스위스 국립 과학 재단;에서 지원 받은 스위스 Sinergia 프로그램; 폴란드어-스위스 연구 프로그램 (PSPB-094/2010); 화학 생물학; NCCR 그리고 스위스 SystemsX.ch 이니셔티브에서 LipidX (J. G.)에 스위스 국립 과학 재단에 의해 평가. O. M. EMBO 장기 친교 (ALTF-516-2012)에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 및 참고: 모든 버퍼 및 솔루션 이중 증 류 (dd) H 2 o.에에서 준비 되어야 한다 자당의 수 분 상태가 다르기 때문에 모든 자당 솔루션의 최종 농도 결정 되어야 합니다은 굴절 계를 사용 하 여.
Divalent 양이온 (PBS-) 없이 <ol><li>준비 인산 염 버퍼 염 분: 137 m NaCI m, 2.7 m KCl m, 1.5 m m KH 2 포 4 및 6.5 m m 나 2 HPO 4. PH 7.4에 조정 합니다. 압력가 마로 소독 (1 개 주기 121 ° C에서 15 분)으로 소독 하 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>이미 300 mM의 재고 솔루션을 준비: ddH 2 O.Adjust HCl. 여과기 소독 0.22 μ m를 사용 하 여 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH 크기 필터 기 공 및 4에서 저장의 10 mL에 이미의 0.204 g ° c.</li>
	<li>준비 균질 버퍼 (HB; 준비 약 100 mL): 250 m m 3 m m 이미에 자당. PH 미터를 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH를 조정 합니다. 필터-0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 하 고 4에서 저장 protease 억제제 10 m m leupeptin, 1 mM pepstatin A, 및 10 ng/mL aprotinin에 해당 하는 최종 농도에서 칵테일 ° C. 보수는 HB 사용 직전.</li>
	<li>단계 부양 그라디언트에 대 한 준비 62%, 39%, 및 35% 자당 해결책 3mm 이미, pH 7.4, 아래 설명 된 대로. 굴절 계를 사용 하 여 모든 자당 솔루션의 최종 농도 정확 하 게 결정.
	<li>준비 100 mL 3 m m 이미, pH 7.4에에서 62% 자당 해결책의 <ol>. DdH 2 O 80.4 g 자당의 감동에 의해 해산 사전 예 열 300mm 이미 재고 솔루션 및 ddH 2 O. 조정 100 mL를 채우기의 35 ° C. 추가 1 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터 및 저장소를 사용 하 여 4 ° c.에</li>
		<li>이미 3 m m, pH 7.4에에서 35% 자당 해결책의 100ml 준비합니다. 40.6 g 300 밀리미터 이미 재고 솔루션의 ddH 2 오 추가 1 mL에 자당의 감동에 의해 해산 하 고 ddH 2 O. 조정 100 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터를 소독을 사용 하 여 0.22 μ m 기 공 크기 필터와 4에 저장를 채우기 ° c.</li>
		<li>이미 3 m m, pH 7.4에에서 39% 자당의 50 mL를 준비합니다. 35% 자당 해결책으로 62% 자당 해결책을 희석. 4 ° c.에 게</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde (PFA)의 3 세대 dropwise 1 M NaOH를 추가 하는 동안 60 ° C에 100 ml의 PBS-사전 warmed 감동에 의해 해산, NaOH를 사용 하 여 7.4에 최종 pH를 조정. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 및 저장-20 ° c. 
	주의: 3 %PFA 독성 시 약.</li>
	<li>1 M KCl 준비 재고 솔루션입니다. DdH 2 O. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 50 mL에 감동 하 여 KCl의 3.73 g을 녹이 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>준비 50 X 집중 재고 솔루션-20에서 ddH 2 오 약 수 및 저장소에 pH 7.0과 75 mM MgOAc 2에 0.625 M Hepes 포함 ° c.</li>
	<li>준비 설치 미디어입니다. 글리세롤의 6 g 2.4 g poly(vinyl alcohol) M w ~ 31000 (PVA)의 교 반에 의해 혼합. DdH 2 O 6 mL을 추가 하 고 실 온에서 2 h 이상 떠나. 추가 12 mL 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)와 약 53 ° c는 PVA 해산 했다 때까지 가끔 저 어 열.</li>
	<li>실 온에서 20 분 동안 5000 x g에서 원심 분리 하 여 솔루션을 명확히합니다. 상쾌한을 수집 하 고 2.5% (w/v) 1, 4 추가-diazabicyclo-[2.2.2] 옥 탄 (DABCO) 형광 탐지 동안 photobleaching를 방지 하기 위해. 약 30 소용돌이 해산 s. Aliquot 1.5 mL 플라스틱 튜브와 스토어-20 ° c.</li>
</ol> 2. 세포 배양 <ol><li>문화 헬러 셀 Dulbecco &#39; s 10% 태아 종 아리 혈 청, 10% 비 본질적인 아미노산, 보완 수정이 글 중간 10 %L-글루타민, 및 1% 페니실린-스. 37 ° c 5% CO 2 배양 기에서 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>Transfect 세포 GFP RAB5 10, 제조 업체에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 실험 하기 전에 24 시간 &#39; s 지침.</li>
	<li>필요할 때, 준비 endosomal 분수와 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심의 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing 단백질의 고갈에서 cytosol.</li>
</ol> 3. Endosomal 분수 준비 참고: endosomes 및 다른 가벼운 막 subcellular 분수의 간단한 준비가이 프로토콜에 설명 합니다. 필요한 경우, 순화 된 endosome 분수는 사용된 11 수 있습니다. GFP RAB5 시작 물자로 표현 confluent 셀 2 접시 (10 cm 외경; 57 c m 2)를 준비 합니다. 2 접시에 confluent HeLa 세포의 총 수는 대략 2.5 x 10 7 셀에 해당합니다. 때, 필요는 endosomes 또한 준비 될 수 있다 세포 관심 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 그리고/또한 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing, 항상 표현 GFP-RAB5의 단백질의 고갈에서.
 주의: 얼음에 분별 법 프로토콜의 모든 단계를 수행 해야
<ol><li>평평한 얼음 양동이에 젖은 금속 접시에 배양 접시를 놓고 즉시 두 번의 얼음 처럼 차가운 PBS-5 mL로 세포 세척.</li>
	<li>모든 PBS-마지막 세척에서 제거 하 고의 얼음 처럼 차가운 PBS-접시 당 3 mL를 추가 합니다. 셀 처리 동안 건조 하지 한다: 필요한 경우 적절 하 게 커버 액체와 셀 락 플랫폼에 얼음 양동이 놓습니다.</li>
	<li>는 기계적으로 유연한 고무 경찰관 (즉, 직접 만든 셀 긁는 도구)를 사용 하 여 배양 접시에서 PBS에서 셀을 제거 합니다. 빠르고, 원형 모션 접시, 접시 중간 하강 운동 뒤의 외부 주위에 먼저 요리에서 세포를 다쳤어요. 부드럽게 긁어 &#34; 시트 &#34; 연결 된 세포의. 부드럽게 얼음에 15 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 전송</li>
	<li>175 x g에 5 분 동안 원심 분리기와 4 ° C</li>
	<li>부드럽게 상쾌한 (SN)을 제거 하 고 펠 릿에 HB의 1-3 mL를 추가 합니다. 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 아래로 한 번 셀 resuspend 하.</li>
	<li>X g와 4 ° C. 부드럽게 제거 SN 1,355에서 7-10 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>셀 균질 수행. 
	참고: 조건 해야 부드러운 셀의 플라즈마 막 끊어집니다는 endosomes 그대로 남아 있도록 합니다.
	<li>추가 각 셀 펠 릿 (약 100 μ 셀 펠 릿 당)에 protease 억제제와 HB의 알려진된 볼륨 <ol>. 사용 하 여 1000 µ L micropipette, 부드럽게 플라스틱 아래로 셀 resuspended 때까지. 안 함 공기 방울을 소개.</li>
		<li>1 mL 투베르쿨린 주사기 22 G 바늘 HB와 미리 씻어 서와 공기 또는 거품의 무료 준비.</li>
		<li>주사기 셀 서 스 펜 션 상대적으로 천천히 ()을 피하기 위해 공기 방울을 만드는, 튜브의 벽에 바늘의 경사진된 끝 배치를 신속 하 게 연결 된 셀의 플라즈마 막에서 전단에 세포 현 탁 액을 추방.</li>
		<li>는 Homogenate (약 3 µ L)의 작은 약 수를가지고 고 유리 슬라이드에 HB의 50 µ L로 희석. 혼합 그리고 덮개 유리 coverslip로. Homogenate X 20 또는 40 X 목표 단계 대조 현미경 검사. 
		참고: 최적의 조건에서 대부분의 세포는 고장, 하지만 핵, 어두운 회색으로 표시 하 고 라운드 구조, ( 그림 1).</li>
		<li>반복 단계 3.7.3 대부분 셀까지 3.7.4 깨집니다; 일반적으로 3-6는 바늘을 통해 위아래 선 필요 하다. 단백질 결정에 대 한 homogenate의 작은 약 수 (10-30 µ L) 유지.</li>
	</ol></li> <li>1,355 g x 4에서 7 분 동안 원심 분리기 homogenate ° c. 
	참고: 후 원심 분리, 펠 릿 (핵 펠 릿;로 정의 핵 및 (postnuclear 상쾌한;으로 정의 하는 상쾌한 NP) 포함 PNS)는 cytosol와 균질 그리고 무료에 출시 세포 포함.</li>
	<li>신중 하 게 PNS를 수집합니다. 단백질을 위한 PNS와 NP의 작은 aliquots (10-30 µ L)를 유지 하 고 삭제는 NP.</li>
	<li>는 PNS PNS:62% 자당의 1:1.1 비율을 사용 하 여 함께 62% 자당 해결책을 diluting 하 여 40.6% 자당을 PNS를 조정 합니다. 공기 거품을 만들지 않고 부드럽게 하지만, 철저 하 게 혼합. 자당 농도 굴절 계를 사용 하 여 확인 하십시오.</li>
	<li>는 Ultracentrifugation 튜브의 하단에 40.6% 자당에서 PNS를 놓습니다. 신중 하 게 35% 자당 해결책의 2.5 mL와 오버레이 및 HB 원심 분리기 튜브 채울. 
	참고: 인터페이스는 명확 하 게 볼 수 있도록 계층 되어야 한다 자당 솔루션.</li>
	<li>Ultracentrifuge ̴165, 000 x g 4에서 1 시간에 대 한 그라디언트 ° c.</li>
	<li>신중 하 게 지질 그라데이션 위에 흰색 레이어를 제거합니다. 다음, HB와 200 μ micropipette 컷된 팁을 사용 하 여 35% 자당 사이 endosomes를 포함 하는 인터페이스를 수집. 
	참고: endosomal 분수 체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.</li>
	<li>PNS와 endosomal 분수의 단백질 농도 결정. 
	참고:이 농도 적어도 100 µ g/mL 해야 합니다. 적어도 100 µ g/mL와 PNS를 약 2.5 x 10 7 셀 2 페 트리 접시에 성장 필요 (위의 참고 참조).</li>
</ol> 4. Cytosol 준비 참고: 준비 2 접시 (10 cm 직경; 57 cm 2) 시작 물자로 confluent HeLa 세포의. 필요할 때는 cytosol 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심 wildtype 또는 관심사의 단백질의 돌연변이 형태를 overexpressing의 단백질의 고갈에서 준비 또한 수 있습니다. Endosome 분별 프로토콜에 관해서는 얼음에 모든 단계를 수행
<ol><li>반복 단계 3.1-3.8.</li>
	<li>PNS는 원심 분리기와 ultracentrifuge ̴250, 000 x g, 4 시 45 분에 대 한 배치 ° c.</li>
	<li>신중 하 게 위에 흰색 레이어를 제거 하 고 microsome 펠 렛을 방해 하지 않고 SN (cytosol 분수)를 수집 합니다. 단백질을 위한 cytosol 분수의 약 수를 유지. 
	참고:는 cytosol 생체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.</li>
	<li>는 cytosol의 단백질 농도 결정. 
	참고: 3 mg/mL 이상 이어야 한다.</li>
</ol> 5. 시험 측정 Endosome 종속 말라 합 체 외에서 참고: Endosome 종속 말라 합 두 가지 대체 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 첫 번째 접근 방법에서 자료는 테스트 튜브에 혼합, 고정 및는 coverslip로 전송 하며 분석 여기서 설명 하는 두 번째 방법은에서 분석 결과 수 이미징 챔버에 직접 실시 하 고 고정 고 기계적 섭 동 ( 그림 2C) 없이 분석. 이 두 번째 방법에서는, 분석 결과 혼합 하는 coverslip 테스트 튜브에서 전송 되지 않습니다 그리고 이렇게 교란, F-말라 네트워크 전송 하는 동안 물리적으로 교란 되 고의 위험을 감소 남아 있습니다. 또한,이 두 번째 방법은 F 걸 중의 시간 경과 분석와 호환 됩니다. 어느 방식으로 F-말라 합 분석에 차이가 관찰 했다에 주목 한다. 
참고: 사용 하 여 잘라 프로토콜에 걸쳐 팁.
<ol>에 테스트 튜브에 <ol><li>부드럽게 혼합 차가운 순화 GFP RAB5 endosomes (3 단계)는 얼음 처럼 차가운 1.5 mL 원뿔 테스트 튜브에 (단백질 농도)를 1시 10분의 비율로 cytosol (4 단계)와 <li>. 
		참고: 일반적인 실험은 실시 약 40-50 µ L.</li>
		<li>125 m m KCl (1 개 M KCl 재고 솔루션을 사용 하 여), 12.5 mM Hepes, 및 1.5 m m MgOAc 2 (재고 솔루션 x 50를 사용 하 여)의 최종 농도에 얼음 처럼 차가운 반응 혼합물을 조정 합니다. 다음, 10 m m leupeptin, 1 m m pepstatin, 그리고 10 ng/mL aprotinin의 최종 농도 protease 억제제와 혼합을 조정 합니다. 모든 구성 요소를 부드럽게 혼합.</li>
		<li>테스트 튜브 없이 떨고, 37 ° C에서 반응 혼합물을 포함 하 고 원하는 시간에 품 어. 
		참고: 일반적으로, 그것을 감지 말라 합 endosomes와 광범위 한 네트워크의 형성에 대 일 분에 약 3 분.</li>
		<li>원하는 시간에 (즉, 3 분 또는 30 분), 얼음에 테스트 튜브를 배치 하 여 반응을 중지 하 고 precooled 3 %PFA 솔루션의 1/10 (vol:vol) 추가.</li>
		<li>Polymerized 말라 얼룩 레드 오렌지 염색에 활용 된 200 단위/mL (~6.6 μ M) phalloidin의 0.3:10 (vol:vol) 추가.</li>
		<li>12에 혼합물의 장소 12 μ μ 마이크로 유리 슬라이드에 PVA 장착 매체의. 18 x 18 m m 2 유리 coverslipon 상단에 넣어.</li>
		<li>Confocal 현미경 검사 법으로 샘플 분석.</li>
	</ol></li> <li>이미징 챔버에 <ol><li>현미경 이미징 챔버를 사용 플라즈마 청소기 1 분 라운드 18 m m 직경 coverslip 및 라운드 35 m m 직경 20 m m 유리 바닥을 갖춘 페 트리 접시를 청소 (0.16 0.19 m m).</li>
		<li>1% β-카 세 인 단백질 바인딩 유리를 최소화 하기 위해 20 분에 있는 청소 표면 품 어. 3mm 이미와 두 번 세척.</li>
		<li>추가 endosome 고 cytosol, 같은 단계 5.1.1, 5.1.2, precooled 1.5 mL 테스트 튜브에서 혼합물 분석 결과 분석 결과 혼합물 0.1 μ g/μ rhodamine-걸을 보완.</li>
		<li>최종 굴절률 1.375 (26.5% 자당) 혼합물의 39% 자당 해결책을 사용 하 여 조정. 
		참고: 일반적으로, 동일한 볼륨 추가 됩니다; 그러나, 이것은 경험적으로 다시 자당 농도 약간 실험에서 실험을 변경 될 수 있습니다 이후는 refractomer를 사용 하 여 결정 하는 수집 된 분수의 자당 농도에 따라 조정 되어야 합니다.</li>
		<li>청소용된 35 m m 접시 (5.2.1 단계)에 혼합물을 놓고 청소용된 18 m m coverslip (5.2.1 단계)으로 커버.</li>
		<li>동요 없이 37 ° C에서 챔버 장소.</li>
		<li>형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 샘플 분석.</li>
	</ol></li></ol> 6. 이미지 Acquisition 및 분석의 말라 네트워크 <ol><li>이미지 수집 <ol><li>거꾸로 스캔 confocal 현미경에서 이미지를 수집. 
		참고: 이미지 수집 설정 63 X 1.25 나 오일 목적으로 거꾸로 스캔 confocal 현미경에 최적화 했다. 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 레이저 전원 (일반적으로 약 50%)을 조정.</li>
	</ol></li> <li>말라 네트워크의 정량화 <ol><li>형광 현미경 분석. Endosome 당 걸의 양을 측정 하는 opensource 소프트웨어 CellProfiler (v2.1.1) 12를 사용 하 여 (대체 소프트웨어를 사용할 수 있습니다).
		<ol><li>먼저, GFP RAB5 신호를 사용 하 여 기본 개체 endosomes 식별. 그런 다음 F-말라 말라 신호 전파를 사용 하 여 개별 endosomes와 관련 된 계량 (레드 오렌지 염색 활용 Phalloidin) 보조 개체로.</li>
			<li>평균 제어 조건에 각 개체에 대 한 관련된 자료의 수를 정규화.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system.">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

말라는 endosome 막 역학4,14에서 중요 한 역할을 한다. 우리 이전 보고 말라 nucleation 및 중 합 초기 endosomes에 발생 작은 F 걸 패치 또는 네트워크 형성. 이러한 F-말라 네트워크는 초기 endosomes 저하 통로 넘어 막 전송 절대적으로 필요 합니다. 이 nucleation 및 중 합 프로세스의 어떤 단계에서 방해 endosome 성숙 및 따라서 늦은 endosomes andlysosomes9...

높은 진 핵 세포, 단백질 및 지질 초기 endosomes 정렬이 발생 하는 위치에 내 면 됩니다. 일부 단백질과 지질, reutilized 될 운명, 초기 endosomes의 관 지역에 통합은 그리고 그 때 수송 된다 원형질 막 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN)1,2. 대조적으로, 다른 단백질과 지질 선택적으로 multivesicular 모양을 전시 초기 endosomes의 지역에 포장 됩니다. 이 지역 확장 하 고, 초기 endosomal 막에서 분리, 시 무료 endosomal 캐리어 소포 또는 multivesicular 시체 (ECV/MVBs), 결국 성숙한는 늦은 endosomes1, 으로 화물 운송에 대 한 책임 2.
말라는 endosomal 정렬 용량과 endosome 속과 관련 된 막 개장 과정에서 중요 한 역할을 한다. 원형질 막 또는 TGN 재활용 경로 따라 정렬 단백질 복잡 한 retromer와 관련 된 단백질에 따라 달라 집니다. 이 정렬 기계 재활용 tubules 통해 상호 작용의 복잡 한, retromer의 말 벌 및 흉터 homologue (세척) 복잡 하 고 분기 말라3,4,5 형성에 결합 될 것 . 반면, 분자 저하에 대 한 운명, 특히 신호 수용 체 활성화, endosomal 단지 전송 (ESCRT)2,6,에 필요한 정렬 정렬할 intraluminal 소포 (ILVs)으로 7. ESCRT-종속 정렬 과정에서 말라의 가능한 역할을 알 수 없습니다 하는 동안 F-걸 ECV/MVBs의 속에 그리고 이른 endosomes 넘어 전송에 중요 한 역할을 재생 합니다. 특히, 우리 콜레스테롤 풍부한 지역 초기 endosome의 spire1 함께 바인딩합니다 annexin A2, F-말라 합 nucleates 발견. Endosomes에서 분기 말라 네트워크의 형성 필요 걸 관련 단백질 (ARP) 2/3의 분기 활동, 복합 음 단백질 moesin 고 말라-바인딩 단백질 cortactin8,9.
여기, 우리가 시험관에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 시험관에서 이른 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 설명 합니다. 이 분석 결과 이전 F-말라 nucleation에서 A2 annexin의 moesin 및 cortactin endosomal 걸 네트워크8,9의 형성에의 역할을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 이 생체 외에서 프로토콜 말라 합 동안 endosomes에 발생 하는 반응의 복잡 한 시리즈 될 걸 nucleation, 선형을 포함 하 여 과정의 순차적 단계의 생 화 학적 및 분자 분석에 순종 중 합, 분기, 고 가교입니다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acetate tetrahydrate</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actin rhodamine</td><td>Cytoskeleton. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Round 10 cm dishes for cell culture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropylen tube</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle 22G Black 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro glass slides</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18-mm glass coverslip</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&amp;mu;L yellow tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&amp;mu;L Blue Graduated Tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL test tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round coverslip</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Homemade</td><td></td><td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH Meter 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

많은 초기 endosome 기능, 특히 화물 단백질 정렬 및 막 변형, endosomal 막에 nucleated 짧은 F 걸 필 라 멘 트의 따라 달라 집니다. 우리는 설립 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 의무가 유전 그리고 생 화 확 적인 반응의이 복잡 한 시리즈를 렌더링 조작입니다. Endosomal 분수 부양 초기 endosomal 단백질 GFP RAB5을 표현 하는 세포에서 자당 기온 변화도에 의해 준비 된다. Cytosolic 분수 셀의 별도 일괄 처리에서 준비 된다. Endosomal와 cytosolic 분수 저장할 수 있습니다 액체 질소에서 냉동 필요한 경우. 분석 결과, endosomal와 cytosolic 분수, 혼합 한 혼합물은 적절 한 조건 (예를 들어, 이온 강도, 감소 환경)에서 37 ° C에서 알을 품을. 원하는 시간에 반응 혼합물을 고정 하 고 F 걸 phalloidin로 드러났습니다. 말라 nucleation와 중 합 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 된다. 여기, 우리는이 분석 결과 말라 nucleation 막, 또는 후속 신장, 분기, 또는 F 걸 필 라 멘 트의 가교에 관련 된 요인의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다 보고 합니다.

초기 endosome 막에 F 걸 패치의 형성에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리 그림 2에 설명 된 프로토콜을 따 랐 다. 간단히, 셀 GFP RAB5와 페 했다 고 초기 endosomes subcellular 분류에 의해 준비 되었다. 이러한 정화 초기 endosomes 자체 뿐만 아니라 다른 요인 가능성이 반응에 관련 된 걸 수 있도록 cytosol와 인 큐베이 팅 했다. 잠복기의 끝에, 반응 혼합물의 고정에 ?...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K 조회수.  University of Geneva. 초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

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Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

신경과학

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

생화학

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

생체공학

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

상업적으로 이용 가능한 단백질을 사용한 액틴 기반 운동성의 재구성

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces using motor proteins such as myosin II and kinesin to drive key processes such as migration, cytokinesis, adhesion, and mechanosensing. While actin-microtubule interactions are key to the cytoskeleton's versatility and adaptability, an understanding of their interplay with myosin and kinesin activity is still nascent. This work describes how to engineer tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules that undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers. Protocols for fluorescence labeling of the microtubules and actin filaments to most effectively visualize composite restructuring and motion using multi-spectral confocal imaging are also detailed. Finally, the results of data analysis methods that can be used to quantitatively characterize non-equilibrium structure, dynamics, and mechanics are presented. Recreating and investigating this tunable biomimetic platform provides valuable insight into how coupled motor activity, composite mechanics, and filament dynamics can lead to myriad cellular processes from mitosis to polarization to mechano-sensation.

This paper presents protocols for engineering and characterizing tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules. Composites undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

Actin Polymerization and Cell Motility

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. Actin monomers polymerize to form a complex network of polarized filaments, the actin cytoskeleton, that plays a crucial role in many cellular processes, including cell motility, division, endocytosis, and metastasis of cancer cells.
Actin cytoskeleton dynamics can produce pushing, pulling, and resistance forces that help the cell to migrate. This is achieved by forming different types of membrane protrusions, depending on the cell type and the extracellular signals. Primarily, cells move by recurrent cycles of protrusion and attachment of the cell front to the substratum, followed by detachment and retraction at their rear end.
The human genome encodes six highly conserved actin proteins&#8212;ACTC1, ACTA1, ACTA2, ACTG1, ACTG2, and ACTB; all expressed in different cell types. Mutations in any of these six actin genes or the genes encoding actin-binding proteins can lead to disease. For example, mutations in the ACTA1 gene can lead to muscle weakness, especially in the respiratory muscles, which can cause breathing difficulties &#8212; a condition called Nemaline Myopathy. Similarly, mutations in the WAS gene, a key regulator of actin filament nucleation, which is important for cell adhesion, chemotaxis, and phagocytosis of immune cells, causes Wiskott Aldrich syndrome in humans.

액틴 중합 및 세포 운동성

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. ...