スイス国立科学財団からの支援を得てください。スイスの Sinergia プログラム;ポーランド語-スイスのリサーチ ・ プログラム (PSPB-094/2010)化学生物学の国立がんスイス SystemsX.ch イニシアティブから LipidX (j. g.) にスイスの全米科学財団によって評価されます。O. m. は、エンボ長期フェローシップ (ALTF-516-2012) によって支えられました。

1 ですソリューションおよび準備 注: すべてのバッファーおよび解決は、ダブル蒸留 (dd) H 2 o. で準備する必要が。糖度計を使用してすべてのスクロース溶液の最終濃度を決定する必要がありますショ糖の水和状態によって異なりますので、.
<ol><li>準備リン酸緩衝生理食塩水 (PBS-) の二価陽イオンなし: 137 mM よる、2.7 mM KCl、1.5 mM KH 2 PO 4、および 6.5 mM ナ 2 HPO 4。7.4 に pH を調整します。オートクレーブ滅菌 (121 ° C で 15 分間 1 サイクル) で殺菌し、常温で保存します</li>。
	<li>300 mM のイミダゾールの貯蔵液の準備: ddH 2 O.Adjust 塩酸フィルター滅菌 0.22 μ m を使用してを使用して 4 ° C、7.4 に pH サイズ フィルターの細孔し、4 デパートの 10 mL のイミダゾールの 0.204 g ° C</li>
	<li>準備均質化バッファー (HB; 約 100 mL を準備): 3 mM のイミダゾールの 250 mM ショ糖。PH 計を用いた 4 ° C、7.4 に pH を調整します。0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用してフィルター滅菌し、4 で保存 ° C. 補完 HB 使用直前最終濃度 10 mM leupeptin、1 mM ペプスタチン A、および 10 ng/mL アプロチニンに対応するプロテアーゼ阻害剤のカクテルと</li>。
	<li>ステップ浮上グラデーションの準備 62%、39%、35% スクロース溶液で 3 mM のイミダゾール、pH 7.4 では、下記のとおりです。糖度計を使用してすべてのスクロース溶液の最終濃度を正確に決定します。
	<ol><li>3 mM のイミダゾール、pH 7.4 で 62% ショ糖溶液の準備 100 mL。DdH 2 O でショ糖の 80.4 g を攪拌して溶解加温 300 mM イミダゾール原液と ddH 2 O. 調整と 100 mL に塗りの 35 ° c. を追加 1 mL pH 7.4 に 4 ° c. フィルター滅菌 0.22 μ m 孔サイズ フィルターとストアを使用して4 ° C で</li>
		<li>は、3 mM のイミダゾール、pH 7.4 で 35% ショ糖溶液 100 mL を準備します。300 mM のイミダゾール原液の ddH 2 O. 追加 1 mL 中のスクロースの 40.6 g を攪拌して溶解し、ddH 2 O. 調整と 100 mL に 4 ° c. フィルター滅菌使用 0.22 μ m 孔サイズのフィルターと 4 デパートで 7.4 に pH を埋める ° C</li>
		<li>は、3 mM のイミダゾール、pH 7.4 で 39% ショ糖の 50 mL を準備します。35% ショ糖液で 62% ショ糖溶液を希釈します。4 ° C でストア</li>
	</ol></li> <li>1 M 水酸化ナトリウムを滴下し追加しながら 100 mL の PBS-前 warmed 60 ° c で攪拌によるパラホルムアルデヒド (PFA) の 3 g を溶かす; NaOH を使用して 7.4 に最終の pH を調整します。0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用してフィルター滅菌し、-20、保管 ° C 
	注意: 3 %pfa は有毒な試薬</li>。
	<li>準備 1 M 塩化カリウム原液。50 ml の ddH 2 o. フィルター滅菌 0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用しての攪拌による KCl の 3.73 g を溶解し、常温で保存します</li>。
	<li>PH 7.0 と 75 ミリメートル MgOAc 2 ddH 2 O を因数とストアで-20 で 0.625 M Hepes を含む準備 50 倍濃縮原液 ° C</li>
	<li>準備は、メディアをマウントします。グリセロールの 6 g poly(vinyl alcohol) M w 〜 31,000 (PVA) の 2.4 g を攪拌して混ぜます。DdH 2 O の 6 mL を追加し、室温で少なくとも 2 h のまま。12 0.2 mL を加える M トリス Cl (Ph8.5) と時折かくはん PVA が溶けるまでで約 53 ° C に熱します</li>。
	<li>室温で 20 分間 5,000 × g で遠心分離によって解決策を明らかにします。上清を収集し、追加 2.5% (w/v) 1, 4 - diazabicyclo-[2.2.2] オクタン (鎖置換 DABCO) 蛍光検出時に退色を防ぐために。約 30 のための渦を溶解する s。1.5 mL プラスチック チューブと-20 で店に割り切れる ° C</li>
</ol> 2。細胞培養 <ol><li>ダルベッコの培養 HeLa 細胞 &#39; s 10% 非本質的なアミノ酸、10% ウシ胎仔血清で修正イーグル培 10 %l-グルタミンと 1% ペニシリン-ストレプトマイシン。37 ° c 5% CO 2 インキュベーターでそれらを維持します</li>。
	<li>GFP RAB5 10 製造元によると商業のトランスフェクション試薬を用いた実験の前に 24 時間のセルを transfect &#39; s 指示します</li>。
	<li>必要に応じて、エンドソーム分数と利率 (すなわち RNAi や CRISPR/Cas9 を使用して) や興味の蛋白質の形式を野生型または突然変異体を過剰発現タンパク質を消耗した細胞から細胞質を準備します</li>。
</ol> 3。エンドソーム分数準備 注: このプロトコルは、エンドソームと他の光の膜を含む細胞下分画の簡単な準備をについて説明します。必要な場合精製エンドソーム分数に使用 11 することができます。開始材料として GFP RAB5 を発現するコンフルエントの細胞の 2 つのペトリ皿 (10 cm 外径; 57 cm 2) を準備します。2 枚のペトリ皿に合流の HeLa 細胞の総数は約 2.5 倍の 10 の 7 セルに対応します。とき、必要に応じて、エンドソームも用意できます GFP RAB5 を常に表現する、(すなわち RNAi や CRISPR/Cas9 を使用して) の興味および興味の蛋白質の形式を野生型または突然変異体を過剰発現タンパク質を消耗したセルから。
 注意: 氷の分別のプロトコルのすべての手順を実行します
<ol><li>フラット氷バケットに濡れた鉄板の上にペトリ皿を置くし、すぐに氷冷 PBS-5 mL で 2 回細胞を洗っています</li>。
	<li>削除すべての PBS - 最後の洗浄から、氷冷 PBS の皿あたり 3 mL を加えます。細胞が乾燥しないと処理中に: 必要に応じて、液で細胞を十分にカバーするロッキング プラットフォームに氷バケツを配置します</li>。
	<li>は、機械的に柔軟なゴム製の警官 (自家製細胞スクレーパー など) を使用してシャーレから PBS のセルを削除します。皿の真ん中に下向きの動き続く、皿の外側にクイック、円形を描くように皿からセルを最初に擦る。取得する優しくこすり &#34; シート &#34; 接続されている細胞。軽く氷に 15 mL の円錐形ポリプロピレン チューブに広い開口部とプラスチックのパスツール ピペットを使用してセルを転送</li>
	<li>175 x g で 5 分間遠心分離し 4 ° C</li>
	<li>はそっと上澄み (SN) を除去し、ペレットに HB の 1-3 mL を追加します。広い開口部とプラスチックのパスツール ピペットを使用して穏やかに、また上下一度細胞を再懸濁します</li>。
	<li>X g と 4 ° c. そっと削除 SN 1,355 で 7 ~ 10 分間遠心します</li>。
	<li>セル均質化を実行します 。
	注: 条件は、細胞の細胞膜が壊れているが、エンドソームのままに穏やかなする必要があります。
	<ol><li>(細胞ペレットあたり約 100 μ L) 細胞ペレットにプロテアーゼ阻害剤と HB の知られているボリュームを追加します。1,000 μ L マイクロ ピペットを使用して、優しくピペット上下セル再停止されるまで。できません空気の泡を紹介します</li>。
		<li>HB に中古リンスや空気や気泡の自由 22 G 針で 1 mL ツベルクリン注射器を準備します</li>。
		<li>(空気の泡の作成を避けるため) に比較的ゆっくりと細胞懸濁液と注射器を埋める、管の壁に針の斜めのヒントを配置し、せん断オフ添付の細胞の原形質膜に急速に細胞懸濁液を追放します</li>。
		<li>磨砕液 (約 3 μ L) の小さい因数とスライド ガラスに HB の 50 μ L に希釈します。ミックスし、ガラス基板でカバー。20 X、40 X 目的を搭載した位相差顕微鏡下で磨砕液を検査します 。
		注: 最適な条件の下で、ほとんどの細胞は壊れているが、暗い灰色として表示され、構造のラウンド、核はない ( 図 1).</li>
		<li>3.7.3 とほとんどの細胞まで 3.7.4 手順を繰り返しますが壊れている; 通常、針を 3-6 上下ストロークが必要。タンパク質の定量ホモジネートの小さい因数 (10-30 μ L) を維持します</li>。
	</ol></li> <li>G x 1,355 と 4 で 7 分間遠心分離機ホモジネート ° C 
	注: 後遠心分離、(核ペレット; として定義されているペレットNP) は、核と上清 (postnuclear 清; として定義されている含まれています。PNS) には、細胞質と細胞小器官の均質化と無料の懸濁液のリリースが含まれています</li>。
	<li>は、慎重に PNS を収集します。タンパク質の定量 PNS と NP の小さい因数 (10-30 μ L) を維持し、NP を破棄します</li>。
	<li>は、1:1.1 率 PNS:62% ショ糖を用いた PNS で 62% ショ糖液を薄めて 40.6% ショ糖に PNS を調整します。空気泡を作成せず優しくが、徹底的をミックスします。屈折を用いたショ糖濃度を確認してください</li>。
	<li>は、40.6% ショ糖遠心管の下部に PNS を配置します。35% ショ糖溶液 2.5 mL を慎重にオーバーレイ、HB と遠心管を埋める 。
	メモ: インターフェイスが明確に表示されるようにスクロース溶液が層状必要があります</li>。
	<li>超遠心機 ̴165, 000 x g と 4 で 1 時間勾配 ° C</li>
	<li>は、グラデーション上に脂質の白い層を慎重に取り外します。次に、エンドソーム、HB とカット チップ 200 μ L ピペットを使用して、35% ショ糖を含むインターフェイスを収集します 。
	注: エンドソーム分数アクチンの重合 の in vitro アッセイ内で直接使用することができますまたはフラッシュ凍結液体窒素で氷の上避けようと-80 に格納されてすることができます ° C</li>
	<li>は、PNS とエンドソーム分数のタンパク質濃度を測定します 。
	注: この濃度は、少なくとも 100 μ g/mL をする必要があります。少なくとも 100 μ g/mL と PNS を取得するための約 2.5 倍の 10 7 セル 2 枚のペトリ皿の成長 (上記のメモを参照してください).</li>
</ol> 4。細胞質準備 注: 準備 2 シャーレ (直径 10 cm; 57 cm 2) 開始材料として合流の HeLa 細胞の。必要に応じて、細胞質は細胞 (すなわち RNAi や CRISPR/Cas9 を使用して) 利率や野生型または興味の蛋白質の突然変異体のフォームを過剰発現タンパク質の枯渇からも用意できます。氷にエンドソーム分別のプロトコルはすべての手順を実行します
<ol><li>3.1 3.8、手順を繰り返します</li>。
	<li>遠心管と ̴250, 000 x g と 4 の 45 分の超遠心機に PNS ° C</li>
	<li>は、慎重に上に白い層を除去し、微粒体ペレットを乱すことがなく SN (細胞質分画) を収集します。タンパク質の定量細胞質分画の因数を維持します 。
	注: 細胞質のアクチンの重合 の in vitro アッセイ内で直接使用することができますまたはフラッシュ凍結液体窒素で氷の上避けようと-80 に格納されてすることができます ° C</li>
	<li>は細胞質のタンパク質濃度を測定します 。
	メモ: それは、少なくとも 3 mg/mL をする必要があります</li>。
</ol> 5。アッセイの測定エンドソーム依存性のアクチン重合 体外 注: エンドソーム依存性のアクチン重合は、2 つの代替方法を使用して実行できます。最初のアプローチでは、材料がテスト チューブに混合、固定と観察に転送、分析します。2 番目のアプローチは、ここで説明アッセイ イメージング室で直接実施されるとすることができます固定および分析できる力学的摂動 ( 図 2) なし。この 2 番目の方法でアッセイ混合物を観察するテスト チューブからは転送されませんし従って残物動じない、F-アクチン ネットワークが物理的に転送中に摂動の危険性を減少させます。さらに、この 2 番目の方法は、F アクチン重合の時系列解析と互換性が。どちらのアプローチに F アクチンの重合における差は認められなかったことに注意してください 。
注: 使用カット、プロトコル全体のヒント。
<ol>試験管内 <ol><li>優しくミックス冷たい精製 GFP-RAB5 エンドソーム (ステップ 3) 1:10 (タンパク) 冷たい 1.5 mL コニカル テスト チューブ内の比率で (ステップ 4) 細胞質と <li>です 。
		注: 典型的な実験を用いて実施される約 40-50 μ L.</li>
		<li>は、1.5 mM MgOAc 2 (x 貯蔵液 50 を使用して)、12.5 mM Hepes、125 mM (1 M KCl 原液を使用して) KCl の最終濃度に冷たい反応混合物を調整します。Leupeptin 10 mM、1 mM ペプスタチン A、および 10 ng/mL アプロチニンの最終濃度にプロテアーゼ阻害剤との混合物を調整します。優しくすべてのコンポーネントをミックスします</li>。
		<li>振盪せずに 37 ° C で反応混合物を含むテスト チューブを置き、目的の時間インキュベートします 。
		注: 通常、それはエンドソームと広範なネットワークの形成のための 30 分でのアクチン重合を検出する約 3 分になります</li>。
		<li>希望の時間に (すなわち、 3 分または 30 分)、氷上テスト チューブを配置することによって反作用を停止し、冷却の 3 %pfa 溶液 (vol:vol) の 1/10 を追加します</li>。
		<li>共役重合のアクチンを染色する赤オレンジ色の色素に 200 単位/ml (~6.6 μ M) ファロイジンの 0.3:10 (vol:vol) を追加します</li>。
		<li>12 の上に混合物の場所 12 μ μ PVA マイクロ ガラス スライドでメディアをマウント。18 x 18 mm 2 ガラスの coverslipon トップを配置します</li>。
		<li>共焦点顕微鏡によるサンプルを分析します</li>。
	</ol></li> <li>イメージングのチャンバー内 <ol><li>顕微鏡イメージング室使用、プラズマ クリーナー 1 分のラウンド 18 mm 径 coverslip とラウンド 35 φ 20 mm ガラス底装備ペトリ皿をきれいに (0.16 0.19 mm).</li>
		<li>では、ガラスに結合する蛋白質を最小限に抑えるために 20 分間の 1% の β-カゼインをきれいにされた表面を孵化させなさい。3 mM のイミダゾールで二回洗って</li>。
		<li>追加エンドソームと細胞質、同じ冷却 1.5 mL の試験管に 5.1.1、5.1.2 の手順のように混合物を試金し、0.1 μ g/μ L ローダミン-アクチンとアッセイの混合物を補完します</li>。
		<li>調整、最終的な屈折 1.375 (26.5% ショ糖) に混合物の 39% ショ糖液を使用しています 。
		メモ: 通常は、同じボリュームが追加されます。ただし、ショ糖濃度を若干変更実験から実験するので、糖度を使用して決定、フラクションのショ糖濃度に応じて経験的再調整する必要があります</li>。
		<li>前処理 35 mm ディッシュ (ステップ 5.2.1) の混合物を置き、前処理 18 mm coverslip (ステップ 5.2.1) でそれをカバーします</li>。
		<li>を振ることがなく 37 ° C でチャンバーを配置します</li>。
		<li>蛍光共焦点顕微鏡を用いたサンプルを分析します</li>。
	</ol></li></ol> 6。画像 Acシミュレーショ アクチン ネットワークの解析と <ol><li>画像 <ol><li>は逆の走査型共焦点顕微鏡の画像を取得します 。
		注: 63 × 1.25 NA 石油目的と逆走査型共焦点顕微鏡の画像集録設定が最適化されました。良い信号対雑音比を達成するためにレーザー パワー (通常およそ 50%) を調整します</li>。
	</ol></li> <li>アクチン ネットワークの定量化 <ol><li>蛍光顕微鏡を分析します。オープン ソース ソフトウェア CellProfiler (v2.1.1) 12 を使用してアクチン エンドソームあたりの量を測定 (代替ソフトウェアを使用することができます)。
		<ol><li>は、最初に、GFP RAB5 信号を使用して、プライマリ オブジェクトとしてエンドソームを特定します。F-アクチン アクチン信号の伝搬を用いた個々 のエンドソームに関連付けられたを定量化 (赤オレンジ色素標識ファロイジン) セカンダリ オブジェクトとして</li>。
			<li>平均条件を制御する各オブジェクトの関連するマテリアルの数を正規化と</li>。
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

アクチンは、エンドソーム膜ダイナミクス4,14の重要な役割を果たしています。我々 はアクチン核形成と重合では、初期エンドソーム小 F アクチン パッチやネットワーク形成を報告しました。これら F アクチン ネットワークがを超えて分解経路に沿って早期エンドソーム膜輸送のため絶対に必要です。この核と重合プロセスのすべてのステップに?...

高等真核生物の細胞のタンパク質や脂質は並べ替えが発生する初期エンドソームを内面化します。いくつかのタンパク質や脂質は、住宅がする運命にあるは初期エンドソームの管状地域に組み込むし、トランスゴルジ ネットワーク (TGN)1、2細胞膜に輸送。対照的に、他のタンパク質や脂質は、多胞性の外観を示す初期エンドソームの領域に選択的にパッケージ化されます。これらの領域を展開し、初期エンドソーム膜から剥離時に無料エンドソーム キャリア小胞または多胞体 (ECV/MVBs) に最終的に成熟したから責任がある後期エンドソーム1,に向かって貨物輸送2。
アクチンは、エンドソーム並べ替え容量とエンドソームの形成と関連付けられる膜改造プロセスで重要な役割を果たしています。タンパク質のリサイクルの経路に沿って、TGN の細胞膜には、レトロマー複合体と関連付けられているタンパク質に依存します。この仕分けの機械リサイクル尿細管を介しての相互作用レトロマー複合体、ハチと傷跡相同 (洗浄) 複雑で分岐したアクチン3,4,5 の形成を結合するようであります。.対照的に、分子分解運命、特にシグナル受容体を活性化、エンドソーム選別輸送 (ESCRT)2,6、複合体によって管腔内小胞 (ILVs) に分類されます。 7。アクチン ESCRT 依存ソート処理の可能な役割は知られていない、F アクチンは ECV/MVBs の生合成におけるや早期エンドソームを超えて輸送に重要な役割を果たしています。特に、アネキシン A2 初期エンドソームと spire1 と共にコレステロール濃縮の領域にバインド、nucleates F アクチンの重合がわかった。エンドソームに観察される分岐アクチン ネットワークの形成がアクチン関連タンパク質 (ARP) 2/3 の分岐のアクティビティを必要とする複雑でと同様、ERM タンパク質モエシン、アクチン結合タンパク質 cortactin8,9。
ここでは、核生成と試験管内初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイをについて説明します。この試金は、A2 を F-アクチン核形成におけるアネキシンとモエシンとエンドソーム アクチン ネットワーク8,9の形成の役割を調べるため以前使用されています。この体外プロトコルで複雑な一連のエンドソームでアクチンの重合時に発生する反応なるアクチン核形成、線形を含むプロセスの一連のステップの生化学的および分子の分析に従う義務があります。重合、分岐、および架橋。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acetate tetrahydrate</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actin rhodamine</td><td>Cytoskeleton. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Round 10 cm dishes for cell culture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropylen tube</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle 22G Black 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro glass slides</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18-mm glass coverslip</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&amp;mu;L yellow tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&amp;mu;L Blue Graduated Tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL test tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round coverslip</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Homemade</td><td></td><td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH Meter 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

多機能初期エンドソーム、特に貨物蛋白質を並べ替えると膜変形、エンドソームの膜の上に核形成した短い F アクチンのパッチに依存します。この複雑な一連の反応の遺伝学的および生化学的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを設けています。操作。エンドソーム分数は初期エンドソーム タンパク質 RAB5 GFP を発現する細胞からのサッカロースの勾配の浮上によって準備されます。細胞質画分は、細胞の別のバッチから用意しています。エンドソームと細胞質画分格納できます液体窒素で凍結に必要な場合。アッセイのエンドソームと細胞質画分を混合、および混合物は、適切な条件 (例えば、イオン強度、環境を削減) の 37 ° C で培養しました。希望の時間に反応混合物を固定すると、および F-アクチン ファロイジンで明らかにされます。アクチン核形成と重合は、蛍光顕微鏡で分析しています。ここで、アクチン核形成膜、またはそれ以降の伸び、分岐、または F アクチン繊維の架橋のどちらかに関与している因子の役割を調査するこのアッセイを使用ことができることを報告します。

F-アクチンのパッチを初期エンドソーム膜形成についての洞察を得るためには、図 2に示すプロトコルを追った簡単に言えば、細胞が GFP RAB5 を導入させたし、し、初期エンドソームは細胞レベル下の分別により作製しました。これらの精製された初期エンドソーム自体だけでなく、他の反応に関与の可能性の要因は、アクチンを提供するために?...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

初期エンドソーム機能 F アクチンの重合によって決まります。ここで、この複雑な一連の反応の生化学的・遺伝的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを説明します。操作。

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K ビュー.  University of Geneva. 初期エンドソーム機能 F アクチンの重合によって決まります。ここで、この複雑な一連の反応の生化学的・遺伝的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを説明します。操作。

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Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

生物学

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

透過処理神経成長円錐におけるローダミン-アクチンとF -アクチンばら両端にラベルを付ける

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

神経科学

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

生化学

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

生物工学

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces using motor proteins such as myosin II and kinesin to drive key processes such as migration, cytokinesis, adhesion, and mechanosensing. While actin-microtubule interactions are key to the cytoskeleton's versatility and adaptability, an understanding of their interplay with myosin and kinesin activity is still nascent. This work describes how to engineer tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules that undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers. Protocols for fluorescence labeling of the microtubules and actin filaments to most effectively visualize composite restructuring and motion using multi-spectral confocal imaging are also detailed. Finally, the results of data analysis methods that can be used to quantitatively characterize non-equilibrium structure, dynamics, and mechanics are presented. Recreating and investigating this tunable biomimetic platform provides valuable insight into how coupled motor activity, composite mechanics, and filament dynamics can lead to myriad cellular processes from mitosis to polarization to mechano-sensation.

This paper presents protocols for engineering and characterizing tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules. Composites undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers.

調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

Actin Polymerization and Cell Motility

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. Actin monomers polymerize to form a complex network of polarized filaments, the actin cytoskeleton, that plays a crucial role in many cellular processes, including cell motility, division, endocytosis, and metastasis of cancer cells.
Actin cytoskeleton dynamics can produce pushing, pulling, and resistance forces that help the cell to migrate. This is achieved by forming different types of membrane protrusions, depending on the cell type and the extracellular signals. Primarily, cells move by recurrent cycles of protrusion and attachment of the cell front to the substratum, followed by detachment and retraction at their rear end.
The human genome encodes six highly conserved actin proteins&#8212;ACTC1, ACTA1, ACTA2, ACTG1, ACTG2, and ACTB; all expressed in different cell types. Mutations in any of these six actin genes or the genes encoding actin-binding proteins can lead to disease. For example, mutations in the ACTA1 gene can lead to muscle weakness, especially in the respiratory muscles, which can cause breathing difficulties &#8212; a condition called Nemaline Myopathy. Similarly, mutations in the WAS gene, a key regulator of actin filament nucleation, which is important for cell adhesion, chemotaxis, and phagocytosis of immune cells, causes Wiskott Aldrich syndrome in humans.

アクチン重合と細胞運動性

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. ...

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

要約

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タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

透過処理神経成長円錐におけるローダミン-アクチンとF -アクチンばら両端にラベルを付ける

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのインビトロでの可視化

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価

アクチン重合と細胞運動性

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

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タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

透過処理神経成長円錐におけるローダミン-アクチンとF -アクチンばら両端にラベルを付ける

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

支持脂質二重層上の膜テザー最小アクチン皮質の再構成

調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価

アクチン重合と細胞運動性

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのインビトロでの可視化

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成