我々はSTORM顕微鏡へのアクセスのためにXufeng Wuに感謝します。この研究は、国立がん研究所（NCI）がん研究センターと国立心臓肺血液研究所（NHLBI）の教室内研究プログラムによって支援されました。

注意：使用前に関連するすべての物質安全性データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質のいくつかは有毒で発癌性があります。エンジニアリングコントロール（ヒュームフード、グローブボックス）および個人用保護具（安全眼鏡、手袋、ラボコート、全長ズボン、クローズトゥーシューズ）の使用を含む、プロトコールを実行する際は、適切なすべての安全プラクティスを使用してください。 活性化T細胞の多重化画像化<ol><li> Alexa 647抗体ラベリングキットを使用してAlexa-647（A647）色素と抗体を直接コンジュゲートします。製造元が提供するラベリングプロトコルに従ってください。 注：このステップの前に抗体標識効率を高めるために、1x PBS中の抗体溶液の透析を推奨します。 </li><li> 20,800 rcfで5分間標識した抗体をスピンし、上清を集めて凝集した抗体を除去する。 </li><li> 蛍光ナノダイヤモンド被覆カバーガラスの作製 <ol&gt; <li> 250μL0.01％Poly-L-Lysine（PLL）を含む8ウェルのカバーガラスチャンバー（試薬/材料リストを参照）を15分間コートし、吸引し、65℃で30分間乾燥させる。 （乾燥する前にすすぎをしないでください。） </li><li> 1倍PBSで100 nm FNDの希釈液を調製する。様々な希釈液を試験して、ステップ1.2.7で十分なFNDが各視野に見えるようにします（メーカーが提供するFNDの1：200希釈を使用しています）。 </li><li>希釈したFNDを1分間ボルテックスする。 </li><li>ハイパワー設定で30秒間FND上清を超音波処理する。 </li><li>超音波処理されたFND上清をPLLコートした8ウェルカバースリップチャンバー中で室温で30分間インキュベートする。 </li><li> 1x PBSで5回洗浄し、TIRF顕微鏡で647 nmレーザー励起を使用してFND被覆チャンバーを視覚化します。理想的には、ステップ1.2.2でFNDを適切に希釈した場合、4〜10個の個別FNDを視野内に表示する必要があります（61 x 61μmの視野を得るために256 x 256カメラピクセル設定の100倍対物レンズを使用しています）と撮像フィールドの各象限に存在する少なくとも1つのFND。 FNDがクラスター化していると思われる場合（ すなわち 、周囲のFNDよりも著しく高いシグナルおよび200nmより大きい点広がり関数を有するFND）、FNDを6,800rcfで1分間遠心し、FND上清を用いてコーティング手順を繰り返す。 </li><li>各ウェルに250μlの抗CD3抗体（10μg/ mL）を添加し、37℃で1時間、または4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>溶液を除去し、1×PBSを30秒間添加する。この洗浄ステップを5回（5回洗浄）繰り返す。 </li></ol></li><li> Jurkat T細胞の活性化 <ol><li> Jurkat T細胞1 mlを800 rcfで6分間スピンし、300μlの1x HBS溶液に再懸濁する。 Jurkat T細胞は、スピンする前に、理想的には0.5〜1.0×10 6細胞/ mlの濃度でなければならない。 1x HBS溶液は、前述したように1％ウシ血清アルブミンを含むHEPES緩衝液生理食塩水からなる22 。 </li><li> 150μLを加える各ウェルに1×HBS溶液を加え、37℃で15分間インキュベートする。 </li><li>各ウェルに50μLの再懸濁したJurkat T細胞を加え、37℃で3分間インキュベートする。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド300μLを各ウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートする。 </li><li> 1x PBSで3回洗浄する。 </li><li> 250μLの0.1％Triton-X溶液を室温で5分間添加して細胞を透過させる。 </li><li> 1x PBSで3回洗浄する。 </li><li>室温で30分間各ウェルに1×PBS中250μL1％魚ゼラチン溶液を添加する。 </li><li> 1x PBSで3回洗浄する。 </li></ol></li><li> イメージングは​​、madSTORMを用いてJurkat T細胞を活性化した <ol><li>固定化された細胞に0.1〜0.5μg/ mLの標識された抗体200μLを室温で1時間添加する。 </li><li> 1×PBSで5回洗浄する。 </li><li> STORM緩衝液1 mlを加え、ガラスカバースリップでチャンバーを覆い、空気への曝露を制限する。 STORMバッファは、先に10で説明した。私たちはmaSTORMバッファーを各回のイメージングに使用し、STORMバッファーを20,800 rcfで2分間回転させて沈殿物を除去する。 </li><li> TIRFモードで低647 nmレーザー出力を使用して、視野内に少なくとも3つのFNDを有する染色細胞を見つける。 FNDを配置するのを助けるために、568nmレーザを伴う励起を使用して、FND信号の輝度を増加させることができる。 注：セクション2.1で説明した平均フィデューシャル補正の性能は、より多くのFNDを含めると改善されます。 </li><li> 647 nmのレーザー出力を増加させ、画像を取得します。我々は、200ms露光、125mW 647nmレーザ、100倍TIRF対物レンズ（1.49NA）、100X EMゲイン（16MHzで5MHz、変換利得1）で10,000フレームを取得する。私たちのイメージングセットアップの詳細は、以前に説明されています10 。 </li><li> 1x TBSで5回洗浄する。 </li><li> 1 mlを加えて（3.5M MgCl 2、20mM PIPES、0.1％Tween-20、pH6.5）で洗浄し、室温で1分間インキュベートする。 </li><li>溶出を3回繰り返します。 （正確な溶出条件およびシグナルを除去するために必要な溶出リンスの数は、使用する各抗体についてチェックする必要があります）。 </li><li> 1×TBSで3回洗浄し、1×PBS 1mlを加える。 </li><li>暗所でA647色素を光活性化するために、2〜5mWの405nmレーザで高出力（125mW）で647nmレーザを使用する光漂白剤。溶出されていない抗体からの残りのシグナルが全て光退色するまで待つ。典型的には、これは2〜5秒のレーザー露光を要する。溶出および光退色後に1.3.5のSTORM設定を使用してサンプル画像（約100フレーム）を取得することを推奨します。 通常、この方法を使用して信号の99.8％を除去します。以前に示したようにmadSTORMで使用する前に各抗体の溶出効率を試験することを推奨します10 。 </li><li> 250μLの4％パラホルムアルデヒドを15分間添加する。このpr事象は、細胞内の固定分子の架橋を逆転させる。 </li><li> 1x PBSで3回洗浄する。 </li><li>複数のターゲットを順次ラベリングする場合は、手順1.3.1-1.3.12を繰り返します。 図1は、madSTORMを用いて獲得した活性化Jurkat T細胞における複数の分子の複合画像を示す。 </li></ol></li></ol> 2.マルチプレックス画像スタックのドリフト補正とアライメント<ol><li> madSTORM画像スタックのドリフト補正 <ol><li> ImageJを使用して画像を開きます。 ImageJで開く前に、イメージファイルをTIFF形式に変換することをお勧めします。単一のFNDを選択するには、矩形ROIを使用します。画像スタックのすべてのフレームでFNDが表示されるように、時間の経過を再生します。 ThunderSTORMプラグインでRun Analysisを使用して、FNDをローカライズします。 2.1.5で説明した平均基準補正法では、単一のFNDが各画像フレームに局在することが重要です（ つまり 、特定されたピークの数はeフレーム数に対するqual）。 </li><li>すべてのフレームでFNDが識別されない場合は、別のFNDを選択します。 1つのフレームに複数のピークがある場合は、前のピークから最も離れたピークを削除します。 </li><li>イメージスタック内の各FNDに対して2.1.2を繰り返します。一部のFNDはドリフト補正プロセスに含めてはならないので、ステップ2.1.7で説明したドリフト補正精度の独立ゲージとして機能させることができます。 </li><li>より速く精度の低いドリフト補正を行うには、ThunderSTORMに含まれる相互相関または基準補正アルゴリズムを使用してFND画像を補正します。典型的には、相互相関には100ビン、5倍、0.1軌道平滑化係数を使用し、基準距離補正には最大距離10、マーカー視認率0.1、軌道平滑化係数0.01を使用します。相互相関および基準補正は、ドリフト補正の精度をテストするために他のFNDに適用できる補正ファイルを生成します。 </li><li>もっと厳しく、より正確なドリフト補正を行うには、前述の10のような平均補正基準（AFC）アルゴリズムを使用します。このプロセスは、パラメータの最適化を必要とせず、SMLMローカリゼーションアルゴリズムによって予測されるよりも高いローカライゼーション精度をもたらす。しかし、平均ドリフト補正には、少なくとも4つのFNDが必要であり、FNDが画像スタックのすべてのフレームに局在する必要があります。 AFCドリフト補正は、FNDの数を増やすほど効果的です。これは、多数のローカライズされたFNDが、特定のフレームの外れ値ピークの歪み効果を軽減するためです。 </li><li>以前に説明したようにThunderSTORMを使用して画像スタック内のポイントスプレッド機能をすべてローカライズする10 。我々は、100nmのピクセルサイズ、A / D数4.28、ベースレベルA / Dカウント100、EMゲイン100、PSF：統合ガウス局在、5ピクセルフィッティング半径、最尤フィッティング法、および1.3ピクセル初期シグマ。</li><li> FNDから取得したドリフト補正係数を、画像スタック全体からローカライズに適用します。最終的な画像を視覚的に検査して、適切なドリフト補正が行われるようにします（ 図2 ）。得られたドリフト補正係数は、ドリフト補正精度のレベルを測定するために、AFC手順に含まれていないFNDについて独立してテストされるべきである。ドリフト補正された独立したFNDの精度は、ステップ2.1.6で使用されたローカリゼーションアルゴリズムから計算された平均精度/不確実性値に近くなければなりません。 </li><li>順次標識された抗体のmadSTORMイメージスタックについては、2.1.1〜2.1.7の手順を繰り返します。各madSTORMイメージスタックに同じFNDセットをローカライズすることは、次のアライメント手順にとって重要です。 </li></ol></li><li> madSTORM画像のアライメント <ol><li>各madSTORM画像のドリフト補正FNDの重心位置を計算します。これを行うには、平均x軸とy軸を求めます。局所化された各FNDについての位置付け、および各madSTORM画像内のすべてのFNDの平均xおよびy位置の平均をとる。このステップの詳細なアルゴリズムは、先に説明した10 。 FND基準マーカーの重心位置を使用して連続madSTORM画像を整列させます。アラインメントを実行するには、2つ目のmadSTORM画像のFNDの重心位置を最初の位置から減算することによって、2つのローカライズされたmadSTORM画像間のオフセットを計算します。その後、2番目のmadSTORM画像内のすべてのローカリゼーションからオフセット量を減算します。 </li><li>最初のmadSTORMイメージを参照イメージとして使用し、1番目と3番目、1番目と4番目などの間でこのアライメントステップを繰り返すことをお勧めします。アライメントプロセスに含まれていないFND間のオフセットを測定することによってアライメント精度をテストします。大きなオフセットは、シーケンシャルなmadSTORM画像の重心位置を計算する際に、異なるセットのFNDが使用されたことを示している可能性があります。 </li><li>そうであれば、ステップ2.2.1-2.2.2のステップ同一のFNDのセットを用いてアライメントを行うことが繰り返される。 注：AFCドリフト補正とアラインメント手順の両方のカスタムコードが提供されています。 </li></ol></li></ol>

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私たちには何も開示するものはありません。

madSTORMのシーケンシャルマルチプレックス、ドリフト補正、アラインメントの手順により、細胞内の異種構造の正確かつ高度に多重化された可視化が可能になります。さらに、madSTORMは、非遠赤色色素9,12の色収差や準最適な光スイッチング/発光特性など、多色STORMの制限を回避します。溶出工程が逐次的に結合した抗体からの立体障害を有意に減少させるので、madSTORMを使用して、従来の技?...

光学顕微鏡の回折限界（約200nm）を克服するために、様々な超解像顕微鏡技術が開発されている。これらの中には、光活性化局在顕微鏡法（PALM）および確率的光学再構成顕微鏡法（STORM）を含む単一分子局在化顕微鏡（SMLM）と呼ばれる技術のカテゴリーがある。 SMLM技術は、オン（蛍光）状態とオフ（ダーク/光スイッチ）状態との間で切り替えることができるフルオロフォアの使用を共有し、単一分子1,2,3からの蛍光の連続的な局在化を可能にする。 市販の染料や顕微鏡との互換性のため、直接STORM（dSTORM）は広く採用されたSMLM技術となっています4 。 dSTORMは、回折線の中心を計算する際の不確かさとして定義される、約10nmの定位精度を日常的に達成することができるイオン制限点広がり関数（PSF）。しかしながら、局在化アルゴリズム5,6,7を用いて推定された高い精度にもかかわらず、単一分子の実際の位置の正確な決定は、多くの問題によって妨げられてきた。第1に、画像取得中の顕微鏡ステージの機械的移動は、位置特定精度に重大な不確実性を加える。 SMLM画像が何千ものタイムラプスフレームにわたって得られるので、顕微鏡ステージのナノスケールの動きは、最終的な超解像画像8の精度を著しく損なう可能性がある。画像取得中のステージの動きを補償するために、ステージドリフトは、画像自体からのビニングされたローカライゼーションの回帰ベースのフィッティング（相互相関）または基準マーカからの連続的なローカライゼーション（基準補正）1,9から一般的に推定される。ハウヴェこれらの方法は、各画像スタックに対して複数のパラメータの最適化を必要とし、機械的振動などの短い時間スケールでステージの動きを説明することができない。金ナノ粒子と多色蛍光ビーズは、SMLMの基準マーカーとして使用されてきましたが、光安定性ではなく、ドリフト補正後に使用された窒素空孔中心蛍光ナノダイヤモンド（FND） madSTORM 10で 。 回折限界に加えて、光学顕微鏡法はスペクトル限界によってさらに制限される。複数のターゲットを同時に視覚化するには、重複しないスペクトルプロファイルを有する蛍光プローブが必要であり、一般に、蛍光ベースの光学顕微鏡法を6色に、SMLMを2-3色にそれぞれ制限する（4,11,12）。さらに、非線形色収差は、多色画像の不整合を引き起こし、w多色の基準マーカー8,13を用いて広範囲のアライメント手順を必要とする。これらの限界を克服するために、以前の研究では、連続的に結合した蛍光体14,15,16,17,18,19の繰り返しの光退色または化学的消光を用いて複数の標的を画像化した。これらの方法は顕微鏡法のスペクトル限界を克服することができるが、蛍光漂白は有毒なプロセス20であることが知られており、漂白または消光の長期化は架橋の損失などの望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。さらに、蛍光プローブの蓄積は、試料中の結合部位の立体的なブロッキングをもたらし、エピトープの大規模な多重化および頑強な標的化を妨げる可能性がある。このような立体的な干渉を避けるために、自由に拡散するタンパク質断片の確率的交換を用いて多重化を達成した21 。この方法は細胞構造の高密度標識化を可能にするが、ペプチド断片を単離するための広範な生化学的調製を必要とし、単一分子位置を特定することができず、市販のプローブを用いた大規模多重化を容易に促進しない。我々は、多重化、抗体サイズ限定dSTORM（madSTORM）イメージング、および正確なドリフト補正およびアライメントを達成するための蛍光ナノダイヤモンドの使用のための蛍光抗体の順次結合および溶出を記載する詳細なビデオプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>8 well coverslip chamber</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3&amp;epsilon; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin, Fraction V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15712</td><td>Carcinogen</td></tr><tr><td>Gelatin from fresh water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 antibody labeling kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Highly toxic, air sensitive</td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Cyclooctatetraene 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Highly toxic, air sensitive</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

highly multiplexed, super-resolution imaging of t cells using madstorm

単一分子局在化顕微鏡法を用いた画像化異種細胞構造は、不適切な局在精度および多重化能力によって妨げられている。蛍光ナノダイヤモンド基準マーカーを使用して、単一分子局在化顕微鏡法で高精度を得るために必要なドリフト補正およびアライメント手順を説明する。さらに、蛍光抗体の逐次結合および溶出を用いて複数の分子が同じ細胞内で標的化される新しい多重化戦略madSTORMが記載されている。 madSTORMは、T細胞受容体マイクロクラスターと呼ばれる膜結合多タンパク質構造内の異なる成分の位置を視覚化するために、活性化されたT細胞上で実証される。さらに、madSTORMのマルチタンパク質構造の可視化のための一般的なツールとしての応用について議論する。

連続的な溶出および染色法を使用して、活性化されたJurkat T細胞（ 図1 、検査図のアライメント）におけるマイクロクラスターおよび他の構造の多重化madSTORM画像を作製した。各疑似カラー画像は、ステップ1.1.1〜1.3.13で取得したmadSTORM画像の1ラウンドを表します。前に説明したように、多重標的間のクロストークを避けるために、視野は前の溶?...

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Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

我々は、蛍光標識された抗体の逐次結合および溶出を用いて、単一分子精度で異種ナノ構造内の複数の分子をイメージングする方法を実証する。

madSTORMを用いたT細胞の高度に多重化された超解像イメージング

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.4K ビュー.  National Institutes of Health. 我々は、蛍光標識された抗体の逐次結合および溶出を用いて、単一分子精度で異種ナノ構造内の複数の分子をイメージングする方法を実証する。 

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A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

免疫・感染学

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

生化学

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

がん研究

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

ヒト免疫シナプスのイメージング

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density and the location of immune cells in the TME have important diagnostic and prognostic values. Multiomic profiling of the TME has exponentially increased our understanding of the numerous cellular and molecular networks regulating tumor initiation and progression. However, these techniques do not provide information about the spatial organization of cells or cell-cell interactions. Affordable, accessible, and easy to execute multiplexing techniques that allow spatial resolution of immune cells in tissue sections are needed to complement single cell-based high-throughput technologies. Here, we describe a strategy that integrates serial imaging, sequential labeling, and image alignment to generate virtual multiparameter slides of whole tissue sections. Virtual slides are subsequently analyzed in an automated fashion using user-defined protocols that enable identification, quantification, and mapping of cell populations of interest. The image analysis is done, in this case using the analysis modules Tissuealign, Author, and HISTOmap. We present an example where we applied this strategy successfully to one clinical specimen, maximizing the information that can be obtained from limited tissue samples and providing an unbiased view of the TME in the entire tissue section.

Here, we describe a simple and accessible strategy for visualizing, quantifying, and mapping immune cells in formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue sections. This methodology combines existing imaging and digital analysis techniques with the purpose of expanding the multiplexing capability and multiparameter analysis of imaging assays.

腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

生物学

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells