우리 감사 딘 리 대동맥 SMC 격리에 대 한 그의 실험실의 프로토콜을 공유. 미국 심장 협회는 건강의 국가 학회 (R21NS088854, R01HL125815, 및 D.M.G R01HL133016)에 의해 제공 된 지원 자금 (D.M.G.에 특정 14GRNT19990019), 예일 대학 (브라운-기술혁신 화목 오전 및 시작 D.M.G.에 기금)입니다.

모든 마우스 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 예일 대학에 의해 승인 됩니다.
 1. Vivo에서 배아 운명 매핑 및 클론 분석 참고: 우리는 이러한 접근 널리 평가 하 사용 셀과 그들의 클론 아키텍처 개발 및 질병 모델에서의 유래 7 , 8 , 9 , 10. <ol><li>는 크리스챤와 쥐와 쥐 Cre 기자와 사이 짝짓기 설정. 
	참고:는 있다 SMC 표시; 사용 됩니다. Myh11-CreERT2 또는 Acta2 CreERT2 마우스 11 , 12 주로이 목적을 위해 사용 됩니다. 우리는 광범위 하 게 배아 조직 표시 ROSA26R CreERT2 마우스 13를 이용 했다.
	<ol><li>클론 분석에 대 한 멀티 컬러 Cre 기자 (예를 들어, 색종이 또는 무지개 [Rb] 쥐) 8 , , 14 15를 사용 하 여 운명 매핑의 사용 하는 단색 Cre 기자 (예를 들어, ROSA26R-YFP 마우스 16) 또는 두 배 색깔 Cre 기자 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17. 
		참고:이 번 식 체계를 사용 하 여 성인 쥐를 2-6 개월 (일반적으로 30 ~ g)는 크리스챤과 Cre 기자 배아를 생성 합니다.</li>
	</ol></li> <li>금속을 사용 하 여 아침에 질 플러그 프로브 및 배아 일 (E) 0.5로 플러그 감지 당일 정오 고려 검사.</li>
	<li>플러그 감지 되 면 남성에서 여성을 분리.</li>
	<li>준비 4-오-tamoxifen 고 tamoxifen 작업 솔루션.
	<ol><li>4-오-타 목 시 펜에 대 한 100% 에탄올, 소용돌이 2 분의 50 µ L에 5 mg을 녹이 고 옥수수 기름의 450 µ L를 추가 합니다. 얼음, 샘플 냉각 될 때까지 주기 사이 휴식 10 s 사이클에 대 한 출력 레벨 2에서 sonicate. 샘플은 완전히 용 해 후 (보통 ~ 쥡니다의 4-5 주기), sonicated 솔루션의 200 µ L 고 1800 µ L의 최종 작업 솔루션 (4-오-tamoxifen, 1 mg/mL) 옥수수 기름에 용 해.</li>
		<li>그것 해산 때까지 tamoxifen에 대 한 100% 에탄올과 소용돌이에 50 mg/mL로 희석. 최종 작업 솔루션 (tamoxifen, 10 mg/mL)을 그것 완전히 용 해 되도록 45 ° C에서 저를 옥수수 기름에 희석.</li>
	</ol></li> <li>초기 배아 유도 주입 4-오-tamoxifen intraperitoneally 임신 댐.
	<ol><li>4-오-tamoxifen 주사 (임신 마우스, 또는 대략 5 mg/kg 체중 당 최대 ~ 150 µ g)를 사용 하 여 E5.5 및 이후 그들은 항복 가능한 댐, 배아, 그리고 새끼.</li>
		<li>0.5-1.5 m g (또는 17-50 mg/kg) 댐에서 태아와 임신에 대 한 복용량에서 사용 tamoxifen ~ E9 이후. 30g 바늘을 사용 하 여 모든 주사. 
		참고: 0.22 μ m 필터를 통해 여과 주입 전에 모든 혼합물을 소독을 일반적으로 사용 된다. </li></ol></li> <li>클론 분석을 위한 사용 4-오-tamoxifen (예를 들어, 5 mg/kg) 또는 (예를 들어, 50 mg/kg) 여러 셀을 표시 하려면 tamoxifen의 고용량의 복 주사.
	<ol><li>개별 셀, 같은 (즉, 대동맥)의 조직에서 거의 모든 배아 (아래와 같이이 섹션의 끝에) 분석 없음 표시 하는 셀 또는 셀만 4 오 타 목 시 펜 이나 tamoxifen 복용 아래로 적정 하 단일 색상; 이것은 임계값 복용량.</li>
	</ol></li> <li>중앙 늦게 임신 기간에 셀을 표시 하 고 추적 그들의 운명 또는 출생 후 마우스에서 clonality를 주입 호르몬 임신 댐의 복 강에 수반 1:2 (황 체 호르몬: tamoxifen) tamoxifen을 복용량 비율. 
	참고: 타 목 시 펜 복용은 17-50 mg/kg 및 황 체 호르몬 투여는 8.5-25 mg/kg (즉, tamoxifen 복용량의 절반). 황 체 호르몬 주사는 1 ~ 2 일에 의해 노동 지연 될 수 있습니다.</li>
	<li>Euthanize 댐 댐 솜 또는 거 즈를 포함 하는 소켓에 배치 됩니다 오픈 놓기 방법을 사용 하 여 원하는 나이의 태아와 임신 undiluted isoflurane와 젖 었. 흉 강 매를 유도 하 여, 중요 한 장기를 제거 하 여 또는 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 죽음을 확인 하십시오.</li>
	<li>정화 70% 에탄올과 복 부. 가 위를 사용 하 여 자르면 복 부와 자 궁 밖으로 해 부. 자 궁에서 태아를 제거 하 고 신중 하 게 태 반 및 노른자위 sac 집게를 사용 하 여에서 배아를 분리.</li>
	<li>E15 이상 배아를 자 궁 경관 탈 구 또는 잘린 수술가 위 또는 날카로운 칼 날을 수행 하 여 안락사. 
	참고: 배아 E15 보다 빠르게 죽는 어머니의 안락사 또는 어머니에서 배아의 제거 다음.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS에 배아를 놓고 있다 고 Cre 기자에 대 한 유전자 형을가 위를 사용 하 여 꼬리의 작은 조각을 잘라.</li>
	<li>PBS에 세 번 배아 2 h. 워시 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 배아를 수정 하 고 15 mL 튜브에, 그들은 싱크대까지 기다리고 이틀까지 걸릴 수 있습니다는 PBS에서 30% 자당에 태아를 품 어.</li>
	<li>채우기 플라스틱 동결 최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 최대 레벨의 2/3를 주조한 다. 형, 상 온 (RT) 거품을 최소화 하기 위해 10 분 동안 10 월 품에 완전히 빠져들에 각 배아를 세로로 배치.</li>
	<li>조직 블록을 드라이 아이스, 70% 에탄올 목욕 동결에 똑바로 고정 하는 장소. -80에서 블록 저장 ° c.</li>
	<li>는 Cryostat 온도-22 ° C를 설정 하 고 전체 대동맥, 10-20 µ m 두께 통해 가로 섹션을 생성 하는 블록을 잘라. -80에서 그들을 저장 하기 전에 30 분 동안 RT에서 슬라이드 건조 ° c.</li>
	<li>녹여 fluorophores의 표백 피하기 위해 빛에서 보호 하는 RT에 슬라이드. 워시와 PBS Tween20 슬라이드 0.1%.
	<ol><li>클론 분석, 핵 (DAPI, 5 mg/mL)에 대 한 슬라이드를 얼룩 및 직접 레인 보우 Cre 기자에 다른 fluorophores 이미지 (하늘색: 433-nm 여기 최대, 475 nm 방출 최대; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
		<ol><li>Fluorophores 직 립 형광 현미경으로 감지에 대 한 다음 필터 사용: DAPI (여기 맥스/대역폭 350/50 nm, 방출 최대/대역폭 460/50 nm), 리안 (여기 436/20 nm, 방출 480/40 nm), 텍사스 레드 (여기 560 / 40 nm, 방출 630/75 nm) 및 mOrange (여기 577/10 nm, 방출 630/50 nm)에서 mCherry를 별도의 사용자 지정 필터.</li>
		</ol></li> <li>MTmG Cre 기자와 운명 매핑, GFP를 감지 (484 nm, 510 nm), 직접 이미징 하거나 immunostaining를 사용 하 여. (여기 470/40 nm, 방출 525/50 nm) GFP 필터를 사용 하는 직 립 형광 현미경으로 이미징.</li>
		<li>Immunostaining에 대 한 섹션 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체를 품 어 0.1% 트라이 톤 X-100 PBS에 세척 하 고 다음 1 h. 안티 CD31 사용에 대 한 2 차 항 체로 품 어 (최종 농도 0.0016 mg/mL), 안티-GFP (0.006 mg/mL)와 Cy3-직접 활용된 안티-SMA (최종 희석 1: 500) 주 항 체 및 사용 보조 antibodie직접 fluorophores (최종 희석 1: 500) (테이블의 자료를 참조)를 활용 하는 s.</li>
	</ol></li> <li>직 립 형광 현미경으로 슬라이드 이미지 (확대: X-20 X 4) 또는 confocal 현미경 (10 X-63 X). 높은 확대에 대 한 사용 하 여 오일 목표 x confocal 영상 63 1.4-0.6의 숫자 조리개와 1024 x 1024 픽셀의 프레임 크기.</li>
</ol> 2. 배아 대동맥 문화 explant 참고:이 접근은 이전 integrin beta3 explanted는의 협에서의 역할을 평가 하는 데 사용 됩니다 Eln (-/-) 배아 대동맥 9 , 18. <ol><li>위의 단계 1.8에 의하여 초과 isoflurane 흡입에 의해 E15.5에 초과 임신 댐 안락사.</li>
	<li>수확 및 위에 1.9-1.10, 단계에 따라 배아를 안락사.</li>
	<li>태아 supinely 놓고 해 부 보드 확장된 사지를 고정 합니다. 해 부 stereoscope와 시각화 및 위 가슴에 흉 골을 통해 복 부 로부터 수직 절 개를 잘라가 위를 사용 하 여 있습니다. Thymus, 멀리 해 부 기관지, 폐, 식도, 간, 그리고 대 장.</li>
	<li>부드럽게 ventrally 집게를 사용 하 여 심장 내과 흉부 및 복 부 구멍의 지 측면에서 대동맥 해 부를 위를 사용 하 여. 대동맥을 출시, 근 위 루트와 원심 복 부 위치에서 잘라.</li>
	<li>셀 문화 후드에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS에 대동맥을 놓습니다. 24-잘 접시에 대동맥을 전송 하 고 0.5 %DMEM 문화 FBS 37에서 최대 24 h에 대 한 ° C. 
	참고: 문화 매체는 차단 항 체 (0.02 mg/mL 9 예를 들어, 안티 integrin αvβ3 항 체, 참조 테이블의 재료) 또는 약리 에이전트와 함께 보완 될 수 있습니다.</li>
	<li>대동맥 PBS로 두번 세척 하 고 20 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 수정</li>
	<li>세척 3 회 PBS 및 대동맥 30 %1.5 mL 튜브에 PBS에 자당. 대동맥 싱크 후 만들고 냉동된 조직 블록, 컷된 섹션, immunostain, 위에 1.13-1.15, 단계에서 설명한 대로.</li>
</ol> 3. Perinatal 대동맥에서 SMC 격리 참고:이 방법은 현재 사용 되 고 Eln (-/-)와 wildtype perinatal 쥐에서 분리 대동맥 SMCs의 생물학 비교.
<ol><li>는 murine pup 출생 후 하루 (P)에 0.5, 자 궁 경관 탈 구 또는 수술가 위로 잘린 또는 1.10, 단계에서 설명한 대로 날카로운 칼 날 위에 Euthanize.</li>
	<li>는 2.3 단계를 수행 하 고, 흉부와 복 부를 연 후 23 G 바늘 왼쪽된 심 실 펑크. PBS는 중력에 의해 좌 심 실으로 흐르고 그렇게 PBS 포함 된 무 균 주사기 바늘 연결을 사용 하 여 플라스틱 튜브 높은 위치에서 수직으로 개최. 간 blanches 때까지 좌 심 실에 살 균 PBS의 주입을 허용 합니다.
	<ol><li>집게를 사용 하 여 대동맥의 외부에 adventitial 조직을 제거 하 여 2.4 단계에서 설명한 대로 대동맥 해 부.</li>
	</ol></li> <li>DMEM의 단일 솔루션에 대동맥을 소화 (500 µ L) 보충 225 U/mL 콜라, 2.25 U/mL elastase, 및 1 x 37 ° C. 수동으로 쉐이크에서 45 분에 대 한 항생제 antimycotic 튜브 5-10 분 마다</li>
	<li>멸 균 셀 문화 후드, titurate 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 200 µ L 피 펫으로 아래로 pipetting으로 소화 조직. 단일 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 전송 DMEM의 2 개 mL를 추가 하 고 25에서 5 분 동안 920 x g에서 원심 ° c.</li>
	<li>폐기는 상쾌한. SMC 문화 매체 (DMEM 10% FBS 1 µ g/mL rhFGF, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL 페니실린/스와 2.5 µ g/mL 암포 B 보완 포함) 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 35 m m 문화 접시에 전송. 
	참고: 초기 격리 시 ~ 400000 셀에서에서 얻을 수 있습니다 단일 P0.5 wildtype 대동맥; ~ 이러한 세포의 300000은 SMCs.</li>
	<li>37 ° C에서 세포를 배양 하 고 신선한 SMC 문화 매체 3 일 마다 변경 합니다. 트립 신으로 표준 기술을 사용 하 여, 셀 때 confluent 통로. 실험, 구절 3-7에서에서 셀 사용.</li>
</ol> 4. 피하 임신 (또는 비 임신)에 삼 투 미니 펌프 배치 마우스 참고:이 접근은 이전 약리 에이전트 (예: integrin β3 및 β5 억제제를 지속적으로 제공 하는 데 사용 됩니다 cilengitide) 배아 utero에서 9. 펌프 E13.5에서 임신 댐에 삽입 하 고 출산 때까지 유지 되었다.
<ol><li>Anesthetize 유도 및 유지 보수에 대 한 1-3% 산소 (1 L/min의 유량)에 2-5 %isoflurane 쥐. 발가락-핀치 반사를 사용 하 여 마 취의 수준을 모니터링 하 고 필요에 따라 마 취 에이전트를 조정 합니다. 무 통을 위한 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg) 관리.</li>
	<li>는 클리퍼 스와 함께 허리를 면도. 무 균 커튼, 장갑, 그리고 악기를 사용 하 고 수술 하는 동안 난방 외과 접시에 쥐 유지.</li>
	<li>경향이 위치에 각 마우스를 배치 하 고 뒷면 betadine 이소프로필 알콜 다음 스크럽. Rostral 허리에서 꼬리의 기초에 대략 3-5 cm 가로 피부 절 개를 0.5-1.0 c m 기본 근육 부상 없이 길이 메스를 사용 하 여.</li>
	<li>Hemostat 턱을 개폐 하 여 펌프 주입에 대 한 rostrally 피하 주머니 만들고 절 개 한 hemostat 삽입.</li>
	<li>채우기 선택, 제조자에 의하여의 에이전트와 함께 삼 투 미니 펌프 &#39; s 지침 (재료의 표 참조). 주머니에 가득된 펌프를 삽입 하 고 클립 또는 6-0 비 흡수 봉합 절 개를 닫습니다. 총 수술 시간은 10 분 미만 인지 확인</li>
	<li>는 post-operatively, 그들 sternal recumbency에서 복구 될 때까지 15 분 마다 마우스를 모니터링 합니다. 48 h에 대 한 모든 6-12 h 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)를 관리 합니다. 쥐 완전히 전신 마 취에서 회복 때 그들을 매일 모니터링 합니다. 클립을 제거 하거나 봉합 수술 후 7-10 일.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis.">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nat Med. 21, 628-637 (2015).</li><li>Rowe, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+in+aneurysmal,+occlusive,+and+normal+human+aortas.">Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas.</a> J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).</li><li>Rodella, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+aortic+aneurysm+and+histological,+clinical,+radiological+correlation.">Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation.</a> Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).</li><li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).</li><li>Lakso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+oncogene+activation+by+site-specific+recombination+in+transgenic+mice.">Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).</li><li>Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+site-specific+recombination+in+mammalian+cells+using+a+ligand-dependent+chimeric+Cre+recombinase.">Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).</li><li>Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+developing+artery+muscularization+in+pulmonary+hypertension.">Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension.</a> Cell Rep. 6, 809-817 (2014).</li><li>Greif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+construction+of+an+arterial+wall.">Radial construction of an arterial wall.</a> Dev Cell. 23, 482-493 (2012).</li><li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+beta3+inhibition+is+a+therapeutic+strategy+for+supravalvular+aortic+stenosis.">Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis.</a> J Exp Med. 213, 451-463 (2016).</li><li>Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cell+progenitors+are+primed+to+muscularize+in+pulmonary+hypertension.">Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 7, (2015).</li><li>Wirth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G12-G13-LARG-mediated+signaling+in+vascular+smooth+muscle+is+required+for+salt-induced+hypertension.">G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension.</a> Nat Med. 14, 64-68 (2008).</li><li>Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+temporally-controlled+targeted+mutagenesis+in+smooth+muscle+cells+of+the+adult+mouse.">Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse.</a> Genesis. 47, 14-18 (2009).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Kumar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells.+Defining+a+mesenchymal+progenitor+niche+at+single-cell+resolution.">Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution.</a> Science. 346, 1258810 (2014).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+is+an+essential+determinant+of+arterial+morphogenesis.">Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis.</a> Nature. 393, 276-280 (1998).</li><li>Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+myosin+heavy+chain+exclusively+marks+the+smooth+muscle+lineage+during+mouse+embryogenesis.">Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis.</a> Circ Res. 75, 803-812 (1994).</li><li>Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastin+gene+is+disrupted+by+a+translocation+associated+with+supravalvular+aortic+stenosis.">The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis.</a> Cell. 73, 159-168 (1993).</li><li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+arterial+pathology+in+mice+and+humans+hemizygous+for+elastin.">Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin.</a> J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).</li><li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease,+supravalvular+aortic+stenosis.">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).</li><li>Pober, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Williams-Beuren+syndrome.">Williams-Beuren syndrome.</a> N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).</li><li>Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+treatment+of+cardiovascular+disease+in+Williams-Beuren+syndrome.">Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome.</a> J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).</li><li>Holtwick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle-selective+deletion+of+guanylyl+cyclase-A+prevents+the+acute+but+not+chronic+effects+of+ANP+on+blood+pressure.">Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).</li><li>Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP:+role+in+vascular+wall+integrity+and+protection+from+atherosclerosis.">LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis.</a> Science. 300, 329-332 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+adult+smooth+muscle+cell-targeted+Cre+recombinase+mouse+model.">Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).</li><li>Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice+expressing+mCherry+fluorescent+protein+substituted+for+the+murine+smooth+muscle+alpha-actin+gene.">Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene.</a> Genesis. 48, 457-463 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+lacks+a+transplantable+progenitor+for+smooth+muscle+type+alpha-actin-expressing+cells.">Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells.</a> Stem Cells. 24, 13-22 (2006).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Murine 대동맥과 동맥 경화 증의 모델 등의 성인 병 적인 조건에 그것의 주요 분 지의 광범위 한 조사와 달리 덜는 morphogenesis와 배아와 perinatal 대동맥의 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리 배아 perinatal 대동맥, 특히 SMCs에 집중 하 고 제공 하는 프로토콜을 vivo에서, 조직 explant 통해 대동맥 공부와 SMC 격리 접근. 이러한 무료 방법 제공 배아 perinatal 대동맥 공부를 다양 한 방법으로 조사 합니...

세포에 영양분과 산소를 제공 하는 다세포 생물 기능의 순환 시스템에 있으며 하지 외부 환경 접촉이 세포에서 폐기물 및 이산화탄소 제거 하. 척추 동물, 심장, 혈관의 시리즈를 통해 혈액을 펌프 기본 순환 시스템에 의하여 이루어져 있다. 동맥과 정 맥, 같은 큰 혈관의 벽 3 계층 구성: 나) intima, 또는 내부 층의 내 피 세포; 2) 미디어, 또는 원주 교류의 중간 층 길쭉한 SMCs 부드러운 근육 세포 및 탄성 lamellae; 그리고 iii) adventitia, 또는 결합 조직과 섬유 아 세포의 바깥 레이어. 혈관 생물학에서 연구의 대부분 신생 통해 새로운 내 피 세포 늘어선 관의 형성을 조사 하 고, 내 피 세포에 초점. 비교에서는, SMCs 상대적으로 작은 관심을 받을. 그러나, SMCs는 정상적인 동맥 벽의 건축에서 및 혈관 병 리에 중요 한 세포 유형입니다.
대동맥에서 심장의 좌 심 실 심장 출력을 받는 본문에 큰 구경 동맥입니다. 그것은 아 테 롬, 동맥, 및 해 부를 포함 하 여 다양 한 인간 질병에 의해 시달리 다. 성인 유기 체, 대동맥 및 그 주요 분 지는 심각 하 게 공부 하지 혈관 질환의 모델. 예를 들어, 인코딩 apolipoprotein E, 또는 저밀도 지 단백질 수용 체 유전자에 대 한 null이 쥐를 먹이 하는 고 지방 규정식 아 테 롬, 개발 하 고 최근 운명 매핑 연구 나타냅니다 기존의 SMCs에 여러 세포 유형을 일으키는 동맥 경 화성 플 라크1. 대동맥 동맥 류, 병 적인 변경 SMC apoptosis와 세포 외 매트릭스2,3개조를 포함.
실질적으로 더 적은 배아 및 perinatal 기간 동안 SMC morphogenesis 및 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리는 배아 및 perinatal 대동맥 SMCs에 vivo에서, 고립 된 세포와 조직 explants에서 공부에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 예를 들어, 프로토콜의 첫 번째 섹션 구분 운명 매핑 및 미 발달 쥐에 클론 분석. 특정 셀의 표시 및 그들의 자손4,,56; Cre recombinase 셀 전용 모터의 제어 아래 표현 용이 그러나, 휴대 전용 라벨의 일시적인 제어에 쥐에 배아 개발 하는 동안 전하실 수 있습니다. 이러한 맥락에서 SMCs (e.g.,Myh11 또는 Acta2)와 Cre 기자 활성 발기인에서 조건부 있다 표현 하는 배아 우리 tamoxifen 또는 그 활성 대사 산물 4-오-tamoxifen 임신 댐에서 주입 방법 제공 태아 나 산 후 자손에 레이블이 지정 된 셀을 분석을 위한. 또한, 운명 매핑 연구, 어느 주로 단일 기자 fluorophore1,7Cre 기자 활용, 달리 클론 분석은 실질적으로 향상 된 멀티 컬러 Cre 기자.
프로토콜의 두 번째 및 세 번째 섹션 분리 하 고 배양 배아 대동맥 explants 및 신생아에서 대동맥 SMCs 각각에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 접근 허용 신호 경로, 특히 대동맥 explants 또는, SMCs의 조작에 대 한 분석을 위한 약리학 대리인의 직접 효과. 따라서, 관심의 조직에 있는 특정 한 유전자의 역할 쥐에서 전통적인 유전자 조작을 통해 보다 훨씬 더 빠른 방식에서 상영 될 수 있습니다. 또한, 고립 된 SMC 연구 세포 이동의 분석을 촉진 하 고 기술적으로 접착 제한 에 비보.
마지막으로, 네 번째 프로토콜 섹션 구분 (또는 비 임신) 임신한 쥐에 약리 에이전트와 함께 로드 피하 삼 투 미니 펌프의 배치. 이 방법은 빠른 대사 때문에 지속적인 주입을 요구 하는 에이전트에 의해 발생 하는 배아 발달에 미치는 영향의 분석을 촉진 한다. 잦은 주사의 대안 많은 에이전트에 대 한 실용적 이며 피해 야 한다, 그것은 임신 댐에서 상당한 불편을 발생할 수 있습니다.

<table width="1061">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T5648</td>
			<td style="width:412px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Corn oil</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">C-8267</td>
			<td>Vehicle for tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">4-OH-tamoxifen</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H7904</td>
			<td>Active metabolite of tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Progesterone</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P8783-5G</td>
			<td>Use at half the concentration of tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">OCT compound</td>
			<td style="width:216px;">Sakura tissue tek</td>
			<td style="width:111px;">4583</td>
			<td>For making cryoblocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Cryomolds</td>
			<td style="width:216px;">Polysciences inc</td>
			<td style="width:111px;">18986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">DAPI</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D9542</td>
			<td>IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>IHC staining of SMA, final dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:216px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:111px;">550274</td>
			<td>IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A-11121</td>
			<td>IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647</td>
			<td style="width:216px;">Life Technologies</td>
			<td>a21244</td>
			<td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488</td>
			<td style="width:216px;">Life Technologies</td>
			<td>a11008</td>
			<td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">10567-014</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-integrin beta3 blocking antibody</td>
			<td style="width:216px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">553343</td>
			<td>Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>44H14977A</td>
			<td>For digesting aorta</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Elastase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>34K15139</td>
			<td>For digesting aorta</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Antibiotic-antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:216px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:216px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">G5021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:216px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Alzet osmotic mini-pump</td>
			<td style="width:216px;">Durect Corporation</td>
			<td style="width:111px;">2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:216px;">Nikon </td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> TCS SP5</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Branson Sonifier 450</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Myh11-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td>19079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acta2-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td style="width:111px;">8463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(mTmG/mTmG) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td> 026862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(EYFP/EYFP) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td> 006148 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(Confetti/Confetti) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td>13731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(Rb/Rb) mice</td>
			<td style="width:216px;">Lab of Dr. Irv Weissman</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:412px;">Obtained from lab of Dr. Irv Weissman</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vivo and tissue and cell explant approaches to study the morphogenesis and pathogenesis of the embryonic and perinatal aorta

대동맥은 신체에서 가장 큰 동맥 이다. 대동맥 벽 내 피 세포의 내부 계층, 탄성 lamellae 그리고 부드러운 근육 세포 (SMCs)의 중간 층 및 외부 층의 섬유 아 세포와 세포 외 매트릭스의 구성 됩니다. 성인 대동맥에 병 적인 모델 (예: 동맥 경화 증)의 광범위 한 연구와 달리 훨씬 덜 배아 및 perinatal 대동맥에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리가 초점을 SMCs는 morphogenesis의 분석 및 배아와 perinatal 대동맥 SMCs 정상적인 개발 및 질병의 병 인에 대 한 프로토콜을 제공. 특히, 포함 하는 4 개의 프로토콜은: 나) 배아 운명 매핑 vivo에서 및 클론 분석; ii) explant 배아 대동맥 문화; iii) SMC 별개로 perinatal 대동맥; 그리고 iv) 임신 (비 임신) 쥐에 피하 삼 투 미니 펌프 배치. 따라서, 이러한 접근 origin(s), 운명, 그리고 대동맥 vivo에서 SMCs의 클론 아키텍처의 조사를 촉진 한다. 약리학 대리인에 지속적인 노출에 의해 배아 대동맥 morphogenesis에서 utero에서 변조에 대 한 수 있습니다. 또한, 고립 된 대동맥 조직 explants 또는 대동맥 SMCs muscularization, 확산, 마이그레이션 등 기본적인 프로세스 동안 특정 유전자 목표의 역할에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 될 수 있습니다. 격리 된 SMCs explanted 대동맥에 이러한 가설 생성 실험 다음 약리 및 유전 접근을 통해 생체 내에 컨텍스트에서 평가 수 있습니다.

대표 클론 분석에서 SMCs의 Eln (세포 외 기질 단백질 엘라 스 틴을 인코딩 하는 유전자)에 돌연변이 체 배아에에서, Eln(+), Acta2-크리스챤T2 쥐 Eln(+) 쥐도 들고 성관계 했다는 멀티 컬러 ROSA26R(Rb/Rb) 기자. 1 단계에서 설명한 대로 플러그 했다 확인 하 고 임신 댐 했다 E12.5에 단일 tamoxifen 주입 (1.5 mg)으로 유도 한 그들은 E18.5?...

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Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

8.4K 조회수.  Yale University School of Medicine. 배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

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Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

연구

발생학

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

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Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

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Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

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Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a wide range of techniques encompassing ex vivo and in vitro approaches. However, most studies still rely on the analysis of two-dimensional (2D) imaging data, which limits proper evaluation of a developmental process like axial extension and somitogenesis involving highly dynamic interactions in a complex 3D space. Here we describe techniques that allow mouse live imaging acquisition, dataset processing, visualization and analysis in 3D and 4D to study the cells (e.g., neuromesodermal progenitors) involved in these developmental processes. We also provide a step-by-step protocol for optical projection tomography and whole-mount immunofluorescence microscopy in mouse embryos (from sample preparation to image acquisition) and show a pipeline that we developed to process and visualize 3D image data. We extend the use of some of these techniques and highlight specific features of different available software (e.g., Fiji/ImageJ, Drishti, Amira and Imaris) that can be used to improve our current understanding of axial extension and somite formation (e.g., 3D reconstructions). Altogether, the techniques here described emphasize the importance of 3D data visualization and analysis in developmental biology, and might help other researchers to better address 3D and 4D image data in the context of vertebrate axial extension and segmentation. Finally, the work also employs novel tools to facilitate teaching vertebrate embryonic development.

Here, we describe computational tools and methods that allow visualization and analysis of three and four-dimensional image data of mouse embryos in the context of axial elongation and segmentation, obtained by in toto optical projection tomography, and by live imaging and whole-mount immunofluorescence staining using multiphoton microscopy.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Soaked-Bead Assay를 사용한 닭 배아 발생 동안의 세포 분화, Morphogenesis, 및 패터닝 분석

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...