このプロトコルは、平面方向での原始心内膜の分析を可能にする。心内膜細胞の分布、他の差し止め命令の異方性を解析し、弁発生中の単一の心内膜細胞の形状を記述することができます。古典的な組織切片と比較して、内弁再生領域のエンフェイスイメージングにより、無傷の胚における弁発生中の平面細胞極性と心内膜細胞のダイナミクスの分析が可能になります。
この方法は、心臓発達中の平面細胞極性の知識を深めるために使用できます。安楽死させた妊娠マウスから摘出した子宮を、氷冷PBTを含むペトリ皿に入れることから始めます。細かい鉗子を使用して解剖顕微鏡下で子宮から個々の脱落膜を取り除きます。
細いピンセットを使用して、胚がある落膜の白い部分を切開します。それをそっと取り除き、引っ張らないようにし、先端を切り落としたP-1000を使用して、胚が壊れずに通過するのに十分な直径を残して、新しいPBTを含む新しいペトリ皿に胚を移します。ジェノタイピングのために、卵黄嚢の約0.5平方ミリメートルの小片または後端からの尾の一部を取り、頭に向かって5〜10個の体節を数え、100ミリリットルの適切なバッファーで消化します。
ヒュームフードの下で、胚を摂氏4度の2ミリリットルの微量遠心チューブ内の氷冷4%PFAに移します。胚を2時間から4°Cで一晩、ナテーターに固定します。ヒュームフードの下で、胚に触れることなく、4%PFA固定液をマイクロ遠心チューブから取り出します。
PFA を適切な容器に入れて廃棄します。胚を冷たいPBTで室温で10分間5回洗浄します。細かい鉗子を使用して心臓を取り外し、新しいPBTを備えた新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
PBTをPBSトリトンに置き換え、オービタルシェーカーで室温でサンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。PBSトリトンを、10%熱不活性化ウシ血清を含むPBSトリトンを含むブロッキング溶液に置き換えます。.オービタルシェーカーで摂氏4度で2時間から一晩インキュベートします。
ブロッキング溶液を、所望の濃度の一次抗体を含むブロッキング溶液と交換します。摂氏4度のオービタルシェーカーで一晩インキュベートします。摂氏4度で一晩インキュベートした後、オービタルシェーカーで室温で1.5時間サンプルをインキュベートします。
このステップは、信号対雑音比を高めるために重要です。一次抗体溶液を取り出して摂氏4度に保ち、今後最大3回の実験を行います。最高の保存のために、アジ化ナトリウムを最終濃度0.02%まで添加します。
次に、胚をPBSトリトンでそれぞれ3分間3回洗浄します。胚をPBS Tritonで30分間3回洗浄し、摂氏4度のオービタルシェーカーに保ちます。最後の洗浄後、一次抗体宿主種に対する蛍光標識二次抗体を含むブロッキング溶液1ミリリットルを加えます。
次に、DAPIを溶液に加え、摂氏4度のオービタルシェーカーで一晩胚をインキュベートします。摂氏4度で一晩インキュベートした後、オービタルシェーカーで室温で1.5時間胚をインキュベートします。このステップは、信号対雑音比を高めるために不可欠です。
テキスト原稿に記載されているように、PBSトリトン洗浄手順を繰り返します。PBSが入った35ミリメートルのペトリ皿にハートを置きます。タングステン線と細い鉗子を使用して、房室管または流出路を分離し、それらを縦方向に切断します。
カバースリップ、スライド、鉗子、適切なチップを備えたP-200ピペット、ペーパータオル、およびDAPIなしで蛍光を発するための水性グリセロールベースの封入剤を準備します。0.3〜0.6センチメートル離れたスライドに2枚のテープを貼り付けて、サンプルを押しつぶさずに元の形状を維持できる3Dルームスペースを作成します。次に、約20マイクロリットルのバッファーを使用して、カットされたP-200ピペットチップを使用して、テープストリップ間のスライドにサンプルを注意深くドロップします。
解剖顕微鏡を使用して精度を高めます。細かい鉗子を使用して、心内膜を上に向けて、心筋を下にしてサンプルをスライド上に置きます。ペーパータオルで余分なPBSを取り除き、サンプルに触れないようにしてください。
次に、サンプルを室温で1〜2分間乾燥させて、サンプルをスライドに付着させます。40マイクロリットルの水性ベースの封入剤を組織に追加します。カバースリップを2枚のテープの上に置き、針または鉗子でゆっくりとティッシュの上に下げます。
気泡は発生しないでください。カバースリップの各頂点に1滴のマニキュアを使用してカバースリップをシールします。マニキュアが乾いたら、吸収性ペーパータオルを使用して、カバースリップの側面から余分な封入剤を取り除きます。
カバースリップを動かさないでください。カバースリップの端に沿ってマニキュアを追加して完全に密閉し、マウントメディアの蒸発を防ぎます。正立顕微鏡または倒立共焦点顕微鏡を使用して、一般的なビューの場合は10倍の倍率で、詳細な画像の場合は3倍ズームで63倍の倍率で画像を撮影します。
心内膜の細胞形状は、弁の形成中に細胞分解能で分析された。単一細胞または数細胞のクローンが心内膜においてGFPを発現した。GFPの発現とVE-カドヘリンの細胞内局在との併用は、AJが溶解するにつれて膜突起を発達させるため、AJ動態と糸状足の形成およびEMT前の細胞との関係を研究するための効果的なアプローチでした。
心内膜におけるVE-カドヘリン染色の強度の違いは、弁膜前段階で房室管の胚性心内膜に異方性収縮性が存在することを示した。心臓全体をE8.5およびE9.5のVE-カドヘリン抗体で染色した。E8.5では房室管の心内膜は安定した上皮組織を有する傾向があり、4つ以上の細胞によって形成された頂点は検出されなかった。
E9.5では、最大6個の細胞の頂点がロゼット様構造を形成していることが観察され、これは、前述した上皮が活発な細胞再配列を受けている細胞組織と同様に、房室管心内膜が弁発生中に動的な細胞再配列を受けていることを示唆しています。このテクニックの専門家になるには、学習曲線が必要です。さらに、ソブリン鉗子とタングステン線を使用することを強くお勧めします。
今日、弁膜前心内膜の視覚化は断面に限られていました。私たちのアプローチは、平面的な観点から胚性心膜膜の挙動を研究する可能性を提供します。
