大動脈の SMC 分離のための彼の実験室のプロトコルを共有を学部長の李を感謝いたします。アメリカ心臓協会、国立衛生研究所 (R21NS088854、R01HL125815、および R01HL133016 D.M.G に) によって提供された資金援助 (D.M.G. に科研費 14GRNT19990019)、イェール大学 (午前にブラウン コックス交わりと起動D.M.G. に資金)。

マウスのすべてのプロトコル、動物介護制度とイェール大学で利用委員会によって承認されています。
 1 体内 胚運命マッピングとクローン解析 注: 我々 は広く細胞モデルの開発と疾患モデルでクローン アーキテクチャの起源を評価するこれらのアプローチを使用している。 7, 8, 9, 10. <ol><li>、クレエでマウスと Cre 記者とマウスの間で合うを設定します 。
	メモ: クレエは SMC マークの使用します。Myh11 CreERT2 または Acta2 CreERT2 マウス 11 , 12 は、この目的のため使用されます。我々 は広く萌芽期ティッシュをマークするため ROSA26R CreERT2 マウス 13 を使用しています。
	<ol><li>クローン解析のマルチカラー Cre 記者 (例えば 紙吹雪や虹 [Rb] マウス) 8 , 14 , 15 を使用し、運命のマッピングを使用して、単色 Cre 記者 (例えば、 ROSA26R YFP マウス 16) または二重色 Cre 記者 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17. 
		注: この育種方式を使用して成体 2-6 ヶ月前 (一般に 〜 30 g)、胚、クレエと Cre 記者が生成されます</li>。
	</ol></li> <li>朝は、金属を使用して膣にプラグ プローブして萌芽期の日 (E) 0.5 としてプラグ検出の日の正午をチェックします</li>。
	<li>プラグインが検出されたとき男性から女性を区切ります</li>。
	<li>準備 4-オハイオ-タモキシフェンとタモキシフェン作業ソリューションを。
	<ol><li>4-オハイオ-タモキシフェンの 100% エタノール、2 分間渦の 50 μ L に 5 mg を溶解し、コーン油の 450 μ L を追加。氷の上には、サイクル サンプルが冷えるまでの間休憩 10 秒サイクルの出力レベル 2 で超音波を照射します。サンプルは、完全に溶解した後 (通常 〜 超音波照射の 4-5 サイクル) 熱量溶液 200 μ L をとり、最終的な作業ソリューション (4-オハイオ-タモキシフェン 1 mg/mL) にするためコーン油の 1,800 μ L に溶解します</li>。
		<li>50 mg/ml 100% エタノールと渦に希釈、タモキシフェンのそれが溶解するまで。完全に溶解して 45 ° C で攪拌し最終的な作業ソリューション (タモキシフェン 10 mg/mL) コーン油で希釈</li>。
	</ol></li> <li>初期胚誘導の注入 4 ああタモキシフェン腹腔妊娠中のダム。
	<ol><li>4 ああタモキシフェン注射 (妊娠中のマウス、または約 5 mg/kg 体重あたりまで 〜 150 μ g) を使用して、E5.5 で、その後彼らは実行可能なダムや胚、子犬をもたらすと</li>。
		<li>0.5 - ダムの胚で妊娠中の 1.5 mg (または 17 〜 50 mg/kg) の投与量で使用タモキシフェン 〜 E9 以降。すべての注射の 30 G の針を使用します 。
		注: 0.22 μ m のフィルターによるろ過は注入前にすべての混合物を殺菌する通常使用されます。</li></ol></li> <li>クローン解析 4-オハイオ-タモキシフェン (例えば、5 mg/kg) またはタモキシフェン (例えば、50 mg/kg) に複数の細胞の高用量の腹腔内注射を使用します。
	<ol>個々 のセルをマーク、4 ああタモキシフェンまたはタモキシフェン投与量を滴定しなさい、興味 (すなわち 大動脈) の組織で分析 (このセクションの終わりに後述) としてほぼすべての胚があるないラベルのセルまたはセルだけに <li>単一の色。これはしきい値線量です</li>。
	</ol></li> <li>中期後期妊娠期間で細胞をマークし、彼らの運命やクローナリティ生後早期のマウスでトレースする注入プロゲステロン腹腔妊娠中のダムの付随して 1:2 (プロゲステロン: タモキシフェン) でタモキシフェンと線量比 。
	注: タモキシフェン投与が 17 〜 50 mg/kg とプロゲステロンの用量は 8.5 〜 25 mg/kg (すなわち、タモキシフェン投与の半分)。プロゲステロン注射は、1 〜 2 日で労働を遅らせる可能性があります</li>。
	<li>安楽死綿やガーゼを含む容器にダムを配置する場所、オープン ドロップ方法を使用希望年齢の胚で妊娠中のダムは、原液イソフルランを浸した。気胸を誘導するために胸腔を開くことで、重要な臓器を削除することによってまたは頚部転位を実行することによって死を確認します</li>。
	<li>は、70% エタノールで腹部を浄化します。腹部を切開し、子宮を解剖はさみを使用します。子宮から胚を外し、慎重に胎盤や鉗子を使用して卵黄嚢胚から分離します</li>。
	<li>頚部転位または手術用はさみで斬首や鋭い刃を実行して E15 以上の胚を安楽死させる 。
	注: E15 より若い胚は急速に母の安楽死および/または母から胚の除去に続いて死ぬ</li>。
	<li>氷冷 PBS で胚を置き、クレエと Cre のレポーターの遺伝子型にはさみを使って尾の小さな部分をカットします</li>。
	<li>PBS で 3 回胚 2 h. 洗浄のための 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドで胚を修正し、30% スクロースを PBS で 2 日間かかることがあります彼らが沈むまで待って 15 mL チューブに胚をインキュベーションしています</li>。
	凍結 <li>塗りつぶしプラスチック金型の最適切削温度 (OCT) 化合物の最大レベルの 2/3 まで。室温気泡を最小限に抑える (RT) で 10 分間 10 月加温で完全に水没、金型でそれぞれの胚を垂直方向に配置します</li>。
	<li>凍結するティッシュのブロックをドライアイス、凍結する 70% エタノールお風呂で直立した場所。-80 でブロックをストア ° C</li>
	<li>は-22 ° c クライオスタット温度を設定し、全体の大動脈、10-20 μ m の厚さを横断を生成するブロックをカットします。RT-80 でそれらを格納する前に 30 分間のスライドを乾燥 ° C</li>
	<li>は、RT、fluorophores の漂白を避けるために光から保護でスライドを解凍します。0.1% PBS Tween20 とスライドを洗います。
	<ol><li>クローン解析核 (DAPI、5 mg/mL) のスライドを染色し、直接画像虹 Cre 記者の他のフルオロ (セルリアン: 433 nm 励起 max, 475 nm 蛍光最大; mOrange: 548 nm、562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm)。
		<ol><li>正立型蛍光顕微鏡で蛍光物質を検出するために、次のフィルター使用: DAPI (励起/最大帯域幅 350/50 nm、排出量最大/帯域幅 460/50 nm)、セルリアン (励起 436/20 nm、発光 480/40 nm), テキサスの赤 (励起 560/40 nm、発光 630/75 nm) と mOrange (励起 577/10 nm、発光 630/50 nm) から mCherry を分離するカスタム フィルター</li>。
		</ol></li> <li>MTmG Cre 記者と運命のマッピング、GFP を検出 (484 nm、510 nm)、直接イメージングまたは免疫染色を用いた。正立型蛍光顕微鏡イメージングのため GFP フィルター (励起 470/40 nm、発光 525/50 nm) を使用します</li>。
		<li>免疫染色、4 ° C で一晩一次抗体を持つセクションを孵化させなさい、0.1% で PBS でトリトン X-100 を洗浄し 1 h. 使用反 CD31 の二次抗体とインキュベートし (最終濃度 0.0016 mg/mL)、抗 GFP (0.006 mg/mL) と。Cy3-直接共役アンチ SMA (1: 500 最終希釈倍率の一次抗体と二次 antibodie を使用フルオロ (1: 500 最終希釈) (材料の表 を参照) を直接共役 s.</li>
	</ol></li> <li>正立型蛍光顕微鏡でスライドを画像 (倍率: 4 X - 20 X) または共焦点顕微鏡 (10 X-63 X)。高倍率 1.4 0.6 の開口と 1,024 x 1,024 ピクセルのフレーム サイズ油目的 x 共焦点イメージングの 63 を使用します</li>。
</ol> 2。胚大動脈文化を外植体 注: このアプローチ、explanted の狭窄に beta3 のインテグリンの役割を評価に使用していた 今回の Eln (-/-) 胚大動脈 9 , 18. <ol><li>上 1.8、ステップごとの過剰イソフルラン吸入による E15.5 でタイミング妊娠中ダムを安楽死させる</li>。
	<li>収穫上 1.9-1.10 の手順に従って、胚を安楽死させると</li>。
	<li>葉末胚の位置し、解剖ボードに拡張四肢をピンします。郭清堅実で視覚化し、上部胸郭に胸骨を通じて腹部から縦切開をカットするはさみを使用してください。解剖まで胸腺、気管、肺、食道、肝臓、腸管</li>。
	<li>ゆっくりと引き腹鉗子を用いた心臓、胸部および腹部の空洞の背側面から大動脈の解剖はさみを使っています。大動脈を解放するために近位のルートと遠位腹部位置カットします</li>。
	<li>は、携帯文化フードで氷冷滅菌 PBS に大動脈を配置します。24 ウェル プレートに大動脈を転送し、DMEM で 0.5% で培養 37 24 h までの FBS ° C 
	注: 培養培地はブロッキング抗体 (例えば、 0.02 mg/mL 9 時 αvβ3 抗体を抗インテグリン; 参照 テーブルの材料) や薬理学的エージェントと補われることができます</li>。
	<li>20 分の 4% パラホルムアルデヒドで固定し、PBS で 2 回大動脈を洗う</li>
	PBS のショ糖を <li>PBS と 30% で 1.5 mL チューブへの転送、大動脈で 3 回洗う。大動脈は流し後、する凍結するティッシュのブロック、カット セクション、および immunostain、1.13 1.15 の手順で上記のよう</li>。
</ol> 3。周産期の大動脈から SMC 分離 注: このアプローチは現在周産期マウス Eln (-/-) と野生型マウスから分離した大動脈平滑筋細胞の生物学を比較する使用されている。
<ol><li>、マウス子犬生後 (P) で 0.5、頚部転位または手術用はさみで斬首刑のいずれかまたは鋭い刃、1.10 の手順に記載されている上記安楽死</li>。
	<li>は、2.3 の手順を実行し、胸部・腹部を開くと後、23 G 針で左心室を穿刺します。滅菌 PBS 含む注射器に針を接続するプラスチック製のチューブを使用は、PBS が重力によって左心室に流し込まれるように高い位置で垂直に開催。ブランシュは肝臓までは、左心室に滅菌 PBS の注入を許可します。
	<ol><li>鉗子を使用して大動脈の外側に外の組織を削除し、ステップ 2.4 で説明されているように、大動脈を解剖します</li>。
	</ol></li> <li>DMEM の単一のソリューションで大動脈をダイジェスト 225 U/mL コラゲナーゼ、2.25 U/mL エラスターゼ 1 x 37 ° C. 手動で振るの 45 分の抗生物質抗真菌とチューブ 5-10 分毎で補われる (500 μ L)</li>
	<li>無菌細胞文化フード、titurate、上下単一細胞懸濁液を生成する 200 μ L ピペットでピペッティングによる消化組織。単一細胞懸濁液を 15 mL チューブに転送、DMEM、2 mL を加えるし、5 分 25 で 920 × g で遠心分離機 ° C</li>
	<li>は、上清を捨てます。SMC 培養液 (10 %fbs 添加 1 μ G/ml rhFGF、10 μ G/ml rhEGF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μ g/mL アムホテリシン B を含む DMEM) 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。35 mm 培養プレートに転送します 。
	注: 最初の分離時に単一 P0.5 野生型大動脈; から取得されます ~ 400,000 セル~ 300,000、これらの細胞は平滑筋細胞</li>。
	<li>は 37 ° C で細胞の培養し、新鮮な SMC 培 3 日ごとに変更します。標準的な手法を使用して、トリプシン、合流するときのセルを通路します。実験、3-7 の通路からセルを使用します</li>。
</ol> 4。皮下の妊娠 (または非妊娠中) 浸透圧のミニ ポンプ配置マウス 注: このアプローチは以前に使用した (例えば、 インテグリン β3 と β5 阻害剤の薬理学的エージェントを継続的に提供するにはcilengitide) 胚の 子宮内で 9 に。ポンプが E13.5 に妊娠中のダムで挿入され分娩まで維持されます。
<ol><li>麻酔と酸素 (1 L/分の流量) 誘導とメンテナンスのための 1-3% の 2-5% イソフルレン マウス。麻酔のレベルを監視するつま先ピンチ反射を使用し、必要に応じて麻酔薬を調整します。鎮痛に対する皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します</li>。
	<li>は、背中の下部をバリカンで剃る。滅菌ドレープ、手袋、および計測器を使用し、手術中に加熱外科板でマウスを維持します</li>。
	<li>腹臥位でそれぞれにマウスを置き、イソプロピル アルコールに続いて betadine で背中をスクラブします。3-5 cm より低い背部の尾の根元に吻側水平皮膚切開 0.5 - 1.0 cm の基になる筋肉を傷つけることがなく長さを作るメスを使用します</li>。
	<li>挿入、止血、切開、止血顎の開閉によりポンプ注入の吻方皮下ポケットを作成します</li>。
	<li>は、メーカーごとの選択のエージェントにミニ浸透圧ポンプを埋める &#39; s ガイドライン (材料の表 を参照してください)。ポケットにいっぱいポンプを挿入し、クリップまたは 6-0 非吸収性縫合糸で切開を閉じる。総手術時間が 10 分未満であることを確認</li>
	<li>は, 胸骨の横臥から回復が彼らまでマウス 15 分毎を監視します。48 時間毎の 6-12 h 皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します。マウスは、全身麻酔から完全に回復して、毎日それらを監視します。クリップの削除手術 7-10 日後に縫合糸またはします</li>。
</ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice+expressing+mCherry+fluorescent+protein+substituted+for+the+murine+smooth+muscle+alpha-actin+gene.">Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene.</a> Genesis. 48, 457-463 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+lacks+a+transplantable+progenitor+for+smooth+muscle+type+alpha-actin-expressing+cells.">Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells.</a> Stem Cells. 24, 13-22 (2006).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

マウスの大動脈とその主要な枝動脈硬化のモデルなど、大人の病理学の条件の広範な調査とは対照的形態形成と胚および周産期の大動脈の病原性について知られています。ここでは、具体的には平滑筋細胞、胚/周産期大動脈に着目し、体内組織植を介して大動脈を研究するためのプロトコルを提供し、SMC の分離方法します。これらの無料の方法は、胚/周産期の大動脈を研究する様々 ...

多細胞生物の細胞に栄養素と酸素を提供する関数の循環システム、ない外部環境と接触して、これらの細胞からの老廃物や二酸化炭素を削除します。脊椎動物、主循環システムは、ポンプ血血管のシリーズを通して、心で構成されます。動脈や、静脈などの太い血管の壁から成っている 3 つの層: 私) 内膜や血管内皮細胞の内側の層ii) メディア、または交互に円周方向の中間層細長い平滑筋細胞平滑筋細胞と弾性線維板;および iii) 外膜や結合組織、線維芽細胞の外側の層。血管生物学の研究の大半は血管内皮細胞に焦点を当てる、血管新生を新しい内皮細胞ライニング管の形成を調査します。比較では、平滑筋細胞は、比較的ほとんど注目を します。ただし、平滑筋細胞、血管病理、通常の動脈壁の建設に重要な細胞タイプです。
大動脈は心臓の左心室からの心拍出量を受けて体内最大口径動脈です。それは、多様な人間の病気、動脈硬化、動脈瘤、解離などに悩まされています。大人の有機体の大動脈とその主要な枝に激しく調査血管疾患のモデルで。例えば、供給が低比重リポ蛋白受容体またはアポリポ蛋白 E 遺伝子の null マウス高脂肪食を開発、動脈硬化と運命のマッピングの最近の研究を示す既存の平滑筋細胞がの種類の細胞に上昇を与える、動脈硬化性プラーク1。大動脈瘤の病理学的変化があります SMC アポトーシスと細胞外マトリックス2,3を改造します。
大幅に少ないは胎生期および周産期の期間中に SMC の形態形成と病態について知られています。ここでは、胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞体内の組織移植片の細胞を研究するためプロトコルを提供します。例えば、プロトコルの最初のセクションは、運命とマウス胎仔のクローン解析を区切ります。セル固有のプロモーターの制御下を表明した Cre リコンビナーゼを容易に特定のセルのマーキングとその子孫4,5,6;ただし、セル固有のラベルの時間的制御はマウスの萌芽期の開発中に挑戦することができます。この文脈において胚平滑筋細胞 (e.g.,Myh11またはActa2)、Cre 記者プロモーターの下で条件付きクレエを表現する私たちを提供タモキシフェンまたはその活性代謝物 4-オハイオ州 - にタモキシフェン妊娠中ダムを注入するための方法胚や生後の子孫の標識細胞を分析するため。さらに、運命のマッピングの研究、主に利用する単一記者 fluorophore1,7と Cre 記者と対照をなしてクローン解析大幅にマルチカラー Cre 記者と強化されています。
プロトコルの 2 番目と 3 番目のセクションでは、分離、それぞれ胚大動脈および新生児期から大動脈平滑筋細胞を培養するための方法を説明します。こうした方法により、特に大動脈弁植の平滑筋細胞のシグナル伝達経路の操作と薬理学的エージェントの直接影響を分析します。したがって、マウスの伝統的な遺伝子操作をよりもはるかに速い方法で興味のティッシュの特定の遺伝子の役割を検査します。さらに、孤立した SMC 研究細胞遊走の解析が容易し、付着性は、技術的には、限定の生体内。
最後に、4 番目のプロトコル セクションは、皮下浸透圧ミニ ポンプ搭載されて妊娠中 (または非妊娠) のマウスにおける薬理学的エージェントの配置を区切ります。このメソッドは、急速な代謝のための連続的な注入を必要とするエージェントによる胚の発育に及ぼす影響の分析を促進します。頻繁に注射の代替多くの代理店のための実用的ではない、それは妊娠中のダムにかなりの不快感を引き起こす可能性があります避ける必要があります。

<table width="1061">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T5648</td>
			<td style="width:412px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Corn oil</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">C-8267</td>
			<td>Vehicle for tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">4-OH-tamoxifen</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H7904</td>
			<td>Active metabolite of tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Progesterone</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P8783-5G</td>
			<td>Use at half the concentration of tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">OCT compound</td>
			<td style="width:216px;">Sakura tissue tek</td>
			<td style="width:111px;">4583</td>
			<td>For making cryoblocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Cryomolds</td>
			<td style="width:216px;">Polysciences inc</td>
			<td style="width:111px;">18986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">DAPI</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D9542</td>
			<td>IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>IHC staining of SMA, final dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:216px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:111px;">550274</td>
			<td>IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A-11121</td>
			<td>IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647</td>
			<td style="width:216px;">Life Technologies</td>
			<td>a21244</td>
			<td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488</td>
			<td style="width:216px;">Life Technologies</td>
			<td>a11008</td>
			<td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">10567-014</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-integrin beta3 blocking antibody</td>
			<td style="width:216px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">553343</td>
			<td>Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>44H14977A</td>
			<td>For digesting aorta</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Elastase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>34K15139</td>
			<td>For digesting aorta</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Antibiotic-antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:216px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:216px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">G5021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:216px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Alzet osmotic mini-pump</td>
			<td style="width:216px;">Durect Corporation</td>
			<td style="width:111px;">2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:216px;">Nikon </td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> TCS SP5</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Branson Sonifier 450</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Myh11-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td>19079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acta2-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td style="width:111px;">8463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(mTmG/mTmG) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td> 026862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(EYFP/EYFP) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td> 006148 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(Confetti/Confetti) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td>13731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(Rb/Rb) mice</td>
			<td style="width:216px;">Lab of Dr. Irv Weissman</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:412px;">Obtained from lab of Dr. Irv Weissman</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vivo and tissue and cell explant approaches to study the morphogenesis and pathogenesis of the embryonic and perinatal aorta

大動脈は体の最大の動脈です。大動脈の壁は、内皮細胞の内側の層、中間層の弾性線維板と平滑筋細胞 (SMCs) 交互になると線維芽細胞と細胞外マトリックスの外側の層で構成されます。病態モデル (例えば、アテローム性動脈硬化) 成人の大動脈での広範な研究とは異なり、はるかに少ない胎生期および周産期の大動脈について知られています。ここでは、我々 は平滑筋細胞に焦点を当てる形態形成の解析や正常な開発および病気の胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞の病因のプロトコルを提供します。具体的には、4 つのプロトコルが含まれている: 私)生体内で胚運命マッピングとクローンの解析;ii) 胚大動脈培養;周産期の大動脈; iii) SMC 分離・ iv) 妊娠 (または非妊娠) マウス皮下浸透圧ミニ ポンプ配置。したがって、これらのアプローチは、origin(s)、運命、そして大動脈の生体内における平滑筋細胞のクローン構造の調査を促進します。薬理学的エージェントへの継続的な暴露によって胚大動脈形態形成子宮内で調節できます。さらに、孤立した大動脈組織外植片または大動脈平滑筋細胞は muscularization、増殖、移動などの基本的なプロセスの間に特定の遺伝子ターゲットの役割に洞察力を得るために使用することができます。孤立した平滑筋細胞と器官培養切片の大動脈にこれらの仮説を生成する実験は、薬理学的および遺伝的アプローチを通じて体内のコンテキストで評価できます。

代表的なクローン性解析で平滑筋細胞のEln (細胞外マトリックス蛋白質エラスチン遺伝子) の変異株の胚運ぶまた Eln(+/-) マウスにEln(+/-)、Acta2 クレエT2マウスを交配、マルチカラー ROSA26R(Rb/Rb)記者。手順 1 で説明したプラグがチェックされ、E12.5 で単一タモキシフェン注入 (1.5 mg) で誘導された妊娠中のダム、彼らが ...

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Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

8.4K ビュー.  Yale University School of Medicine. ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

発生生物学

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a wide range of techniques encompassing ex vivo and in vitro approaches. However, most studies still rely on the analysis of two-dimensional (2D) imaging data, which limits proper evaluation of a developmental process like axial extension and somitogenesis involving highly dynamic interactions in a complex 3D space. Here we describe techniques that allow mouse live imaging acquisition, dataset processing, visualization and analysis in 3D and 4D to study the cells (e.g., neuromesodermal progenitors) involved in these developmental processes. We also provide a step-by-step protocol for optical projection tomography and whole-mount immunofluorescence microscopy in mouse embryos (from sample preparation to image acquisition) and show a pipeline that we developed to process and visualize 3D image data. We extend the use of some of these techniques and highlight specific features of different available software (e.g., Fiji/ImageJ, Drishti, Amira and Imaris) that can be used to improve our current understanding of axial extension and somite formation (e.g., 3D reconstructions). Altogether, the techniques here described emphasize the importance of 3D data visualization and analysis in developmental biology, and might help other researchers to better address 3D and 4D image data in the context of vertebrate axial extension and segmentation. Finally, the work also employs novel tools to facilitate teaching vertebrate embryonic development.

Here, we describe computational tools and methods that allow visualization and analysis of three and four-dimensional image data of mouse embryos in the context of axial elongation and segmentation, obtained by in toto optical projection tomography, and by live imaging and whole-mount immunofluorescence staining using multiphoton microscopy.

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...