Destek İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan aldığı; İsviçre Sinergia programı; Lehçe-İsviçre araştırma programı (2010/PSPB-094); NCCR Kimya Biyoloji; ve LipidX İsviçre SystemsX.ch girişimi üzerinden değerlendirilir (J. G. için) İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından. O. M. bir EMBO uzun vadeli Bursu (ALTF-516-2012) tarafından desteklenmiştir.

1. çözümleri ve ürünleri Not: tüm arabellekleri ve çözümleri (dd) H çift distile 2 ' O. hazırlanmalıdır Sükroz hidrasyon durumu değiştiğinden, tüm Sükroz çözümler son konsantrasyonu bir Refraktometre kullanarak belirlenmelidir.
<ol><li>Hazırla fosfat tamponlu tuz olmadan divalent katyonlar (PBS-): 137 mM NaCI, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 ve 6.5 mM Na 2 HPO 4. PH 7.4 için ayarlayın. Isıyla (15dk için 121 ° C'de 1 dönüşü) tarafından sterilize ve mağaza oda sıcaklığında.</li>
	<li>300 mM imidazole stok çözeltisi hazırlamak: 0,204 g imidazole GKD 2 pH 7.4 HCl. filtre sterilize-0.22 mikron kullanarak kullanarak 4 ° C'de için boyut filtresi gözenek ve depolamak saat 4'te O.Adjust 10 ml ° C.</li>
	<li>Hazırlama homojenizasyon arabellek (HB; yaklaşık 100 mL hazırlamak): 250 mM Sükroz 3 mM imidazole içinde. PH 7.4 pH-metre kullanarak 4 ° C'de için ayarlayın. 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize ve depolamak saat 4'te ° C. tamamlayıcı HB kullanmadan önce proteaz inhibitörleri 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A ve 10 ng/mL aprotinin karşılık gelen son konsantrasyonlarda bir kokteylle.</li>
	<li>Adım flotasyon degradeler için %62, % 39 ve 3 mM imidazole, pH 7.4, % 35 Sükroz çözümleri aşağıda açıklandığı gibi hazırlamak. Tam bir Refraktometre kullanarak tüm Sükroz çözümler son konsantrasyonu belirlemek.
	<ol><li>3 mM imidazole, pH %7,4 62 Sükroz çözümde hazırlamak 100 mL. Erime 80,4 g Sükroz GKD 2 içinde O karıştırma tarafından önceden ısındı 35 ° C. Ekle 1 ml 300 mM imidazole hisse senedi çözüm ve dolgu GKD 2 O. ayarlama ile 100 ml pH 7.4 için saat 4'te ° C. filtre sterilize etmek-bir 0,22 mikron gözenek boyutu filtre ve mağaza kullanarak 4 ° C'de</li>
		<li>100 mL % 35 Sükroz çözeltisi içinde 3 mM imidazole, pH 7.4 hazırlayın. 300 mM imidazole hisse senedi çözüm GKD 2 O. eklemek 1 ml sukroz 40,6 g karıştırma tarafından dağıtılması ve GKD 2 O. ayarlama ile 100 ml pH 4 ° C. filtre sterilize kullanarak 0,22 mikron gözenek boyutu filtre ve depolamak saat 4'te 7.4 için doldurmak ° C.</li>
		<li>50 mL 3 mM imidazole, pH %7,4 39 Sükroz hazırlayın. % 35 Sükroz çözüm % 62 Sükroz Çözümle sulandırmak. Mağaza 4 ° C'de</li>
	</ol></li> <li>Dropwise 1 M NaOH ekleme süre karıştırma 100 ml PBS-ön warmed 60 ° c tarafından 3 g-in paraformaldehyde (PFA) dağıtılması; son pH 7.4 NaOH kullanarak için ayarlayın. 0,22-mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize ve depolamak -20 ° c 
	Dikkat: %3 PFA olan toksik bir reaktif.</li>
	<li>1 M KCl hazırlamak hisse senedi çözüm. 50 ml GKD 2 O. filtre sterilize-0,22-mikron gözenek boyutu filtre karıştırma tarafından KCl 3.73 g dağıtılması ve mağaza oda sıcaklığında.</li>
	<li>-20, pH 7,0 ve 75 mm MgOAc 2 GKD 2 O. Aliquot ve store 0.625 M Hepes içeren konsantre hazırla 50 X hisse senedi çözüm ° C.</li>
	<li>Hazırlık montaj orta. Poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) 2.4 g 6 g gliserol ile karıştırma karıştırın. GKD 2 O 6 mL ekleyin ve oda sıcaklığında en az 2 h için bırakın. 12 0.2 mL ekleyin M Tris-Cl (pH 8,5) ve ısı yaklaşık 53 ° PVA eriyene kadar ara sıra karıştırarak ile c.</li>
	<li>Tarafından Santrifüjü 5000 x g oda sıcaklığında 20 dakika için de çözüm açıklamak. Süpernatant toplamak ve % 2.5 (w/v) 1,4 eklemek - diazabicyclo-[2.2.2] oktan photobleaching floresan algılama sırasında önlemek için (DABCO). Yaklaşık 30 için girdap çözülmeye s. Aliquot 1.5 mL plastik tüpler ve mağaza -20 ° c</li>
</ol> 2. Hücre kültür <ol><li>Dulbecco kültür HeLa hücreleri &#39; s % 10 fetal buzağı serum ile % 10 esansiyel olmayan amino asitler, takıma modifiye kartal orta %10 L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin. %5 CO 2 kuluçka 37 ° C'de proje.</li>
	<li>Hücreleri ile ticari transfection reaktif üreticiye göre kullanarak GFP-RAB5 10 deneme önce 24 h transfect &#39; s yönergeleri.</li>
	<li>Gerektiğinde, endosomal kesirler ve faiz (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) ve/veya wildtype ya da mutant formu protein ilgi overexpressing bir protein tükenmiş hücrelerden sitozol hazırlayın.</li>
</ol> 3. Endosomal kesir hazırlık Not: endosomes ve diğer hafif membranlar içeren hücre altı fraksiyonları basit hazırlanması bu protokolünü açıklar. Gerekirse, saf endosome kesirler de kullanılan 11 olabilir. Konfluent hücre GFP-RAB5 malzeme başlangıç olarak ifade 2 Petri yemekler (10 cm dış çap; 57 cm 2) hazırlayın. 2 Petri yemeklerinde Konfluent HeLa hücreleri toplam sayısı yaklaşık 2.5 x 10 7 hücreleri karşılık gelir. Ne zaman endosomes de hazırlıklı bir protein (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) faiz ve/veya wildtype ya da mutant formu faiz protein overexpressing, her zaman GFP-RAB5 ifade tükenmiş hücrelerden.
 dikkat: Ayırma Protokolü'nün tüm merdiven-meli var olmak kılınmak buz üzerinde
<ol><li>İçinde düz bir buz kovası Petri yemekler ıslak bir metal plaka üzerine yerleştirin ve hemen buz gibi PBS - 5 mL iki kez hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Tüm PBS - son yıkama servisinden kaldırın ve buz gibi PBS-çanak başına 3 mL ekleyin. Hücreleri değil işleme sırasında kuru: gerekirse, yeterli sıvı içeren hücreleri kapsayacak şekilde sallanan bir platform üzerinde buz kovası yerleştirin.</li>
	<li>Mekanik PBS Petri yemekler bir esnek kauçuk polis (Yani, ev yapımı hücre kazıyıcı) kullanarak hücreleri kaldırın. Hücreleri bulaşıkları dışına ilk yemeğin ortasında aşağı doğru bir hareket ardından yemeğin dışında etrafında hızlı, dairesel bir hareketle kazı. Yavaşça elde etmek için yara &#34; çarşaf &#34; bağlı hücre. Yavaşça buz üzerinde 15 mL konik polipropilen boru için geniş bir açılış ile bir plastik Pasteur pipet kullanarak hücreleri transferi</li>
	<li>175 x g de 5 dk santrifüj ve 4 ° c</li>
	<li>Yavaşça süpernatant (SN) kaldırın ve HB 1-3 mL Pelet için ekleyin. Bir plastik Pasteur pipet geniş bir açılış ile kullanarak yavaşça pipet yukarı ve aşağı bir kez hücreleri resuspend için.</li>
	<li>1,355 x g ve 4 ° C. yavaşça kaldır SN, 7-10 dk santrifüj.</li>
	<li>Hücre homojenizasyon gerçekleştirmek. 
	Not: Koşullar böylece hücrelerin plazma zarı koptu ama endosomes korunacak nazik olmalıdır.
	<ol><li>Ekle HB birimi her hücre Pelet (hücre Pelet başına yaklaşık 100 μL) üzerine proteaz inhibitörleri ile bilinen bir. Hücreleri resuspended kadar 1.000-µL micropipette kullanarak, yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Yapma Hava kabarcıkları tanıtmak.</li>
		<li>1 mL tüberkülin şırınga 22 G iğne ile önceden HB ile durulanır ve hava veya bubbles ücretsiz hazırlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ile nispeten yavaş yavaş (Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmak için) şırıngaya doldur, eğimli tüp duvara iğne ucu yerleştirin ve hızla ekli hücreler plazma zarı yamultmak için hücre süspansiyon sınırdışı.</li>
		<li>Homogenate (yaklaşık 3 µL) küçük bir aliquot al ve HB 50 µL bir cam slayt üzerinde içine oranında seyreltin. Mix ve bir cam coverslip ile kaplayın. Homogenate X 20 veya 40 X amacı ile donatılmış bir faz kontrast mikroskop altında incelemek. 
		Not: optimum koşullar altında en hücreleri kırık, ama koyu gri görünür ve yapıları turu, çekirdek değildir ( şekil 1).</li>
		<li>Tekrarlama adım 3.7.3 ve 3.7.4 en hücreleri kadar kırık; genellikle, iğne ile 3-6 alçalarak vuruş gereklidir. Homogenate protein tayini için küçük bir aliquot (10-30 µL) devam.</li>
	</ol></li> <li>1,355 g x ve 4 7 dk santrifüj homogenate ° C. 
	Not: Santrifüjü sonra Pelet (tanımlı nükleer Pelet; Çekirdekleri ve (postnuclear süpernatant; tanımlanan süpernatant NP) içerir PNS) içeren sitozol ve üzerine homojenizasyon ve ücretsiz süspansiyon piyasaya organelleri.</li>
	<li>Dikkatle PNS toplamak. Protein tayini için PNS ve NP küçük aliquots (10-30 µL) tutmak ve NP atın.</li>
	<li>PNS:62% Sükroz 1:1.1 oranını kullanarak PNS ile % 62 Sükroz çözüm sulandrarak PNS %40.6 Sükroz için ayarlayın. Yavaşça ama iyice, hava kabarcıkları oluşturmadan karıştırın. Refraktometre kullanarak Sükroz konsantrasyonu kontrol.</li>
	<li>PNS %40.6 Sükroz ultrasantrifüj tüp alt yerleştirin. Yerleşimi dikkatle 2.5 mL % 35 Sükroz çözeltisi ve santrifüj tüpü ile HB doldurun. 
	Not: arabirimleri açıkça görünecek şekilde Sükroz çözümleri katmanlı.</li>
	<li>Ultracentrifuge ̴165, 000 x g ve 4 1 h için degradeleri ° C.</li>
	<li>Lipidler geçişin üstüne beyaz tabakası dikkatli bir şekilde çıkarın. Ardından, endosomes, sert kapak Ciltli ve % 35 sukroz, 200 μL micropipette ile kesilmiş bir ucu kullanarak arasında içeren arabirim toplamak. 
	Not: Endosomal kesirleri doğrudan vitro aktin polimerizasyon assay olarak kullanılabilir veya buz, flash-sıvı azot içinde donmuş bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C.</li>
	<li>PNS ve endosomal kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 
	Not: Bu konsantrasyon en az 100 µg/mL olması gerekir. Yaklaşık 2.5 x 10 7 hücreleri 2 Petri yemeklerinde yetiştirilen bir PNS en az 100 µg/mL ile elde etmek için ihtiyaç vardır (yukarıdaki nota bakın).</li>
</ol> 4. Sitozol hazırlık Not: malzeme başlangıç olarak Konfluent HeLa hücrelerin hazırlamak 2 Petri yemekler (10 cm çapında; 57 cm 2). Gerektiğinde, sitozol faiz (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) ve/veya wildtype veya ilgi proteinin mutant formu overexpressing bir protein tükenmiş hücrelerden de hazırlanabilir. Endosome Ayırma Protokolü gelince, tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirilmesi gereken
<ol><li>3.1-3,8 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Bir santrifüj tüpü ve ultracentrifuge için ̴250, 000 x g ve 4, 45 dk PNS yeri ° C.</li>
	<li>Dikkatle üstüne beyaz katmanı kaldırın ve microsome Pelet bozmadan SN (sitozol kesir) toplamak. Bir aliquot protein tayini için sitozol fraksiyonunun devam. 
	Not: Sitozol doğrudan vitro aktin polimerizasyon assay olarak kullanılabilir veya buz, flash-sıvı azot içinde donmuş bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C.</li>
	<li>Sitozol protein konsantrasyonu belirlemek. 
	Not: En az 3 mg/mL olmalıdır.</li>
</ol> 5. Tahlil ölçüm Endosome bağımlı aktin polimerizasyon In Vitro Not: Endosome bağımlı aktin polimerizasyon gerçekleştirilen iki alternatif yaklaşımlar kullanarak. İlk yaklaşımda malzemeler bir test tüpü içinde karışık, sabit ve bir coverslip transfer ve analiz. Burada, açıklanan ikinci yaklaşımda tahlil doğrudan görüntüleme odasında gerçekleştirilebilmesi ve sabit ve mekanik pertürbasyon ( şekil 2C) analiz. Bu ikinci yaklaşımda tahlil karışımı bir test tüpünden bir coverslip için aktarılmaz ve böylece soğukkanlı, F-aktin ağlara fiziksel aktarım sırasında tedirgin tehlikesi azalan kalır. Buna ek olarak, bu ikinci yaklaşım F-aktin polimerizasyon hızlandırılmış bir analizi ile uyumludur. F-aktin polimerizasyon analizi hiçbir fark her iki yaklaşım ile gözlenmiştir unutulmamalıdır. 
Not: Kullanım ipuçları protokol boyunca kesti.
<ol><li>Bir test tüpü içinde <ol><li>yavaşça karışımı buz gibi saf GFP-RAB5 endosomes (Adım 3) sitozol (Adım 4) 1:10 (protein konsantrasyonu) olan bir buz gibi 1.5 mL konik test tüpünde oranında ile. 
		Not: Tipik bir deney ile yaklaşık 40-50 µL gerçekleştirilir.</li>
		<li>125 mM (1 M KCl hisse senedi çözüm kullanarak) KCl, 12,5 mM Hepes ve 1.5 mM MgOAc 2 (50 x hisse senedi çözüm kullanarak) son konsantrasyonları buz gibi tepki karışıma ayarlayın. Sonra karışımı proteaz inhibitörleri 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A ve 10 ng/mL aprotinin son konsantrasyonları ile ayarlayın. Tüm bileşenleri karışımı yavaşça.</li>
		<li>Sallayarak olmadan, 37 ° C'de tepki karışımı içeren deney tüpü yerleştirin ve istenen süre kuluçkaya. 
		Not: Genellikle, aktin polimerizasyon endosomes ve geniş bir ağ oluşumu için 30 dk algılamak için yaklaşık 3 dakika sürer.</li>
		<li>İstediğiniz zaman (Yani, 3 dk ya da 30 dk), buz üzerinde test tüpü yerleştirerek reaksiyonu durdurmak ve 1/10 (vol:vol) precooled % 3 PFA çözüm eklemek.</li>
		<li>, Kırmızı-turuncu boya polimerli aktin leke Birleşik 200 adet/mL (~6.6 mikron) phalloidin 0.3:10 (vol:vol) ekleyin.</li>
		<li>Yer 12 μL 12 üzerine karışımı μL PVA montaj orta bir mikro cam slayt üzerinde. 18 x 18 mm 2 cam coverslipon top koyun.</li>
		<li>Confocal mikroskobu ile örneğini analiz.</li>
	</ol></li> <li>Görüntüleme odasında <ol><li>mikroskobik görüntüleme chambers, plazma temizleyici 1 dakika yuvarlak 18 mm çaplı coverslip ve bir yuvarlak 35 mm çapı 20 mm cam alt ile donatılmış Petri kabına temizlemek için yapmak, (0.16-0,19 mm).</li>
		<li>% 1 β-kazein protein bağlayıcı cama en aza indirmek 20 dakika ile temizlenmiş yüzeyler kuluçkaya. 3 mM imidazole ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Ekle endosome ve aynı sitozol tahlil karışımı olduğu gibi 5.1.1 ve 5.1.2, precooled 1,5 mL tüp bebek adımları ve tahlil karışımı 0,1 μg/μL rodamine-aktin ile tamamlayıcı.</li>
		<li>Son kırılma % 39 Sükroz çözüm kullanarak dizin 1.375 (%26,5 Sükroz) için karışımı ayarlayın. 
		Not: Genellikle, aynı birimin eklenir; Ancak, bu ampirik olarak yeniden Sükroz konsantrasyon biraz deneme deneme değişebilir bu yana bir refractomer kullanarak toplanan kesir Sükroz konsantrasyonu bağlı olarak ayarlanmış olmalı.</li>
		<li>Ön işleme 35-mm çanak (Adım 5.2.1) karışımı yerleştirin ve ön işleme 18 mm coverslip (Adım 5.2.1) ile yeter.</li>
		<li>Odası, sallayarak olmadan 37 ° C'de yer.</li>
		<li>Confocal floresan mikroskopisi kullanılarak örneğini analiz.</li>
	</ol></li></ol> 6. Görüntü Acquisition ve aktin ağ analizi <ol><li>resim alma <ol><li>elde etmek belgili tanımlık imge üstünde ters bir tarama confocal mikroskobu. 
		Not: 63 X 1,25 NA petrol amaç ters bir tarama confocal mikroskopla için görüntü alma ayarlarını optimize. İyi bir sinyal / gürültü oranı elde etmek için lazer güç (genellikle % 50) ayarlamak.</li>
	</ol></li> <li>Miktar aktin ağının <ol><li>Floresan Filmler analiz. Açık kaynak kodlu yazılım CellProfiler (v2.1.1) 12 aktin endosome ücret miktarını ölçmek için kullanın (alternatif yazılım kullanılabilir).
		<ol><li>İlk, GFP-RAB5 sinyal kullanarak birincil nesne olarak endosomes belirlemek. O zaman, F-aktin aktin sinyal yayma kullanarak bireysel endosomes ile ilişkili ölçmek (kırmızı-turuncu boya Birleşik Phalloidin) ikincil bir nesne olarak.</li>
			<li>Ortalama ve her nesne için denetim durumu için ilişkili malzeme sayısı normale.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li><li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+Maturation,+Transport+and+Functions.">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li><li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains.">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li><li>Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-mediated+endosomal+protein+sorting:+all+WASHed+up!.">Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!.</a> Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).</li><li>Woodman, P. G., Futter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+bodies:+co-ordinated+progression+to+maturity.">Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).</li><li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ESCRT+pathway.">The ESCRT pathway.</a> Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li><li>Morel, E., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A2+binding+to+endosomes+and+functions+in+endosomal+transport+are+regulated+by+tyrosine+23+phosphorylation.">Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).</li><li>Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin+and+cortactin+control+actin-dependent+multivesicular+endosome+biogenesis.">Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis.</a> Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).</li><li>Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+membrane+domains+on+endosomes+in+the+recycling+pathway+visualized+by+multicolor+imaging+of+Rab4,+Rab5,+and+Rab11.">Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11.</a> J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).</li><li>Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A2-dependent+polymerization+of+actin+mediates+endosome+biogenesis.">Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis.</a> Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+and+molecular+motors+in+endosomal+dynamics.">The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics.</a> Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).</li><li>Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+II+regulates+multivesicular+endosome+biogenesis+in+the+degradation+pathway+of+animal+cells.">Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells.</a> EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).</li><li>Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rab5+controls+early+endosome+fusion+in+vitro.">rab5 controls early endosome fusion in vitro.</a> Cell. 64 (5), 915-925 (1991).</li><li>Wandinger-Ness, A., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+proteins+and+the+compartmentalization+of+the+endosomal+system.">Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).</li><li>Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system.">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Aktin, endosome membran dynamics4,14' te önemli bir rol oynar. Biz daha önce aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon erken endosomes üzerinde oluşan küçük F-aktin yamalar veya ağları kurma bildirdi. Bu F-aktin ağlar membran taşıma düşmesine yol boyunca erken endosomes ötesinde için kesinlikle gereklidir. Bu çekirdekleşme ve polimerizasyon sürecinin herhangi bir aşamasında müdahale endosome olgunlaşması ve böylece geç endosomes andlysosom...

Daha yüksek ökaryotik hücrelerde, proteinler ve yağlar sıralama oluştuğu erken endosomes içselleştirilmiş. Bazı proteinler ve yağlar, reutilized kaderinde vardır, erken endosomes borulu bölgelere dahil ve plazma zarı veya trans-Golgi ağ (TGN)1,2nakletti. Buna karşılık, diğer proteinler ve yağlar multivesicular bir görünüm sergileyen erken endosomes bölgelere seçmeli olarak paketlenir. Bu bölgeleri genişler ve erken endosomal membran üzerinden dekolmanı sonunda kart ücretsiz endosomal taşıyıcı veziküller veya multivesicular organları (ECV/MVBs), hangi kargo taşımacılığı geç endosomes1, karşı sorumlu değil 2.
Aktin endosomal sıralama kapasite ve endosome Biyogenez ile ilişkili membran tadilat sürecinde önemli bir rol oynar. Plazma zarı veya TGN geri dönüşüm yolları sıralama protein retromer karmaşık ve ilişkili proteinler bağlıdır. Bu sıralama makine oluşumu geri dönüşüm tübüllerin yolu ile etkileşimleri karmaşık, retromer, eşek ARISI ve yara izi homologue (yıkama) karmaşık ve dallı aktin3,4,5 ile birleştiğinde olabilir gibi görünüyor . Buna ek olarak, moleküller bozulması için mukadder, özellikle sinyal reseptörleri aktive, intraluminal veziküller (ILVs) taşıma (ESCRT)2,6içingerekli kompleksleri sıralama endosomal göre sıralanır, 7. Aktin ESCRT bağlı sıralama sürecinde olası rolü bilinen değil iken, F-aktin ECV/MVBs Biyogenez ve taşıma erken endosomes ötesinde önemli bir rol oynar. Özellikle, A2 annexin kolesterol zenginleştirilmiş bölgeler erken endosome ve spire1 ile birlikte bağlar, F-aktin polimerizasyon nucleates bulduk. Endosomes üzerinde gözlenen dallı aktin ağ oluşumu aktin ile ilgili protein (ARP) 2/3 dallanma etkinliğin gerektirdiği kompleksi, hem de ERM protein moesin ve aktin bağlayıcı protein cortactin8,9.
Burada, biz çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklayın. Bu tahlil A2 F-aktin çekirdekleşme içinde annexin ve moesin ve cortactin endosomal aktin ağları8,9oluşumunda rol araştırmak için daha önce kullanılmış. Bu vitro protokolü ile endosomes aktin polimerizasyon sırasında ortaya çıkan tepkiler karmaşık dizi aktin çekirdekleşme, doğrusal bir işlemi, sıralı adımları biyokimyasal ve moleküler analiz mükellef haline polimerizasyon, dallanma ve çapraz.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acetate tetrahydrate</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actin rhodamine</td><td>Cytoskeleton. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Round 10 cm dishes for cell culture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropylen tube</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle 22G Black 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro glass slides</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18-mm glass coverslip</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&amp;mu;L yellow tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&amp;mu;L Blue Graduated Tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL test tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round coverslip</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Homemade</td><td></td><td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH Meter 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

Birçok erken endosome işlev, özellikle kargo protein sıralama ve membran deformasyon, endosomal membran parçalanmayabilir kısa F-aktin filamentleri yamalari bağlıdır. Biz böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi genetik ve biyokimyasal mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil kurduk manipülasyonlar. Endosomal kesirler flotasyon erken endosomal protein GFP-RAB5 ifade hücrelerden Sükroz Degradelerde tarafından hazırlanır. Sitozolik kesirler hücreler ayrı gruplar halinde hazırlanır. Hem endosomal hem sitozolik kesirler sıvı azot içinde donmuş gerekirse depolanabilir. Tahlil, endosomal ve sitozolik kesirler karıştırılır ve karışım uygun koşullarda (çevre azaltılmasıÖrneğin, iyonik gücü,) 37 ° C'de inkübe. İstenen zamanda tepki karışımı sabit ve F-aktin phalloidin ile ortaya çıkar. Aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon Floresans mikroskobu tarafından incelenir. Burada, bu tahlil ya aktin çekirdekleşme membran veya sonraki uzama, dallanma veya F-aktin filamentleri polietilenin söz konusu faktörler rol araştırmak için kullanılabilir raporu.

F-aktin yamalar üzerinde erken endosome membran oluşumu anlayışlar kazanmak için Şekil 2' de belirtilen iletişim kuralı takip ettik. Kısaca, hücreleri GFP-RAB5 ile transfected ve o zaman erken endosomes hücre altı ayırma tarafından hazırlanmıştır. Bu saf erken endosomes kendisi gibi diğer faktörler tepki muhtemelen katılan aktin sağlamak sitozol ile inkübe. Kuluçka dönemi sonunda, reaksiyon karışımı fiksasyonu tarafından durdurul...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes at JoVE.com

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

in-vitro-polymerization-of-f-actin-on-early-endosomes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Görüntüleme.  University of Geneva. Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.

Video: In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Biyoloji

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Nörobilim

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Biyokimya

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Biyomühendislik

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Aktin bazlı hareketliliğin ticari olarak temin edilebilen proteinlerle yeniden yapılandırılması

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces using motor proteins such as myosin II and kinesin to drive key processes such as migration, cytokinesis, adhesion, and mechanosensing. While actin-microtubule interactions are key to the cytoskeleton's versatility and adaptability, an understanding of their interplay with myosin and kinesin activity is still nascent. This work describes how to engineer tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules that undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers. Protocols for fluorescence labeling of the microtubules and actin filaments to most effectively visualize composite restructuring and motion using multi-spectral confocal imaging are also detailed. Finally, the results of data analysis methods that can be used to quantitatively characterize non-equilibrium structure, dynamics, and mechanics are presented. Recreating and investigating this tunable biomimetic platform provides valuable insight into how coupled motor activity, composite mechanics, and filament dynamics can lead to myriad cellular processes from mitosis to polarization to mechano-sensation.

This paper presents protocols for engineering and characterizing tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules. Composites undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers.

Aktin-Mikrotübül Kompozitlerinin Ayarlanabilir Motor Tahrikli Dinamiği ve Mekaniği ile Yeniden Yapılandırılması ve Karakterize Edilmesi

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

Actin Polymerization and Cell Motility

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. Actin monomers polymerize to form a complex network of polarized filaments, the actin cytoskeleton, that plays a crucial role in many cellular processes, including cell motility, division, endocytosis, and metastasis of cancer cells.
Actin cytoskeleton dynamics can produce pushing, pulling, and resistance forces that help the cell to migrate. This is achieved by forming different types of membrane protrusions, depending on the cell type and the extracellular signals. Primarily, cells move by recurrent cycles of protrusion and attachment of the cell front to the substratum, followed by detachment and retraction at their rear end.
The human genome encodes six highly conserved actin proteins&#8212;ACTC1, ACTA1, ACTA2, ACTG1, ACTG2, and ACTB; all expressed in different cell types. Mutations in any of these six actin genes or the genes encoding actin-binding proteins can lead to disease. For example, mutations in the ACTA1 gene can lead to muscle weakness, especially in the respiratory muscles, which can cause breathing difficulties &#8212; a condition called Nemaline Myopathy. Similarly, mutations in the WAS gene, a key regulator of actin filament nucleation, which is important for cell adhesion, chemotaxis, and phagocytosis of immune cells, causes Wiskott Aldrich syndrome in humans.

Aktin Polimerizasyonu ve Hücre Hareketliliği

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. ...