この作品は、＃DA15169 HEMにNIHの助成金によって賄われていた

手順の概要： このアプローチを使用して、細胞表面のタンパク質が共有結合膜の透過性を使用して、使用可能な外リジン残基上のビオチンで標識され、人身売買制限された条件下でのジスルフィド結合のビオチン化試薬（スルホ- NHS - SS -ビオチン）（すなわち、低温）（図1参照説明のため）。細胞の1つのセットが人身売買許容条件にシフトし（37℃）とビオチン化タンパク質は、内面化される。細胞の他のセットは、時間= 0で1）の総表面タンパク質、および2）ストリッピングコントロールのコントロールとして、低温で保持されます。内在化の短い期間の後、細胞が内在化を停止するために低温へシフトされ、任意の残留表面のビオチンは、ジスルフィド結合のビオチンを切断する還元剤、細胞を処理することによって取り除かれる。細胞表面から生じたと内面化されたビオチン化タンパク質は、ストリッピング工程から保護されており、残る唯一のビオチン化タンパク質となります。細胞溶解後、ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーによって分離されていると、目的のタンパク質を定量的イムノブロットによって検出されます。エンドサイトーシス率を決定するために、内部化されたタンパク質の量は、時間= 0で標識の総表面の制御と比較されます。我々は、正常に神経ノルエピネフリン1とドーパミン1月4日トランスポーターの内在化の速度を測定するためにこのアプローチを使用している。 詳細なプロトコル： 1日目： <ol><li>彼らは2日目〜80％コンフルエントになるように、6ウェルプレートに細胞をプレート。また、トランスフェクトされた細胞が使用されている場合、それらが内在化の速度が測定される時点で〜80％コンフルエントになるような密度でトランスフェクト。細胞は強く付着していない場合、組織培養のウェアは、広範な洗浄ステップの間に細胞の損失を防ぐために、細胞接着基質（例えば、ポリ- D -リジン）で治療されるべきである。 </li><li>それぞれのタンパク質はテストされているため、1枚のプレートにプレート2ウェルを全表面のタンパク質（T = 0）とストリッピングコントロールとして使用される。第二の板上に、テスト対象の各内面化の条件のためのウェルプレート1つ（すなわち基礎エンドサイトーシスのレートと薬剤処理された）。 </li><li> 2日目に使用するために指示された温度で、以下のソリューションとストアを準備します。 <ul><li> PBS 2 +：リン酸1.5mMのMgCl 2、0.2mMのCaCl 2で 、（4℃）を添加した液（pH7.4）緩衝生理食塩水</li><li> ビオチン化は解決策をクエンチ ：PBS 2 + 100 mMグリシン、（4℃）で補足</li><li> NTバッファー ：150mMのNaCl、1.0mMのEDTA、0.2％BSA、20 mMトリス、pH 8.6、（4 ° C） </li><li> RIPAバッファー ：10 mMトリス、pH 7.4、150mMのNaCl、1.0mMのEDTA、0.1％SDS、1.0％トリトンX 100、1.0％デオキシコール酸ナトリウム、（4℃） </li><li> スルホ- NHS - SS -ビオチンの原液 ：200 mg / mlの、（-20℃）に（DMSO）ジメチルスルホキシドに溶解</li><li> トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）ストック溶液：H 2 O中の500mM、（-20 ° C、光を遮断するために箔で覆われて） </li></ul></li></ol> 2日目： <ol><li> PBS 2 + 0.18g/mlグルコースを補充した、0.2％のIgG /（PBS 2 + / G / BSA）プロテアーゼフリーウシ血清アルブミンを準備します。 ℃の水浴中で37に予熱するこのソリューション。 </li><li> DMSOを溶かすためにベンチの上にスルホ- NHS - SS -ビオチンの原液を解凍。使用直前に、新鮮なスルホ- NHS - SS -ビオチン溶液（0.75ミリリットル/ウェルのに十分な氷冷PBS 2で2.5 mg / mlの+を 、）準備。 DMSOを可溶化するために激しくボルテックスするソリューション。 NHS -ビオチン試薬が水溶液中で容易に加水分解されることに注意してください。したがって、すべてのソリューションは、使用直前に準備する必要があります。 </li><li> ビオチン化：低温室で氷浴上に置いてプレートと氷冷PBS 2 +と3 × 2 mlをすすいでください。プレートをわずかに完全な排水及び緩衝液の除去を可能にするために角度していることを確認して。 /ウェルの各ウェルに新鮮スルホ- NHS - SS -ビオチン溶液0.75 mlを加え。インキュベート× 15&quot;、4℃激しく振盪と氷浴上でC。インキュベーションが完了したら、別の新鮮なスルホ- NHS - SS -ビオチン溶液を調製。新鮮な溶液とインキュベート× 15&quot;、4℃で古いソリューションを置き換える</li><li> 焼入れ：彼らはと反応し、細胞が溶解されると細胞内タンパク質のビオチニル化することのないよう、すべての非反応NHS -ビオチン分子が消光されていることが重要です。焼き入れ液で細胞を3 × 2 mlを洗浄し、2mlのクエンチの解x 15&#39;、4℃穏やかに振盪しながらCで二回インキュベートする。 </li><li> 内部化：薬物治療がテストされている場合は、PBS 2 + / G / BSAに適切な薬物濃度を追加。 4℃で制御プレートを保持し、内在化プレートを低温室から引き出す。予め温めておいたPBS 2で3 × 2 mlを洗う+ / G / BSA（+ / - DRUGS）と同じ解（2ミリリットル/ウェル）に残す。プレート全体に均一な温度を確保するために予め温めておいたソリューションを持つ空の井戸を埋める。 10&#39;、37℃のインキュベーターにセルを転送する。 37℃のインキュベーションを終了する直前に、氷の上でストリッピング工程とストアに使用するNTのバッファで新鮮なの50mM TCEP溶液を調製。 1.0ミリリットル/ウェルのために十分な量を準備します。 </li><li> ストリップ：氷浴と低温室へ復帰にすぐ転送プレート（S）。迅速にエンドサイトーシスを停止するために、氷冷NT緩衝液で3 × 2 mlを細胞を洗浄。また、NTバッファーでストリップコントロールウェルを3 × 2 mlを洗う。各ウェルに1.0 mlの新鮮な剥離液を追加。静かに振とうしながら、氷上で15&#39;、4℃インキュベートする。新鮮な剥離液で井戸を交換し、氷上でさらに15&#39;、4℃でインキュベートする。 </li><li> 溶解：剥離液、3 × 2ミリリットルNTバッファにさらされたすべてのウェルを洗う。その後、3 × 2 mlのPBS 2 +との（合計コントロールを含む）すべてのウェルを洗う。新鮮なプロテアーゼ阻害剤（1.0mMのPMSF、1.0μg/ mlの各ロイペプチン、アプロチニン及びペプスタチン）を含む300μl/wellRIPA緩衝液（または関心のあるタンパク質のための互換性のあるその他の溶解バッファー）に溶解する。 × 20&quot;、4℃で振とうすることにより溶解18000 × gで、10&#39;、4℃で遠心分離することによってマイクロチューブと明確な細胞の破片に転送する</li><li> タンパク質濃度測定：標準BSAの曲線と比較して溶解物のタンパク質濃度を決定するために溶解条件（例：DCプロテインアッセイ、Bio - Rad社）と互換性のあるタンパク質アッセイを使用してください。 </li><li> ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー ：各サンプルのタンパク質に相当する量のマイクロチューブを準備します。 200μlの各サンプルの最終容量を持って来るために溶解バッファーを追加します。激しくボルテックスストレプトアビジンアガロースビーズをさらに懸濁液に持参する。先端で200μlのピペットを使用すると、各チューブに、ピペットのビーズを切断。 20μlのbeads/50μgのライセートをお勧めします。チューブローテーターで一晩、4℃でインキュベートする。 </li></ol> 3日目： <ol><li> ビーズの洗浄：遠心分離機のサンプルを、18,000 × gで、2&#39;ビーズを収集する。アスピレーターでビーズペレットに接近しないように注意しながら、ライセートをオフに吸引除去する。よりよいコントロールのための吸引器の端にあるプラスチック製のピペットチップを使用してください。各試験管に0.75 mlの溶解バッファーを追加し、ビーズを洗浄する渦。遠心サンプル、18,000 × gで、2&#39;ビーズと繰り返し吸引を収集し、（合計で3回洗浄）回洗浄する。最終洗浄後、ビーズペレットを乱すことなく、できるだけバッファをできるだけ多く吸引除去する。アスピレーターに向かってチューブを傾けることは、このステップを支援します。 </li><li> サンプルの溶出：各チューブに20 -25μlの2 × Laemmliサンプル緩衝液（還元）を追加。還元剤を切断するには、溶液中に単離されたタンパク質を放出、NHS - SS -ビオチンのジスルフィド結合なります。ほとんどの膜タンパク質は、沸騰時に凝集に対して非常に脆弱であり、SDS - PAGE用ゲルにロードする前に加熱してはいけません。これらの実験を実行する前に目的のタンパク質の熱感度を決定する。タンパク質が/沸騰加熱に耐えられない場合、SDS - PAGEによって分析する前にローテータ、30&#39;、室温でインキュベートする。これは、開裂するジスルフィド結合に十分であるとタンパク質を溶出させる。 </li><li> SDS - PAGEとイムノブロッティング：SDS - PAGEにより分離タンパク質。各サンプルについて、次の順序でサンプルを実行するのが最も簡単です：あなたの蛋白質のための適切な抗体との合計面（時間= 0）、ストリップ、内在化の条件＃1、状態＃2、などイムノブロッティング用メンブレンに移しブロット興味のある。は飽和ピクセルが存在しないことが確実であること、CCDカメラのゲルドキュメンテーションシステムを使って免疫反応性バンドをキャプチャします。ゲル分析/デンシトメトリーのソフトウェアを使用して各バンドの密度を定量化する。 </li></ol>代表的な結果： 代表的なイムノブロットの結果は、図2Aに示されています。最も強い信号は、前のインターナリゼーションに表面のタンパク質の総量である&quot;合計&quot;レーン（T）、になります。 &quot;ストリップ&quot;制御（S）は、理想的にストリップが実験のために効率的であることを示す空白、に近い必要があります。ストリップの効率は、&quot;合計&quot;車線のように、&quot;ストリップ&quot;車線の密度を比較して算出されます（ストリップと平行してビオチン化された例えば、タンパク質が、どちらも37℃に加温しされず、剥離液にさらされていた）。次の式が使用されます。 [1 - （ストリップ/合計）] * 100％ この式を用いて、図2のストリップは、効率的な99.8％であった。最後に、内在化の車線の合計（秒）（I）よりも低い強度のバンドが表示されます。例（図2）においては、処理された細胞は、10時の最初のインターナリゼーションの時代&quot;内在化し、ドーパミントランスポーターの内在化率は10で測定された&quot;車両または1μMホルボールミリステートアセテート（PMA）のどちらかで処理した。内部化率は次のように計算されます次のとおりです。 合計/内部化* 100 図2Bに示すように、10.4％表面DATは、溶媒投与の条件下で10&#39;を介して内面化。 PMA治療は、全表面のDATの23.2％にDATの内在化率を増加させた。 <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。プロトコルのイラスト。細胞は° Cが独占的に表面の人口にラベルを付けるために4でビオチン化されている、と℃の内部移行を開始するために37にシフトされます。内在化に続いて、細胞が急速にエンドサイトーシスプロセスを停止するには、冷却され、残りの表面のビオチンは、還元剤で細胞を処理することにより除去されます。残っている唯一のビオチン化タンパク質は、このようにストリッピング治療からそれらを保護し、t = 0で表面から生じたと内面化されたものです。ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンビーズを使用してバッチアフィニティークロマトグラフィーによって分離されていると、目的のタンパク質は、イムノブロッティングにより検出される。 <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 PKC活性化はDATエンドサイトーシスの速度。内在化アッセイを増加させる 。安定的にDATの発現PC12細胞をビオチン化し、4℃などの&quot;詳細なプロトコル&quot;で説明されている。れました細胞は急速に37加温した℃± 1μMPMAとインキュベートさ10&#39;、37℃残留ビオチンが低減することにより除去された、細胞を溶解し、ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。 （A）代表のイムノブロットは、全体の表面のDATを示す時刻t = 0（T）、ストリップコントロール（S）、および指定された条件の下で内部化されたDAT（I）。 （B）バンドは、CCDカメラで捕捉し、数量データソフトウェア（Bio - Rad）を定量した。データは、％の合計DAT internalized/10の分として表現さ​​れています。 <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。例の免疫ブロット法は、貧しい人々ビオチンのストリップ。内在化アッセイを描いた 。安定的にDATの発現PC12細胞をビオチン化し、4℃などの&quot; 詳細なプロトコル &quot;で説明されている。れました細胞は急速に℃、インキュベーション10&#39;、37℃37℃に温めていた残留ビオチンが低減することにより除去された、細胞を溶解し、ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。免疫ブロットは、t = 0（T）、ストリップコントロール（S）、および内部化DAT（I）における総表面積DATを示しています。貧しいストリップの効率を示す、ストリップコントロールのレーンに表示されるバンドに注目してください。

<ol>
	<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent.">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li><li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+transporter+endocytic+determinants:+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization.">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li></ol>

一般的な問題 ：これらの実験で発生する最も一般的な問題は、貧しいストリップ効率です。ストリップの効率は、結果を解釈できることに非常に重要です。ストリップは非常に効率的でない限り、それは内面化の車線内の任意のビオチン化タンパク質は、実際には、表面から内部化されたと結論することはできません。ストリップ≥90％の効率が最適であり、そしてストリップがこの?...

measuring plasma membrane protein endocytic rates by reversible biotinylation

細胞膜タンパク質は、受容体、イオンチャネル、トランスポーターとポンプで構成されるタンパク質の大規模、多様なグループです。これらのタンパク質の活性は栄養デリバリー、細胞の興奮、および化学的シグナル伝達を含む主要な携帯電話のイベント、様々な責任があります。多くの細胞膜タンパク質は、動的にタンパク質の表面発現を変化させることによってタンパク質の機能を調節するエンドサイトーシスの人身売買、によって規制されている。タンパク質のエンドサイトーシスを促進するメカニズムは複雑であり、完全に多くの膜蛋白質のために理解されていません。完全に与えられたタンパク質のエンドサイトーシス売買を制御するメカニズムを理解するためには、それはタンパク質のエンドサイトーシスの速度を正確に測定することが重要です。多くの受容体の場合は、直接エンドサイトーシスの速度の測定は、頻繁に標識された受容体リガンドを利用して実現されています。しかし、そのようなトランスポーター、ポンプ、イオンチャネルなど膜タンパク質の多くのクラスに対して、エンドサイトーシス速度を測定するために使用できる便利なリガンドはありません。本報告では、我々はドーパミントランスポーター（DAT）エンドサイトーシス率を測定するために採用することを可逆的ビオチン化の方法を説明します。このメソッドは、内在化率を測定するための直接的なアプローチを提供し、容易にほとんどの膜タンパク質の人身売買の研究に用いることができる。

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.9K ビュー.  University of Massachusetts Medical School. 規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なア?...

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

生物学

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

血漿レチノール結合タンパク質の膜受容体によってレチノール交通のリアルタイム解析

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

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