私たちは、英国の国家計量局の生物化学計測技術プログラムから資金提供を認めている。我々は技術的なアドバイスや提案のためにセバスチャン·ファン·デ·リンデ、ミクロスErdelyi、エリックリースに感謝します。私たちは、有益なコメントや、この原稿の議論のためにミクロスErdelyi、エリック·リースとMax Ryadnovに感謝します。

我々は、開示することは何もありません。

我々はいくつかの簡単なテストサンプルと、それは、嵐の超解像イメージングを最適化することが可能で、自由に利用可能な処理ソフトウェアの暴風雨で示しています。これらのツールや方法は、新規ユーザーとその顕微鏡での自信と前例のないディテールで生物学的および細胞構造を研究するためにそれらの利用を高めるために、経験豊富なユーザのための方法のための有用な出発点を提供します。このような精度の推定値、局在番号と、画像品質を向上させるため、より大きな自信を持つことが可能で示すヒストグラムを意味するように、既知の又は十分に理解された構造および有用な画像品質メトリックの数を生成することができるアルゴリズムを有するサンプルとの組み合わせを使用することによりSTORMイメージングプロセスにおいて。誰サイズを用いることができる別の商業的および自作の顕微鏡構成の数があるので、データを取得するすべてのアプローチに適合していないが存在する。また、インフルできる多くのサンプル調製および画像取得ステップがあります最終的なイメージは、そのためのソフトウェア·ツールとテストサンプルを持つことが理解とSTORM画質を最適化するために重要であるリファレンス。 さらに、これらのプロトコルは、発生する可能性のある問題のトラブルシューティングの役に立つと少ない曖昧な方法を提供することができます。例えばデキストランサンプルは任意のレーザービームの位置ずれや、サンプルの照明ムラがあるかどうかを識別するための非常に便利な方法です。スイッチングバッファは任意の「点滅」は役立つがあるかどうかを確認するのは非常に簡単な目視検査作業できないことが懸念されている場合。アクチンフィラメントは、FWHMの比較を使用して、解像度を測定するだけでなく、ドリフトや誤局在アーティファクトを強調表示する便利な方法です。しかしながら、局在型超解像法はフルオロフォア濃度に敏感であることができるように、例えば、露光時間、フレームレート、レーザパワーと画像が処理される方法のような他の要因、にもかかわらず、それを割り当てることが不可能であることに留意すべきである解像度特に顕微鏡や全ての画像がその解像度を持っていることを前提としています。何が可能であることは、しかしながら、そのような平均局在化精度、定位数と解像度の種々の態様を測定し、27ドリフトすることである。基準マーカは、彼らができる全ての実験に組み込むことができない場合でも、少なくとも、その環境、顕微鏡システムを特徴付けるために使用することが、より良いような起動時の後に熱平衡に到達するために必要な時間などの操作の考慮事項を理解する。この画像43を獲得している一方で、試料位置を補正する非点収差レンズとフィードバック機構の使用を必要とするが、同様に横方向のドリフトを補正するような、基準マーカは、軸方向のドリフトを特徴付け、正しいするために使用することができる。商業的な超解像システムは、通常、安定制御やフォーカスドリフトを補正するためのより実用的な解決策とすることができるフォーカスロック機構のいくつかの並べ替えを含む。 そこ非特異的な直接染料を使用するなど、デキストラン、または二次抗体のような他の共役分子とガラスをコーティングに代わる再。これらのアプローチの制限は、ガラスに結合した分子の数は知られていないことである。使用されている代替の糸状の構造は、微小管28とDNA 21が含まれています。しかし、非常に小型で便利な市販の試薬 ​​の組合せはまた、システム27の性能測定に有用であり得る、特に分岐または分岐状のフィラメントの分離距離として、魅力的な代替アクチン行う。 試験サンプルの更なる発展の余地がこのエリア28,29,46,47の最近の進歩にもかかわらず、そこにある。特に、マルチカラーイメージングは​​、イメージングのすべての3つの主要な側面で多くの課題は、サンプルラベリング、画像取得（ハードウェア）、ソフトウェア（画像処理及び配向）を示す。が行われているこれらの態様4-6に対処する多くの刊行物及び適切な試験サンプルおよび方法論は確実に画像を生成して、これらのタイプの解釈に重要であることは明らかである。実際、最近ではdSTORMがの2色画像を撮影し、解決し、核膜孔複合体の対称性の高い性質のために使用できることが示されており、著者らは、この色収差補正45の性能を評価するための理想的な方法であることが示唆された。もう一つの興味深いアプローチは、離れて46特定のサブ回折距離で位置決め蛍光体の可能性が作成さnanorulerを作成するためのDNA折り紙を使用することである。これは、解像度を評価し、距離測定を行う方法を提供する。しかし、究極の目的は、このような複雑な三次元構造である細胞のような非理想化されたサンプルを、これらの超解像技術を適用することである。この場合、tは、より完全な理解の組合せ彼は、データを取得し、適切な方法でそれを処理し、画像指標を提供する際にユーザを支援するソフトウェアツールと組み合わせた技術は、最終的な回答である可能性が高い。28,29,47,48

最近、光学顕微鏡技術の範囲は、典型的には、回折限界をバイパスし、100nm以下の1,2の良好な解像度を有する画像を生成することができる超解像顕微鏡またはナノスと呼ばれる、開発されている。 2008年のネイチャーメソッドメソッドであるとして超解像顕微鏡の発表以来、ローカリゼーションに基づく顕微鏡の開発に多大があった。例えば、マルチカラー用途3-6、3Dの実装7-12、さらに生細胞アプリケーション5,13-17がある。さらに、これらのシステムとして商品化されて、現在は生物医学の質問に、それらの使用およびアプリケーションのさらなる増加がありそうである細胞生物学者の手に光学研究室の外に自分の道を作っている。 このファミリーの一つの分岐は、画像分子ごとの分子を構築することにより動作するローカライズに基づいた方法である。私少数の空間的に分離された分子が一度にアクティブになるようにこれを行うには、n個の順序は、試料内の蛍光分子の大部分はオフにされなければならない。これらの分子は、その後急速にオンとオフを切り替えられ、人口のかなりの部分は、サブ回折精度で基本的な構造を反映して画像化されるように、多くの画像が取得されます。多くのアプローチがGSDIM 18パーム19、fPALM 20嵐21とRESOLFT 22を含め公表されている。単一分子検出の位置を測定するアルゴリズムは、次いで、例えばrapidSTORM 24,25 QuickPALM 26は、12 palm3d及び暴風雨27ガウスフィッティング23を用いて、20 nmより良好な精度で分子の実際の位置を特定するために使用することができる。細胞または高い分子密度を有する他の生物学的試料を撮像するときには、フレームの何千を取ることが必要であるこの点滅、空間的に分離され、信号の画像標識分子のかなりの割合するためである。 確率的光学再構築顕微鏡法（STORM）と高度に関連dSTORMとGSDIM方法は、市販の有機色素21を操作することが実証されている局在型超解像方式である。それらは、十分に確立されたので免疫標識の特異性および相対的な利便性の蛍光顕微鏡を実行するために接近するための方法論としては、特に魅力的な異なる色素の数28-30、に適用可能であることが示されている。その結果、局在型超解像イメージングに使用される可能性を有する色素 - 抗体および色素生体分子コンジュゲートの範囲への容易なアクセスがあった。 STORMと同様のアプローチの一般的な原則は、比較的簡単であり、一目で、ハードウェアとサンプル調製は比較的STRA思えるながらightforward、高品質、アーチファクトのない、超解像を実現するために不可欠なプロセスのステップがいくつかあります。 すべての顕微鏡技術と同様に、プロセスは、主に3つのステップであると考えることができる：第一、第二試料調製、画像取得と、第三の、画像処理および/または画像解析および解釈。局在ベースのアプローチを使用して超解像画像を生成する追加の解像力及び方法は、いくつかの新たな問題および考慮事項31-33を導入する。免疫標識は、一次及び二次抗体の組み合わせが使用され、特に間接免疫蛍光を行う際に試料調製から出発し、それは蛍光色素が離れて、​​目的の分子から最大20nmであってもよいことに留意すべきである。微小管の場合、これは、25ナノメートル28,30の予想される微小管の直径に比べて35〜50ナノメートルの直径をもたらす。また、標識密度べきメートル高品質な画像14を生成するためにナイキスト基準をEET。糸状構造に沿っ20nmの予想される画像の解像度については、例えば、少なくとも10nm毎27色素分子があるはずです。 、上の平衡 - 多くの染料は、ローカライズ系色素の全体的なパフォーマンスは、少なくとも4つの重要な基準は、イベントを切り替えるごとに、すなわち検出された光子（明るい方がよい各まばたきの明るさ）が混在しているアプローチのための仕事を出版されている一方でオフデューティ·サイクル（オフ状態での対中の染料のコントラスト比 - オフよりは一般的に優れている）、生存率（低脱色率が優れている）と、スイッチングサイクルの数（蛍光団ごとの点滅の数 - 詳細蛍光団ごとに1回点滅）は、分子の計数のために優位することができますが、高解像度のためのより良いです。状況はさらに、任意の所与の色素のためのこれらの特性は、異なる緩衝液条件で変化し得るという事実によって複雑になるレーザパワー28,29と。さらに、ならびにこれらのユニークなSTORMの考慮、画質が固定条件と消光試薬の使用の改変により自己蛍光を最小化することによって、例えば、より伝統的な蛍光顕微鏡法と同様にして試料調製を最適化することによって改善することができる。また、非特異的に結合したフルオロフォアを最小化するラベル濃度、インキュベーション時間、ブロッキングおよび洗浄工程を調整することによって行うことができ、これは重要である。 画像取得の第二段階は、非常に重要です。顕微鏡上の最適な設定は、染料、緩衝液条件、標識密度、およびサンプルタイプ、ガラス、細胞または組織サンプル上で、例えば単層に依存するであろう。主な考慮事項は、カメラ露出時間、フレーム番号、照明角度（TIRF、HILO、エピ）及びレーザーパワーである。目的は、可能な限り迅速な限り多くの明るい空間的に分離された点滅を収集することである。もし背景I再構成アルゴリズムは、正確な位置をローカライズすることができなくなり、非常に高いのか点滅し、非常に明るくはない、換言すれば、信号対雑音比が悪い。ならびに定位の精度を最大化する、各分子の位置に精度を測定することができる、すなわち 、画質もローカライゼーションの高い数に依存する。目的の分子の数が不足が画像化されている場合は、どちらかが悪い標識効率のために、過度の光退色または不適切なフレーム番号、ナイキスト基準が14,27の満たされてないので、結果の超解像画像は、点状かつ不連続になります。 そして最後に、第3の工程と、画像処理が、標準的な蛍光顕微鏡技術と比較して特に重要である。それはワット知って混乱することができるという選択肢の面で利点、および欠点でもあり、自由に、商業的に利用可能なアルゴリズムの範囲が、、ありますHICHは使用するのが最も適切である。例えば、生データが適切に間隔をあけ空間的に別個の点滅がある場合は、単一分子フィッティングアルゴリズムは暴風雨27、rapidSTORM 24,25で利用可能なスパースフィッティングアルゴリズムによって、たとえば、高精度かつ効率的にすることができ、12とQuickPALM 26ソフトウェアをpalm3d 。生データ信号をオーバーラップが多く含まれている場合は、より適切であるかもしれないアルゴリズムがDAOSTORM 34、図3（b）35とdeconSTORM 36が含まれています。さらに、これらのアルゴリズムは、超解像の画素サイズがあり得るような信号数、または点滅当たりの光子、並びにそのような平滑化ガウス関数、またはピクセルグリッドのヒストグラムとして可視化するような様々な異なる画像の表示オプションとして、様々な基準のしきい値を含有するユーザによって選択された。これらのオプションはすべて、最終的なイメージの外観を変更し、読影と分析のための意味を持っている。 <p class="jove_content"&gt;したがって、我々は明確化のために、私たちは、嵐のように呼びます染料ベースの局在型超解像実験、および、より経験のあるユーザの機会への出発点で新しいユーザーを提供する3試験サンプルを提示さらに彼らの実験を最適化します。まず、デキストラン - 色素複合体の蛍光体層をガラスの表面を被覆することができる。これは、顕微鏡、色素とバッファは蛍光シグナルを点滅生成する機能していることを確立するための迅速かつ簡単な方法を提供します。次に、この方法は、緩衝液条件を最適化する、画像取得の設定と異なる色素をテストするために風雨により生成された平均局在化精度および数のメトリックを比較することによって拡張することができる。第二に、我々は容易にファロイジン-色素複合体を用いて標識することができるガラス上のアクチンフィラメントを製造するための単純なプロトコルを提示する。これらは、解像度27の測定値を取ると、通常の半値全幅（FWHM）のに理想的な構造を提供するフィラメントの決議37の経験的な推定値として与えられている。これは、局在型超解像顕微鏡の解像度がフルオロフォアの明るさ、背景雑音および局在密度27の関数であり、これらは、試料全体にわたって必ずしも一定ではないので、解像度がサンプル間で、同一試料内の画像の間で変化することに留意すべきである。アクチンフィラメントは、mislocalizationsとドリフトとどのように暴風雨の中のソフトウェア機能と同一視されるように潜在的な成果物を示すために使用されている。また、我々は、メジャー、正しいドリフトの両方に蛍光基準マーカの使用を記載している。第三に、上皮成長因子（EGF） - 色素複合体を用いた細胞の染色は記載されている。細胞表面での受容体の割合は約50〜150 nは、サブ回折サイズの構造である小胞を介してエンドサイトーシスを受けるため、EGFは、超解像性能の有用な指標を提供する直径27,38,39中のm。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labtek Imaging chamberglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CBR-166-390E</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iBEAM-SMART-640-S</td>
			<td>*150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>*Acquisition software (controlling hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>Dell</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Image analysis and processing <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rainSTORM</td>
			<td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Running rainSTORM</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Example of self-built STORM/PALM microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Also see reference 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Materials &amp; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX70013065</td>
			<td>1; 2; 3; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td>1.1; 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-22914</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General actin buffer</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>BSA01</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preformed-actin filaments</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>AKF99</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phallodin-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-7279</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX31966021</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX10500064</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Step</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>734-0006</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF - Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E35351</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>4.3, 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - 10% solution EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>04018-1</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C100</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93352</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7528</td>
			<td>5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6500</td>
			<td>5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2289</td>
			<td>5.1; 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

test samples for optimizing storm super-resolution microscopy

嵐は標準的な蛍光顕微鏡技術よりも最大で10倍の分解能で最近開発された超解像顕微鏡技術です。しかし、画像は通常よりも非常に異なる方法で取得されるように、分子による分子画像を構築することにより、それらの画像取得を最適化しようとするユーザーのためのいくつかの重要な課題が存在する。このプロセスを支援し、嵐が、我々は3つの試験試料の調製とNM 30〜50の間の典型的な解像度で超解像画像を取得し、処理嵐の方法論を提示する仕組みを、より深い理解を得るために。無料公開暴風雨処理ソフトウェアを用いて、試験サンプルを組み合わせることにより、画質と解像度についての情報を大量に得ることができる。これらの指標を用いることで、調製、染料の選択、緩衝液条件、及び画像取得設定をサンプリングするために、光学系から撮像手順を最適化することが可能である。我々このような横方向のドリフト、「誤った局在」現象が、その結果、画像取得および密度に関連する問題中の試料の移動に伴って低画質になり、いくつかの一般的な問題のLSOの例を示している。

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Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

我々は3つの試験試料の調製及びそれらがどのように最適化し、STORM顕微鏡の性能を評価するために用いることができるが記載されている。これらの実施例を用いて、我々は、生データを取得し、次いで約30〜50 nmの分解能の細胞において、超解像画像を取得するためにそれを処理する方法を示す。

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

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30.9K ビュー.  National Physical Laboratory. 我々は3つの試験試料の調製及びそれらがどのように最適化し、STORM顕微鏡の性能を評価するために用いることができるが記載されている。これらの実施例を用いて、我々は、生データを取得し、次いで約30〜50 nmの分解能の細胞において、超解像画像を取得するためにそれを処理する方法を示す。 