著者らは、数字の支援についてTeele Palumaaに感謝します。国立保健医療研究評議会、オーストラリアからプロジェクト無償1008046によって資金を供給。

1。解離した海馬ニューロンの文化<ol><li>カバースリップ（ホウケイ酸ガラス）を準備します。 <ol><li> 100％エタノールで洗浄します。 </li><li> UV照射下で空気乾燥。 </li><li>ポリ-D-リジン（4℃で一晩、0.15Mホウ酸緩衝液中で0.5 mg / mlの、）でコーティング。 </li><li>次の日（培養日）に対するラミニンでコーティング次いでPBSで3回洗浄し（2.5μgの個/ ml、天然マウスラミニン）で2時間、PBS中に希釈+ 5％（v / v）の熱不活化ウシ胎児血清（FCS） 37℃ </li></ol></li><li>胎生18日（E18）ラット海馬を解剖し、カルシウムやマグネシウム、氷上で冷却を含むPBS中に収集します。注：動物に関連するすべての実験プロトコルは、メルボルン大学の動物倫理委員会によって承認された。 </li><li>メーカーの指示に従ってパパイン解離キットからパパインとのDNase I溶液を調製する。 <ol><li> 1ミリリットルパパイン溶液に50μLのDNase I溶液を追加します。 </li><li>注：一度まず調製し、パパイン溶液およびDNase I溶液は別々に（それぞれ、パパインおよびDNase I 0.5 mlの25μlのアリコート）を一定分量に分注し、必要になるまで-20℃で保存してもよい。 </li></ol></li><li>可能な限り、PBSを削除し、15〜20分間、37℃で1ミリリットルのパパイン/ DNアーゼI溶液（胚1リットルから）海馬をインキュベートする。優しく潜伏期間の間に二度内容物を混合するチューブをフリック。 </li><li>細胞分散液を得て、もしあれば、いくつかされるまで火炎研磨シリコン処理パスツールピペット10-15Xで軽く海馬組織（気泡の発生を回避すること）を粉末化し、解離していない組織の塊が残っている。 </li><li> （; 1.6.1項を参照HBSS +）ハンクス平衡塩類溶液に加え、添加剤中の4％w / vウシ血清アルブミン（BSA）を3mlのクッションの上に解離し、細胞懸濁液を慎重にレイヤ。 <ol><li>撹拌せずに室温でBSAを溶解させることによってこのステップ勾配溶液を調製2のCaCl 2、1mMの硫酸マグネシウム、4 mMのNaHCO 3および40 mMグルコース（HBSS +）、4℃で、その後滅菌フィルターや店舗を含むHBSS中の環</li></ol></li><li>遠心分離器、100 XG、スイングアウトローターとベンチトップ遠心機で7分。 </li><li>細胞ペレットを吸引しないように注意して上清を除去します。 </li><li> 1ミリリットル中に火炎研磨（シリコン処理）パスツールピペット（または1ミリリットル青ピペットチップ）で軽くペレット化した細胞を再懸濁し、完全な神経基本培地（2％B27を、0.5 mM L-グルタミン、1％FCSを添加した）。 </li><li> （唯一の &quot;ライブ&quot;細胞として位相bright細胞をカウントNB）血球計数器を用いて210μlアリコートを数える。 </li><li>予め調製コーティングされたカバーガラス上でプレート一次ニューロン（12ウェルプレート中の0.75から1×10 5月 18日ミリメートルカバースリップ）。メッキの直前に、（下記参照）、カバースリップから過剰なラミニン/血清溶液を吸引し、一次神経細胞培養培地と交換してください。 NBに必要なNカバースリップは、カバースリップのアンバー調製物を培養前の日に開始されるように（ステップ1.1参照）を予め決定する必要がある。 </li><li>培養ラット初代E18 Neurobasal培地のin vitro（DIV）、2％のB27、1％FCS（熱不活性化）を補足した0.5 mM L-グルタミンで最大21日間、海馬ニューロン。その後7 DIV毎週の半分の培地交換を行う。抗有糸分裂フルオロデオキシウリジン/ウリジン、7 DIVで添加され、各ヌクレオシドの10mMストック）の1/1、000希釈はグリア過剰増殖を防止する。 </li></ol> 2。ライブニューロンと抗体インキュベーション<ol><li>文化の最初の週の間に、神経細胞は、樹状アーバーを開発しているし、週2〜3で、神経細胞はシナプス形成6,7を受けなければ、十分に成熟してきた。 <ol><li>選択された実験時間ポイント/ sで、カバーガラス上で、一次胚性神経細胞を含むウェルを三重に対する一次抗体を適用します。直接の培養液中に抗体の分量を追加所望の最終希釈注一次ニューロン：この例では、タンパク質の組換え分泌型に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清をウェルに培養培地1mlを2μLを添加することにより1/500に希釈し、10分間の遠心分離これは、任意の粒子状物質を除去し、背景を減らすことができますように、13,000 XG、RTは前の抗体の分量を取ってに組み込むことができる。 </li><li>免疫前血清コントロールの場合、（同じ最終希釈に）免疫前血清と同等の量を追加します。全く免疫前血清が使用できない場合は、神経基本培地またはPBSを等量の（一次抗体なしのコントロール）を追加します。適切な一次抗体は、タンパク質の細胞内領域/秒を認識する利用可能な場合あるいは、この抗体は、表面染色の特異性を試験するために、対照ウェルに添加することができる。 </li><li> （このインキュベーション期間は経験的に決定されてもよい）1-4時間培養インキュベーター中に細胞を戻す。私たちのexperime中実験計画は、内部化の経時変化を評価するためにウォッシュアウトした後、さらに潜伏期間（パルスチェイス実験）に続いて、抗体のパルスを組み込むことができるが、NTSは、抗体は全期間存在していた。 OPTIONAL STEP：このインキュベーションは、必要に応じて、基底タンパク質の内在化の速度を遅くするために、室温または氷上でさえ行うことができる。 CO 2以外の制御された環境で実行した場合、中、重炭酸塩、抗体/抗血清を添加する前にバッファリングされていないものに変更する必要があります。注意：熟ニューロン培養物（&gt; 14日、特に培養したマウスの胚性神経細胞）が良く、フルメディアの変更を許容しない。 </li></ol></li><li>最適な時間は、目的のタンパク質の豊富さに依存だけでなくなりますが、我々は良い結果を1時間、2時間、4時間、この一次抗体の内在化工程のためのインキュベーション時間を使用していたCEL中のタンパク質輸送のダイナミクス研究中のLS。 NOTE：代表的な結果に示すデュアルカラー画像は、組織培養インキュベーター中、37℃で1時間のインキュベーションで得られた。 </li><li>所望の期間のインキュベーションの後、抗体含有培地を吸引する。室温で静かに急速に一度、PBSでウェルを洗浄します。 </li></ol> 3。固定、非透過細胞への二次抗体のアプリケーション<ol><li>リン酸緩衝液（pH7.2）中の4％パラホルムアルデヒドで神経細胞を固定し、室温（注）で5分：最良の結果を得るために、新たに調製された固定液を使用し、全く沈殿したホルムアルデヒドが明らかでないように交互に-20℃で保存し、完全に解凍されている修正プログラムを使用する。注意：パラホルムアルデヒド固定液を調製し、ドラフト内で処理する必要があります。 </li><li>ウェル（ドラフト内の液体廃棄物容器への転送）から修正を削除し、PBSで3回すすいでください。 <ol><li>オプションのステップ：必要に応じて、抗体試薬を節約するために、カバーグラスは、缶ピンセットで慎重に12ウェルプレートから除去し、使い捨て培養プレートの基部上に敷設パラフィルムのシート上に、細胞側を上向きにして配置される。 </li><li>彼らは完全にパラフィルムの上にカバースリップの端に解氾濫なしでカバーされているように、解決策はその後カバースリップの上に静かにピペットでできます。 </li><li>この技術は、（ 例えば、一晩）加湿チャンバー内で行われるべきであるが、より長いインキュベーション短期インキュベーション（1〜2時間）に適している。代替的に、カバーガラスを一晩のインキュベーションのために戻った12ウェルプレートのウェル内に配置することができ、十分なボリュームがカバースリップが乾燥しないように添加されるべきである。 </li></ol></li><li> PBS中5％のBSA（：それは細胞が透過処理されないことが重要であるように、この段階でのブロッキング溶液に界面活性剤を追加しないでください）​​を用いて、室温で30分間ブロック。 </li><li> DETECに進む前に、表面タンパク質を標識するためには、内在タンパク質のTiONからは、選択した最初の蛍光標識した2°抗体を適用します。 注：ここで説明する例では、一次抗血清は、組換え分泌されたアイソフォーム4にウサギ（社内抗体）で育ちました。このように、非透過性ニューロンの表面上の膜貫通型アイソフォームの細胞外領域を検出するための第一の二次抗体のために、我々は、ロバ抗ウサギDylight 649（1/200、5％BSAを含有するPBSで希釈）を用いる。これは、使用前に希釈した二次抗体溶液を遠心分離（10分、13,000 XG、RT）することをお勧めします。 </li><li>室温で2時間撹拌カバースリップをインキュベートする。 </li><li> （ウェル中）洗浄カバーグラスをPBSで2回5分。 </li></ol> 4。過剰の非標識2°抗体でブロックする<ol><li>ラベルのない2°抗体を高濃度（&gt; 0.1 mg / ml）をして非透過ニューロンをブロックします。 <ol><li>ラベルのない2°抗体は、種に対して提起されるべき一次抗体を室温で一晩インキュベーションすることによって（この場合はウサギに）上昇させた。 </li><li>このプロトコルについては、結合affiniPure F ABフラグメントヤギ抗ウサギIgG（H + L）を、0.13 mg / mlの濃度で使用した。 注：一晩のインキュベーションは、より短い潜伏期間（2時間）が完全に標識された二次抗体が結合したしなかった一次抗体の完全な遮断のためには不十分であったように非常に重要であることが判明した。 </li></ol></li><li> （ウェル中）洗浄カバーグラスをPBSで2回5分。 </li><li>このブロッキング工程の後、リン酸緩衝液pH7.2、室温で5分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定後。 （ドラフト内の液体廃棄物容器への転送固定剤）固定液を除去した後、PBS（2×）で洗浄します。 </li></ol> 5。第二に蛍光共役2°抗体の透過性と応用<ol><li>透過処理し、室温テンペ、0.1％トリトン-X-100を含むPBS中の5％BSAで細胞をブロックする30分間rature。 </li><li>ブロッキング溶液を取り外します（カバースリップが乾燥しないように注意しながら）。第二の蛍光コンジュゲート2抗体°異なる蛍光でタグを追加します。 <ol><li> NOTE：これは、共焦点顕微鏡上で利用可能な励起/発光フィルタに応じて、以前に使用したものと、このフルオロフォアタグを区別することが可能でなければならない（以下を参照）。 </li><li>このプロトコルで提示例えば、アレクサフルーア488結合ロバ抗ウサギ2°抗体（PBS中に1/200、5％BSAおよび0.1％トリトン-X-100）を用いた。室温で2時間インキュベートし、2°抗体溶液を除去します。 </li></ol></li><li>洗浄は、PBSで3回5分間カバースリップし、最後に脱イオン水で簡単に洗浄する。 </li></ol> 6。取り付けとイメージング<ol><li>マウントは、水性封入剤を含む抗退色（ 例えば VECTASHIELD）でガラススライド上にカバースリップ乾燥させます。 OPのため4℃の暗所に保管して蛍光信号強度のtimal保全。 </li><li>画像は、共焦点顕微鏡で細胞を免疫染色した。 <ol><li> 2発蛍光シグナルの検出のための適切な励起および発光フィルタが使用可能である必要があります。 </li><li>異なる実験条件は、（脱分極8,9または制御条件下での、内在化率）を比較する場合は、すべて同じ画像取得パラメータを用いて画像化された様々な条件からカバースリップを再現することを確認してください。標準的な関心領域又は得られた画像から涙点の属性（ 例えば、数、大きさ）の集積密度は、次いで、標準的な画像解析ソフトウェア（ 例えば、フィジー/ ImageJは、をMetamorph）を用いて測定することができる。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins.">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li><li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression.">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li><li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons.">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li><li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines.">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li><li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures.">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li><li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture.">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li><li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+reversible,+activity-dependent+dendrite+formation.">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li><li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP.">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li><li>Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity.">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li><li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1/NgCAM+trafficking.">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation).">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li><li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+adaptors+&#8211;+social+networking+at+the+plasma+membrane.">Endocytic adaptors &#8211; social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここに記載の技術は、（Arancibia-Càrcamo らによって検討）細胞表面ビオチン化12のものと相補的であり、それは内在化タンパク質の細胞内局在についての情報を保存するための選択方法であり、好適には一次抗体を設け細胞外エピトープは入手可能です。また、経時的なタンパク質輸送/内在化の定量は、タンパク質抽出物を調製する必要なく、（一次抗体と生細胞のイン?...

新たに同定されたタンパク質の機能を確立する上で、問題のタンパク質の細胞内局在や人身売買の調査は蛋白質の1,2の可能性のある役割/ Sについての重要な手がかりを提供することができます。開発新皮質3のトランスクリプトームのバイオインフォマティクス解析は、マウス脳corticogenesis中に変更発現を示す遺伝子のリストを提供してくれました。次に、これらの遺伝子のうちの1つ、sez6によってコードされるタンパク質は、ニューロンの発達に重要な役割を有することを確認するために遺伝子ノックアウトアプローチを採用した。私たちは、発作関連遺伝子6、またはSez6、タンパク質は樹状突起の開発に位置しており、また、樹状突起棘、受信して興奮シグナルを統合し、樹状突起上の特殊な構造中に存在していることを観察した。このタンパク質が不足している場合にさらに、樹状突起および興奮性シナプスが正しく4を形成することができない。タンパク質の考えが支配的アイソフォームはtransmembranの機能を備えていますE受容体は、免疫標識タンパク質の細胞内分布はほとんど共焦点顕微鏡によって、または免疫電子顕微鏡で調べたところ、が、全てではないが、信号の原形質膜上でラベルはほとんど、あるいは全く、タンパク質と細胞体のコンパートメントに小さな小胞に関連する登場細胞表面で。 明確に予測された大きな細胞外ドメインを有するこの推定上の受容体は原形質膜に輸送されることを示すために、我々は、細胞表面上のタンパク質を標識するタンパク質の細胞外部分に生成された抗血清を用いて生細胞のアプローチを採用した。広範なブロッキング工程および透過処理工程により分離示差的に標識された二次抗体の2つのアプリケーションは、この「抗体給餌」アプローチを組み合わせることで、異なるfluorescを有する蛍光標識二次抗体に結合することによって区別タンパク質の2つの異なるプールを識別することができたENTタグ。従って、我々は、細胞表面に残っまたはこの期間中に表面に輸送されたタンパク質のいずれかからの抗体のインキュベーション工程の間にエンドサイトーシスによって内在化されたタンパク質を区別することができた。この方法を用いて、関心対象のタンパク質が神経細胞で細胞表面との間で売買されていることを確立した。そのため、この比較的迅速かつ簡単な手法は、我々はすべてのこれらの技術に同じウサギポリクローナル抗血清を使用しているにもかかわらず、伝統的な免疫細胞化学法または事前に埋め込むイムノゴールド電子顕微鏡よりも多くの情報を証明した。この技術は、細胞外ドメインのエピトープを認識する優れた抗体が利用可能で提供される任意の膜貫通タンパク質に一般的に適用可能である。技術はグルタミン酸受容体のGluR1サブユニット5の受容体の輸送を研究するために以前に使用されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

培養ニューロンにおける推定膜貫通受容体の細胞表面局在化を実証するために、我々は、タンパク質の細胞外部分に対して産生された特異的な一次抗体と生ニューロンの表面上のタンパク質を標識した。細胞を固定後、透過処理された場合の受容表面との間で売買されていることを考えると、両方の細胞表面と内部のタンパク質は、同じ標識された二次抗体によって検出される。ここでは、いずれかが細胞表面上に残存し、又は、この期間中に表面に輸送された抗体インキュベーション工程およびタンパク質の間にエンドサイトーシスによって内在化された標識タンパク質を示差的にするために、タンパク質輸送（「抗体送り」）を研究するために使用される方法を適合さ。タンパク質のこれらの2プールを区別する能力は、初期incubatio後、高濃度の非標識二次抗体と一晩ブロッキングステップを組み込むことによって可能になった蛍光標識された二次抗体と非透過ニューロンのN。異なる蛍光体で標識した蛍光二次抗体を用いて内部化プールの検出を可能にしたニューロンのブロッキング工程、透過処理の後に。我々はそれがあったことを明らかにし、この推定受容体の細胞内局在についての重要な情報を得ることができたこの技術を使用して、実際に、神経細胞における細胞表面に人身売買。この技術は、細胞外エピトープに適切な抗体を提供することが可能で、細胞型および細胞表面タンパク質の範囲に広く適用可能である。

ここで提示二色蛍光免疫染色技術は、（ 図1に概略的に示されている）生細胞における膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを標識するのに有用である。インキュベーション期間の間に、免疫グロブリンは、アクセス可能なエピトープに結合し、一緒に結合した抗体とタンパク質分子の集団の割合は、エンドサイトーシスされる。また、新たに合成されたタンパク質は、順方向トラ...

Watch this Scientific Journal Video about Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons at JoVE.com

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。

ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K ビュー.  The University of Melbourne. 我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。 

ビデオ: Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

神経科学

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

培養交感神経ニューロンの樹状成長を誘導する

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.