propanediol and 2, 3-butanediol by Klebsiella pneumoniae AJ4.</a> Biomass Bioenerg. 77, 177-185 (2015).</li><li>Pienkos, P. T., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pretreatment+and+conditioning+processes+on+toxicity+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysates.">Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates.</a> Cellulose. 16 (4), 743-762 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

K. pneumoniae gehört zur Gattung Klebsiella in der Familie Enterobacteriaceae . K. pneumoniae ist weit verbreitet in natürlichen Umgebungen wie Boden, Vegetation und Wasser 14 . Der in dieser Forschung verwendete Wildtyp- K. pneumoniae- Stamm wurde aus dem Boden isoliert und wird für die 1,3-Propandiol-Produktion verwendet 15 . K. pneumoniae und Mutanten dieser Art produzieren viele Chemikalien unter verschiedenen Be...

Klebsiella pneumoniae ist ein Bakterium, das unter aeroben und anaeroben Bedingungen gut wächst. K. pneumoniae ist ein wichtiger industrieller Mikroorganismus, der verwendet wird, um viele Chemikalien herzustellen. 1,3-propandiol ist eine wertvolle Chemikalie, die hauptsächlich als Monomer zur Synthese von Polytrimethylenterephthalat verwendet wird. Polytrimethylenterephthalat ist ein biologisch abbaubarer Polyester, der bessere Eigenschaften aufweist als die von 1,2-Propandiol, Butandiol oder Ethylenglykol 1 . 1,3-propandiol wird von K. pneumoniae unter Verwendung von Glycerin als Substrat in sauerstoffbeschränkten Bedingungen hergestellt 2 . 2,3-Butandiol und seine Derivate haben Anwendungen auf dem Gebiet der Kunststoffe, der Lösemittelherstellung und des synthetischen Kautschuks und haben das Potential, als Biokraftstoff verwendet zu werden 3 . Mit Glucose als Substrat ist 2,3-Butandiol der Hauptmetabolit des Wildtyp-Stammes 4 . 2,3-Butandiol ist SyntheseEd von pyruvate Zuerst kondensieren zwei Moleküle Pyruvat, um α-Acetolactat zu ergeben; Diese Reaktion wird durch α-Acetolactatsynthase katalysiert. Α-Acetolactat wird dann durch α-Acetolactat-Decarboxylase in Acetoin umgewandelt. R- Acetoin kann bei der Katalyse von Butandiol-Dehydrogenase weiter zu 2,3-Butandiol reduziert werden. Ein effizientes Gen-Ersatzverfahren, das für K. pneumoniae geeignet ist, wurde untersucht und viele Mutanten wurden 5 , 6 , 7 konstruiert. Eine budC- Mutante, die ihre 2,3-Butandiol-Dehydrogenase-Aktivität verloren hat, akkumuliert ein hohes Maß an Acetoin in Kulturbrühe. Acetoin wird als Additiv verwendet, um den Geschmack der Nahrung zu verbessern 8 . Wenn budA , das für α-Acetolactat-Decarboxylase kodiert, mutiert ist, sammelt sich 2-Ketoglorkonsäure in der Brühe an. 2-Ketoglasonsäure wird für die Synthese von Erythorbinsäure (Isoascorbinsäure), Ein Antioxidans in der Lebensmittelindustrie verwendet 9 . 2-Ketoglasonsäure ist ein Zwischenprodukt des Glucose-Oxidationswegs; In diesem Weg, der sich im periplasmatischen Raum befindet, wird Glukose zu Gluconsäure oxidiert und dann weiter zu 2-Ketogluonsäure oxidiert. Glukonsäure und 2-Ketoglorkonsäure, die im Periplasma produziert werden, können zum weiteren Metabolismus zum Cytoplasma transportiert werden. Die Anhäufung von 2-Ketoglorkonsäure hängt von sauren Bedingungen ab, und eine höhere Luftzufuhr begünstigt die 2-Ketogluconinsäure-Produktion 10 . Gluconat-Dehydrogenase, kodiert durch Gad , Katalysiert die Umwandlung von Gluconsäure in 2-Ketolguconinsäure. Die Gad- Mutante von K. pneumoniae produzierte ein hohes Maß an Glukonsäure anstelle von 2-Ketogluonsäure, und dieser Prozeß hängt auch von sauren Bedingungen ab. Glukonsäure ist eine organische Grundsäure und wird als Additiv zur Erhöhung der Eigenschaften von Zement 1 verwendet1 Glucose-Oxidation zu Gluconsäure wird durch Glucose-Dehydrogenase katalysiert. Xylose ist auch ein geeignetes Substrat der Glukose-Dehydrogenase. Wenn Xylose als Substrat verwendet wird, erzeugt K. pneumoniae Xylonsäure 12 . Die chemische Produktion mit Biomasse als Rohstoff ist ein heißes Thema in der Biotechnologie 13 . Die Hauptkomponenten der Biomasse sind Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Allerdings können diese makromolekularen Verbindungen nicht direkt von den meisten Mikroorganismen (einschließlich K. pneumoniae ) katabolisiert werden. Cellulose und Hemicellulosen in der Biomasse müssen zu Glucose und Xylose hydrolysiert werden und können dann von Mikroorganismen verwendet werden. Die Anwesenheit von Lignin in Lignocellulosen schafft eine Schutzbarriere, die die Biomasse-Hydrolyse durch Enzyme verhindert. So wird ein Vorbehandlungsprozess, der Lignin und Hemicellulosen entfernt und die Kristallinität von Cellulose reduziert, immer während der Biomasseverwendung durch Mic durchgeführtRoorganismen Es wurden viele Vorbehandlungsmethoden entwickelt: Säure-, Alkali-, Ammoniak- und Dampfvorbehandlungen sind üblich. Bambus ist reich an tropischen und subtropischen Regionen und ist eine wichtige Biomasse-Ressource. Hier werden die Herstellung von Bambushydrolysat und die chemische Produktion mit Bambushydrolysat vorgestellt

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">autoclave</td>
			<td style="width:136px;">SANYO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3780</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">bioreactor</td>
			<td style="width:136px;">Sartorius stedim biotech</td>
			<td style="width:119px;">Bostat Aplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">agitator</td>
			<td style="width:136px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">RW 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath shaker</td>
			<td style="width:136px;">Zhicheng</td>
			<td style="width:119px;">ZWY-110X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">high performance liquid chromatograph system</td>
			<td style="width:136px;">Shimadzu Corp</td>
			<td style="width:119px;">20AVP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">CR22G III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bamboo powder</td>
			<td style="width:136px;">purchased from Zhejiang Province, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>mesh number, 50</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">cellulase</td>
			<td style="width:136px;">Youtell Biochemical, Shandong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 PFU/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of chemicals by klebsiella pneumoniae using bamboo hydrolysate as feedstock

Bambus ist eine wichtige Biomasse, und Bambushydrolysat wird von Klebsiella pneumoniae als Ausgangsmaterial für die chemische Produktion verwendet. Hier wurde Bambuspulver mit NaOH vorbehandelt und auf einen neutralen pH-Wert gewaschen. Cellulase wurde dem vorbehandelten Bambuspulver zugesetzt, um das Hydrolysat zu erzeugen, das 30 g / l Glucose und 15 g / l Xylose enthielt und als Kohlenstoffquelle verwendet wurde, um ein Medium für die chemische Produktion herzustellen. Bei kultivierten mikroaerobischen Bedingungen wurden 12,7 g / l 2,3-Butandiol durch Wildtyp- K. pneumoniae hergestellt . In aeroben Bedingungen wurden 13,0 g / l R- Acetoin durch die budC- Mutante von K. pneumoniae produziert . Eine Mischung aus 25,5 g / l 2-Ketoglorkonsäure und 13,6 g / l Xylonsäure wurde durch die budA- Mutante von K. pneumoniae in einer zweistufigen, pH-kontrollierten Fermentation mit hoher Luftzufuhr hergestellt. In der ersten Stufe der Fermentation wurde die Kultur bei einem neutralen pH-Wert gehalten; Nach Zelle Wachstum, die FermentatioN ging in die zweite Stufe über, in der die Kultur sauer werden durfte.

In diesem Protokoll wurde der Bambus unter Verwendung von Alkali vorbehandelt. Die optimalen Inkubationsparameter - eine Temperatur von 121 ° C und 0,25 M NaOH - wurden in den Fig. 1 und 2 bestimmt . Der vorbehandelte Bambus wurde enzymatisch hydrolysiert und die im Hydrolysat erhaltenen Glucose- und Xylose-Konzentrationen wurden gemessen. Höhere Temperaturen begünstigten die Zuckerproduktion, so dass 121 ° C als optimale Temperatur gewählt wurde. D...

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Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bambuspulver wurde mit NaOH vorbehandelt und enzymatisch hydrolysiert. Das Hydrolysat von Bambus wurde als Ausgangsmaterial für 2,3-Butandiol, R- Acetoin, 2-Ketogluonsäure und Xylonsäure-Produktion von Klebsiella pneumoniae verwendet .

Herstellung von Chemikalien durch<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bambushydrolysat als Ausgangsmaterial verwenden

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

production-chemicals-klebsiella-pneumoniae-using-bamboo-hydrolysate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

8.9K Aufrufe.  Chinese Academy of Sciences.  Bambuspulver wurde mit NaOH vorbehandelt und enzymatisch hydrolysiert. Das Hydrolysat von Bambus wurde als Ausgangsmaterial für 2,3-Butandiol, R- Acetoin, 2-Ketogluonsäure und Xylonsäure-Produktion von Klebsiella pneumoniae verwendet . 

Serie: Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Forschung

Biotechnik

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

Eine effiziente Methode für die Adenovirus-Produktion

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...