このプロジェクトは、カナダ健康研究所のPG＃20R47867によって支援されました。

ビオチン化によるアストロサイトにおける相対的細胞表面タンパク質発現の測定注：ここでは、水透過性チャネルアクアポリン-4（AQP4）の細胞表面局在に対する細胞外マトリックス分子ラミニンの効果の研究へのこのビオチン化技術の応用を示す。このアッセイに必要な特殊材料には、スルホ-NHS-LC-ビオチンとストレプトアビジン - アガロース樹脂が含まれます（ 表の表を参照）。 <ol><li> Noel et al。 図12に示すように、アッセイの約2週間前に皮質星状細胞の培養物を調製し、75cm 2通気培養フラスコ中でそれらを増殖させる。星状細胞が80〜90％コンフルエントである場合、0.05％トリプシンを用いてそれらを培養表面から分離し、次いでそれらを1：3で通過させる。 </li><li>アッセイの48時間前に、細胞が再び80〜90％コンフルエントになると、通過星状細胞1：3（c培養形式でハンギング）を、60mm細胞培養皿上に置き、実験が行われる日に70％を超えるコンフルエントになるようにする。細胞が皿の間に均等に分配されるようにします。 </li><li>アッセイの16時間前に、ラミニンを培地中にピペットで最終濃度24nMとし、37℃でインキュベートする。 </li><li> CM-PBS（1X PBS中100mg / L MgCl 2・6H 2 Oおよび100mg / L CaCl 2 、pH7.4）、ビオチン緩衝液（0.5（pH7.4））中で、以下のように調製し、 CM-PBS中の50mM NH 4 Cl）、消化緩衝液（25mM Tris、pH7.4,25mMグリシン、150mM NaClおよび5mM）中のスルホ-NHS-LC-ビオチン） 1％トリトンX-100,1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル）、3Xローディングバッファー（150mMトリス、pH6.8,6％SDS、30％グリセロール、300mM DTTおよび0.01％ブロモフェノールブルー）および洗浄緩衝液（10mMトリス（pH7.4）、1.5mMのEDTA、150mMのNaCl、1％のTriton X-100,1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 </li><li>レムインキュベーターから星状細胞培養物を保持するオーブンの皿を取り出し、培地を捨てる。 </li><li> 4 mLの冷たいCM-PBSで細胞を3回洗浄し、皿を砕いた氷上に置きます。 </li><li>ピペット2mLのビオチン緩衝液を各ウェルに入れ、皿を前後に数回ゆっくりと数回傾けて、完全な被覆を確実にする。氷上に30分間放置する。 </li><li>アスピレーターを用いてビオチンバッファーを除去し、4mLクエンチングバッファーと交換する。氷上に10分間放置する。 </li><li>クエンチングバッファーを吸引し、同等の容量のものと交換してください。再度、氷上に10分間放置する。 </li><li>クエンチングバッファーを捨て、4 mLの冷えたCM-PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li>セルリフタを使用して1mLの冷却したCM-PBSに細胞をこすり、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移す。 </li><li>ペレット細胞を100×gで3分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、500μLの溶解緩衝液中で細胞を再懸濁する。 </li><li>サンプルを氷上で30分間放置するか、5分ごとにボルテックスするか、またはpl4℃でエンドオーバー・ローテーターを使用してください。 </li><li>ライセートを14,000 xgで10分間4℃で遠心分離して、界面活性剤不溶性物質を沈殿させます。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移す。 <ol><li>このライセートを50μL保存し、ローディングバッファーを追加します。次いで、それを乾燥浴中で95℃で加熱することによって変性させる;これは、ビオチン化細胞表面タンパク質および非ビオチン化細胞質タンパク質の両方を含有する「入力」画分である。 </li></ol></li><li>一対の鋭いはさみを使用して、先端から約0.5 cmの材料を切断してピペットチップの開口部を広げます。このピペットチップを使用して、75μLのストレプトアビジン - アガロースビーズ（通常4℃で保存）をライセートに移し、4℃で3時間シェーカー/ロッカーでインキュベートします。 <ol><li>ストレプトアビジン - アガロースは、50％のビーズを含有するスラリーとしてしばしば販売され、抗菌溶液中に懸濁されているので、スラリーを粉砕してビーズ150μLの懸濁液を各試料にピペットで移す。 </li></ol></li><li>ペレットストレプトアビジン - アガロースビーズを用いて、4℃、1500×gで30秒間遠心分離する。 <ol><li>上清50μLを保存する（ローディングバッファーを加え、水浴または加熱ブロックで95℃で変性させる）。これは「細胞内」画分を表し、主に非ビオチン化細胞質タンパク質からなる。 </li></ol></li><li>ペレット状のビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、4℃で3分間揺り動かします。ペレットビーズ（ステップ1.16のように）、上清を捨てる。非ビオチン化サイトゾルタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるために、このプロセスを4回繰り返す。 </li><li>遠心分離（4℃で30秒間1500×g）によってビーズをペレット化し、上にある洗浄バッファーを捨てる。 50μLの1Xローディングバッファー（溶解バッファーを使用して希釈）を添加する。これを95℃で変性させることによりビーズからビオチンおよびストレプトアビジンを遊離させる。この分数uldはビオチン化細胞表面タンパク質のみを含む（「細胞表面」画分）。 <ol><li>入力、細胞表面および細胞内画分をSDS-PAGE 13で分離し、ウェスタンブロッティングで分析します14 。 注：実験では4〜20％のプレキャスト勾配ゲルを使用しましたが、この研究で興味のあるタンパク質については、4％のスタッキング層（それぞれ0.1％SDSを含む）を含む12〜14％の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用すべきである。ビオチン化タンパク質の見かけ上の分子量に観察可能なアップシフトが存在することがあることに留意されたい。 </li></ol></li></ol>ビオチン化によるアストロサイト内の細胞表面タンパク質の内在化率の測定注：以下では、この例では、星状細胞におけるAQP4のエンドサイトーシスを追跡するために使用される典型的なパルスチェイスビオチン化実験を記載する。このメソッドは、マドリッドらが使用した方法に基づいています。 15 。必要な特殊材料には、スルホ-NHS-SS-ビオチン、ストレプトアビジン - アガロース樹脂、還元型グルタチオン、ヨードアセトアミドが含まれます（ 表の表を参照）。 <ol><li>前のセクションで概説した方法を用いて、60mmディッシュ内のマウス大脳皮質の星状細胞の培養物を調製する。アッセイの日に細胞が約70％コンフルエントであること、および各ディッシュに同数の細胞が含まれていることを確認する。 </li><li> CM-PBS（1X PBS中100mg / L MgCl 2・6H 2 Oおよび100mg / L CaCl 2 、pH7.4）、ビオチン緩衝液（0.5 （50mM還元グルタチオン、75mM NaClおよび75mM NaOH）、クエンチング緩衝液（50mMヨードアセトアミド、1％BSA、CM-PBS中）、溶解緩衝液（25mMトリス、pH7.4,25mMグリシン、150mM NaClおよび5mM EDTA、1％トリトンX-100,1（10mM Tris、pH7.4,1.5mM EDTA、10mMトリス-HCl、pH7.5）を含む3×ローディングバッファー（150mMトリス、pH6.8,6％SDS、30％グリセロール、300mM DTTおよび0.01％ブロモフェノールブルー） 150mM NaCl、1％トリトンX-100、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で培養した。 </li><li>新鮮な細胞培養培地（10％ウシ胎仔血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％L-グルタミンを補充したDMEM）を調製し、37℃の水浴中に置く。 </li><li>インキュベーターから星状細胞培養物を除去し、アスピレーターを用いて培地を吸引する。 </li><li> 4 mLの冷たいCM-PBSで細胞を3回洗浄し、皿を砕いた氷上に置きます。 </li><li>各ディッシュに3 mLのビオチン緩衝液をピペットで入れ、ディッシュを前後に数回傾けてバッファーがよく分散されていることを確認し、これを氷上に30分間放置する。 </li><li>ビオチン緩衝液を吸引し、5 mLの暖かい培地と交換する。培養皿を37℃で15分間インキュベートし、第2の皿を同じ温度で30分間インキュベートする。 4時に別の料理を残す6; C：0分のサンプル。 </li><li>インキュベーション期間の終わりに、培地を捨て、4mLの冷却CM-PBSで細胞を3回洗浄する。細胞上に6 mLの還元バッファーをピペットで入れ、氷上で15分間放置する。 </li><li>還元バッファーを取り除き、6 mLの新しい還元バッファーと交換してください。氷上にさらに15分間置く。 </li><li>還元液を取り除き、6 mLクエンチングバッファーと交換する。氷上で15分間放置する。 </li><li>もう一度急冷ステップを繰り返します。 </li><li>クエンチング緩衝液を捨て、4mLの冷PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li>セルリフタを使用して1mLの冷却PBSに細胞を擦り、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移す。 </li><li>ペレット細胞を100×gで3分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、細胞を500μLの溶解緩衝液に再懸濁する。 </li><li>これを氷上に30分間放置し、5分間ごとにボルテックスする。あるいは、サンプルを4℃の終端回転子にこの時間置いてください。 </li><li>リットルを遠心する界面活性剤不溶性物質をペレット化するために14,000 xgで4℃で10分間インキュベートし、上清を新しい微量遠心管に移す。このライセート50μLを保存し、ローディングバッファーを添加し、乾燥浴中で95℃で変性させる;これはビオチン化エンドサイトーシスタンパク質と非ビオチン化タンパク質の両方を含む「インプット」画分である。 </li><li>カットピペットチップを使用して、150μLのストレプトアビジン - アガローススラリーをライセートに添加し、4℃で3時間シェーカー/ロッカーでインキュベートする。このステップの詳細については、1.15を参照してください。 </li><li>ペレットストレプトアビジン - アガロースビーズを4℃で30秒間1,500×gで遠心分離することによって単離した。 </li><li> 1mLの洗浄バッファーにビーズを再懸濁し、4℃で3分間揺り動かします。ペレットビーズ（ステップ2.18）、上清を捨てる。非ビオチン化サイトゾルタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるために、このプロセスを4回繰り返す。 </li><li>ペレットビーズを1,500 xgで30秒間、4℃で遠心分離し、ビーズを捨てる洗浄バッファー。 50μLの1Xローディングバッファー（溶解バッファーを使用して希釈）を添加する。ビオチンおよびストレプトアビジンをビーズから95℃で変性させることにより放出させる。この画分は内在化された細胞表面タンパク質のみを含む（「エンドサイトーシス」画分）。 </li><li> SDS-PAGE 13で入力、細胞表面および非結合画分を分離し、ウエスタンブロッティングで分析します14 。 注：実験では4〜20％のプレキャスト勾配ゲルを使用しましたが、この研究で興味のあるタンパク質については、4％のスタッキング層（それぞれ0.1％SDSを含む）を含む12〜14％の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用すべきである。ビオチン化タンパク質の見かけ上の分子量に観察可能なアップシフトが存在することがあることに留意されたい。 </li></ol>

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	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

著者らは、利害の対立を宣言していない。

変更： これらの方法は接着細胞と共に使用するように設計されているので、100mg / LのMgCl 2・6H 2 Oを含有するPBSの使用を指定し、 細胞が培養表面に付着したままであり、細胞 - 細胞接合部が破壊されないようにするために、洗浄ステップのための100mg / LのCaCl 2 （CM-PBS）および特定の緩衝液のベースとして使用する。しかしながら...

細胞表面のタンパク質は、細胞機能を維持する中心的な役割を果たしています。多くの場合、それらの活性は、細胞内部位でそれらを一時的に隔離するか、またはそれらを分解経路1,2,3,4,5に向かわせるエンドサイトーシスプロセスに依存するか、または調節される。ここでは、2つのビオチン化に基づく手法を用いて、細胞膜で発現されたタンパク質と新たに内在化されたタンパク質を特異的にタグ付けして単離できるようにしました。これらの方法を介して、関心対象のタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を定量化することができ、したがってその調節のより明確な評価を達成することができる。 ビオチン化による相対的細胞表面タンパク質発現の測定 以前はビタミンH 6として知られていたビオチンまたはビタミンB7は、生体分子の反応性アミン、スルフヒドリルおよびカルボキシル基を化学的に修飾するために使用できる小さな水溶性分子である。細胞表面ビオチン化試薬の現在の作物は、主として、ビオチンまたはその誘導体の膜不透過性スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド（スルホ-NHS）エステルからなり、ここで発現されるタンパク質のリジン残基の側鎖に存在するアミンと反応するように設計されているこれらが塩基性条件下で脱プロトン化され、ビオチン部分とアミド結合を形成することになる。このように改変された細胞表面タンパク質は、ビオチンに対して大きな親和性を有し、約10 -15の解離定数を有する後者に結合する66〜69kDaの四量体タンパク質であるアビジンの使用によって単離され得る。最も強い非共有結合相互作用8 </sup&gt; 、 9 。 以前の研究では、細胞表面でタンパク質発現を定量化する多くの代替方法が用いられてきた。関心対象のタンパク質に特異的な蛍光標識された抗体を用いた不透過化細胞の標識は、例えば蛍光顕微鏡による視覚化が一般的に採用されているアプローチであるが、細胞外エピトープに結合する抗体の利用可能性に大きく依存する。より最近では、酸性培地に曝露することに反応するpH感受性フルオロフォアを有するキメラタンパク質の使用を含む方法も首尾よく用いられている10 。しかしながら、このようなアッセイは、通常、目的のタンパク質がネイティブに見出されない細胞株におけるこれらの構築物の外因性発現を含む。それにもかかわらず、これらのアプローチは、細胞の局在化および細胞外経路に関する貴重な情報を提供することができるしたがって、ツールが利用可能である場合には、ここに記載されているビオチン化に基づくアプローチと併せて使用すべきである。 典型的なビオチン化アッセイでは、細胞をまず4℃のPBS中で完全に洗浄する。これにより、培地によって導入された微量の血清タンパク質が除去され、次のステップで過剰量のビオチンを消費しないことが保証されます。さらに重要なことに、温度の低下はエンドサイトーシスを著しく減速させる。次いで、ビオチン化試薬を添加する。次に、細胞を再び洗浄し、グリシンまたはNH 4 Clのいずれかを含有するクエンチング緩衝液とインキュベートする。その目的は、未反応のビオチンのすべての痕跡を不活性化することである。次いで、細胞を溶解し、続いてアガロース固定化ストレプトアビジンを添加してビオチン化タンパク質を沈殿させる。分析は、ウェスタンブロッティングを介して一般的に行われ、様々なpr定量すべきoteins。 このアッセイの基礎のために、それは、細胞外環境に曝露された部分を有するタンパク質のみに用いるのに適している。シングルパスタンパク質はビオチン化されにくい傾向があるが、ループ領域内に多数の反応性リジンを有する可能性のあるマルチパス膜貫通タンパク質がこの方法に最も適している。これらの場合でさえも、構造変化または分子間相互作用が特定の反応部位を閉塞し、予想よりも低いビオチン化収率をもたらす可能性が残っている。 ビオチン化による細胞表面タンパク質の内在化速度の決定 このアッセイの原理は、細胞表面ビオチン化の原理に大いに類似しており、その中で最も重要なものは可逆的ビオチン化試薬の使用である。ビオチン基（これらの）は、還元剤の影響を受けやすい構造内の結合結合;これは、アッセイ期間中に細胞内部位に取り込まれた細胞表面タンパク質のみがビオチン化されたままであることを保証するために利用される。アッセイは、一般的に以下の方法で行われる。最初に細胞を洗浄し、冷たい試薬でビオチン化し、次いで37℃の細胞培地を再導入し、細胞をインキュベーターに戻す。これにより、標識された細胞表面タンパク質がエンドサイトーシスを受けるようになる。次いで、膜に浸透することができない還元剤であるグルタチオンを添加して、細胞表面上に残っているタンパク質に結合したビオチン部分のジスルフィド結合を破壊する。最後に、壊れたジスルフィド結合をヨードアセトアミドと反応させ、不安定なチオール基を消費し、結合が改質されないようにする。前と同様に、細胞を溶解し、標識タンパク質をストレプトアビジン - アガロースを用いて沈殿させる。 限界ディスク前のセクションでは、これらのメソッド間で共有されている類似性のためにここでも適用されます。さらに、このアッセイに伴う温度変化は、特に急速に内部移行したタンパク質または急速にリサイクルするタンパク質の場合に、各時間の増加につきどの程度の量のタンパク質がエンドサイトーシスされるかを正確に決定することを妨げるものである。従って、このアッセイは、エンドサイトーシス速度の半定量的な推定しか提供しない。全反射蛍光顕微鏡法を用いて、負荷された各小胞の取り込みを追跡し、エンドサイトーシスの動態のより正確な測定値を提供することができる。したがって、関心のあるタンパク質の蛍光標識されたキメラ構築物が利用可能であると仮定して、このアッセイに非常に有用な補完物を提供することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">A661-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">#1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#163-2109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Thaw on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-actin antibody (AC-15)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>B-DG-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Reduced glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>862010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Streptavidin agarose resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td>
			<td>Alomone</td>
			<td>AQP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris base (Trizma base)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

細胞表面タンパク質は、幅広い機能を仲介します。多くの場合、それらの活性は細胞膜でのレベルを調節するエンドサイトーシスプロセスによって調節される。ここでは、細胞表面タンパク質のビオチン化の原理に基づくこのようなプロセスの研究を容易にする2つの方法の詳細なプロトコールを示す。第1は、細胞表面における特定のタンパク質の相対的レベルの半定量的測定を可能にするように設計されている。その中で、細胞の原形質膜タンパク質のリシン残基は、最初にビオチン部分で標識される。細胞が溶解すると、ビオチンに対する天然の親和性を利用してアガロース固定化ストレプトアビジンの使用によってこれらのタンパク質を特異的に沈降させることができる。このようにして単離されたタンパク質は、その後、標準的なウェスタンブロット法を介して分析され得る。第2の方法は、粒子のエンドサイトーシス速度を決定する手段を提供する細胞表面標的を一定期間にわたって標的化する。細胞表面タンパク質は、開裂可能なジスルフィド結合を含むビオチン誘導体で最初に修飾される。次に、細胞を通常の培養条件に戻し、ビオチン化タンパク質の割合をエンドサイトーシスで取り込む。次に、非内部ビオチン基のジスルフィド結合は、膜不透過性還元剤グルタチオンを用いて還元される。このアプローチにより、エンドサイトーシスタンパク質を高度に特異的に単離し定量することができる。

星状細胞におけるAQP4の原形質膜発現を評価するための細胞表面ビオチン化の使用 ラミニン処理した星状細胞培養物および未処理の対照細胞を、記載された方法を用いて細胞表面のビオチン化に供した。ビオチン化タンパク質をアガロース結合ストレプトアビジンで沈殿させ、次いでSDS-PAGEにより分離した。細胞表面画分をAQP4およびβ-ジストログリ?...

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Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K ビュー.  University of British Columbia. この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。 

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

神経科学

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major immune cells and only phagocytes in the brain, recent studies have shown that astrocytes also participate in various phagocytic processes, such as developmental synapse elimination and clearance of amyloid beta plaques in Alzheimer&#39;s disease (AD). Despite these findings, the efficiency of astrocyte engulfment and degradation of their targets is unclear compared with that of microglia. This lack of information is mostly due to the lack of an assay system in which the kinetics of astrocyte- and microglia-mediated phagocytosis are easily comparable. To achieve this goal, we have developed a long-term live-imaging in vitro phagocytosis assay to evaluate the phagocytic capacity of purified astrocytes and microglia. In this assay, real-time detection of engulfment and degradation is possible using pH indicator-conjugated synaptosomes, which emit bright red fluorescence in acidic organelles, such as lysosomes. Our novel assay provides simple and effective detection of phagocytosis through live-imaging. In addition, this in vitro phagocytosis assay can be used as a screening platform to identify chemicals and compounds that can enhance or inhibit the phagocytic capacity of astrocytes. As synaptic pruning malfunction and pathogenic protein accumulation have been shown to cause mental disorders or neurodegenerative diseases, chemicals and compounds that modulate the phagocytic capacity of glial cells should be helpful in treating various neurological disorders.

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

This protocol presents an in vitro live-imaging phagocytosis assay to measure the phagocytic capacity of astrocytes. Purified rat astrocytes and microglia are used along with pH indicator-conjugated synaptosomes. This method can detect real-time engulfment and degradation kinetics and provides a suitable screening platform to identify factors modulating astrocyte phagocytosis.

貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...