Name: generation of prostate cancer cell models of resistance to the anti-mitotic agent docetaxel
Uploaded: 2017-09-08T12:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel at JoVE.com

V.R. B米国保健省から資金を受け取る &#38; 人間サービス、NIH、国立癌研究所許可番号 1 K22 CA207458-01 と j. d. d.米国保健省から資金を受け取る &#38; 人間サービス、NIH、国立癌研究所許可番号 1 R01 CA207311-01。

1 50% の原因とドセタキセル濃度の定量の増減コロニー形成能力 (IC50) 注: このプロトコルでドセタキセル IC50 濃度はコロニー形成により評価されている。能力。捜査に基づく細胞生存率 (すなわち MTS の試金) を評価するために使用する代替の方法を使用できます &#39; 設定します。
<ol><li>DU145 の成長や 22Rv1 75 cm 2 フラスコ細胞 10 mM 今後の実験で使用される DMSO で希釈したドセタキセルの十分な在庫を準備します</li>。
	<li>ドセタキセル IC50 の決定のための細胞をプレート、フラスコからメディアを取り出して、5 ml の PBS のセルを慎重に洗う、2 mL 0.05% と孵化するフラスコ表面から細胞をデタッチする 37 ° C で 3-5 分のトリプシン-EDTA</li>。
	<li>は新鮮なメディアの 5 ml フラスコから細胞をトリプシンをすすいで 15 mL チューブに細胞懸濁液を収集します。(300 × g、室温 (RT) 3 分) の遠心分離によって細胞をペレットします</li>。
	<li>は、上澄みを除去、5 mL の新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁します、セルをカウントします。DU145 の 10 の 5 セル/mL x 2 2.5 と 22Rv1 の 10 の 5 セル/mL x 4 4.5 に細胞懸濁液を希釈、上下にピペッティングでよく混ぜるし、2 つの 6 ウェル プレートの各ウェルに懸濁液 2 mL をシードします</li>。
	<li>後 24 h、されるセルは、70-80% の合流点、追加 1 用量エスカレート ドセタキセル濃度 2.5 nM nM、5 nM、10 nM、25 nM、50 nM、100 nM、250 nM、500 nM、および各ウェルに 1000 nM。ドセタキセル ( 図 2 a) に使用される最高のボリュームで DMSO でうまくコントロールを扱う</li>。
	<li>後 72 時間は、メディアを含む薬物を吸引し、新鮮なメディアの 2 mL を追加します。約 4-5 日、以内プレートが染色できています</li>。
	<li>植民地を染色する 2-3 mL の PBS で軽く洗って、ティッシュ文化フードまたは発煙のフードの中に 20 分間 2 〜 3 mL クリスタル バイオレット溶液 (0.1% 10% ホルマリンで w/v) でそれらをインキュベートします</li>。
	<li>H 2 O を削除 H 2 O 2-3 mL で染色ソリューションと洗濯板を削除して板を風乾します</li>。
	<li>は、1 つが 50% (IC50) 細胞生存率が低下するドセタキセル濃度を判断する井戸を可視化で結果を分析します。手動で (同じ植民地を 2 回カウントを避けるため) にマーカーペンの助けを借りて、コロニーをカウントしてグラフ ( 図 2 a) の細胞生存率の割合を表します。最後に、( 図 3 a に示すように)、図表現用の皿のデジタル画像を取る</li>。
</ol> 2。ドセタキセル耐性前立腺癌細胞の世代 注: IC50 薬剤濃度の定量に使用される同じドセタキセル ソリューション在庫を使用して細胞治療を実行 (事前に十分な在庫を準備実験使用)。念のために何かがうまく行かないから前の手順では、細胞の小さなフラスコが常します。親細胞を小さなフラスコ全体の手順中に並列で成長し、ドセタキセル治療フラスコで使用された量を模倣の対応するボリュームで車両 (DMSO) にさらされる必要があります。
<ol><li>20 mL の培地を含む 150 cm 2 フラスコのセル板 DU145 または 22Rv1 (3.5 x 10 DU145 の 6.5 * 10 フラスコあたり 6 セル 6 セル 22Rv1 用フラスコあたり)。プロトコルの最後で十分な細胞を持っている細胞の 10 に 20 フラスコの使用勧めします</li>。
	<li>細胞は約 70-80% で、24 時間後合流点 ( 図 2 b ドセタキセルの前に)、プロトコルの手順 1 で決定された IC50 濃度にドセタキセルを追加 (5 nM のため、このプロトコルで記述されているセル).</li>
	<li>後 72 h はメディアを含む薬物を吸引し、ドセタキセル無料新鮮なメディア ( 図 2 b ドセタキセル後 72 時間) を追加します。メディアごとに 3-4 日を変更します。約 1-2 週間以内の抵抗性クローンが ( 図 2 b ドセタキセル後 7、14 日) 顕微鏡の下で明白である表示されます</li>。
	<li>メディアを吸引、15 ml の PBS セルを慎重に洗浄し、4 mL 0.05% と孵化フラスコ表面から細胞をデタッチする 37 ° C で 3-5 分のトリプシン-EDTA</li>。
	<li>では、新鮮なメディア 8 ml フラスコからトリプシン細胞を再懸濁します。すべての扱われたフラスコから細胞をプールします。遠心分離 (300 x g, 3 min, RT) によって細胞のペレットします</li>。
	<li>上澄みを除去、20 mL の新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁し、150 cm 2 フラスコで細胞をプレート (3.5 x 10 DU145 の 6.5 * 10 フラスコあたり 6 セル 22Rv1 用フラスコあたり 6 セル).</li>
	<li>細胞は約 70-80% で、24 時間後合流、5 を追加 nM ドセタキセル (初期 IC50 濃度) 再び</li>。
	<li>2.3 〜 2.6 の日 3 の手順を繰り返します</li>。
	<li>細胞は約 70-80% で、24 時間後合流、2 X IC50 ドセタキセル濃度と治療細胞 (10 nM のため、このプロトコルで記述されているセル).</li>
	<li>繰り返し手順 2.3 2.8、ドセタキセル濃度の増量を次 (25 nM、50 nM、100 nM、250 nM)、最終的な最高濃度の下であなたのフラスコで育つセルの安定した人口を生成します。1,000 nM 濃度に達する ( 図 1 a) まで、6 ヶ月の高濃度の用量漸増プロトコルを実装できます</li>。
</ol> 3。機能特性の獲得ドセタキセル抵抗性コロニー形成法による 注: このプロトコルで抗癌剤はコロニー形成アッセイを使用して評価されています。捜査に基づく細胞生存率 (すなわち MTS の試金) を評価するために使用する代替の方法を使用できます &#39; 設定します。
<ol><li>プレート 2,000年細胞 (DU145 または 22Rv1、親およびドセタキセル耐性) 好評につき 6 ウェル プレートで、ウェルあたり 2 mL の培地を使用しています</li>。
	<li>後 24 h 追加ドセタキセル濃度を上げる (親細胞: 0.25、0.5、1、2.5、5 nM;DR セル: 50、125、250、500、1,000 nM)。DU145 と 22Rv1 の両方の細胞ライン。最高のドセタキセル投与に使用される同じボリュームでコントロールとしてのみ 1 つの井戸に DMSO を追加します</li>。
	<li>72 時間後メディアを含む薬物を吸引し、新鮮なドセタキセル無料メディアを追加します</li>。
	<li>プレートのコロニーが顕微鏡の下で表示されるまで 1-2 週間をインキュベートします</li>。
	<li>植民地を染色する 2-3 mL の PBS で軽く洗って、ティッシュ文化フードまたは発煙のフードの中に 20 分間 2 〜 3 mL クリスタル バイオレット溶液 (0.1% 10% ホルマリンで w/v) でそれらをインキュベートします</li>。
	<li>H 2 O を削除 H 2 O 2-3 mL で染色ソリューションと洗濯板を削除して板を風乾します</li>。
	<li>井戸を可視化し、(同じ植民地を 2 回カウントを避けるため) にマーカーペンの助けを借りて、コロニー カウントを手動で結果を分析、グラフに細胞生存率の割合を表します。図表現 ( 図 3 a) 用の皿のデジタル画像を撮影します</li>。
</ol> 4。表現型特性のドセタキセル取得小塚 qRT PCR 解析を介して 注: ドセタキセル耐性 (DR) 細胞が彼らの親の細胞と比較して異なる発現プロファイルを展示 28, 29. qRT PCR による選択の成功を検証できるため、特定のマーカーのプライマーを使用して (プライマー シーケンスの [マテリアル]; 詳細についてを参照してください、結果] セクションを参照してください)。これは、第 3 ラウンド以降選択の各ラウンドの後行ってください。また、西部にしみが付くことによってドセタキセル耐性表現型の評価も可能です。
<ol><li>親およびドセタキセル耐性細胞 RNA 抽出キットを使用し、メーカーからの RNA の抽出 &#39; の指示 (テーブルの材料 および詳細については試薬を参照)。最小値を使用して 1-10 の 6 セル × 2 をお勧めします</li>。
	<li>数量 RNA 260 nm の吸光度、分光光度計を使用して。最高純度の 260 nm/280 nm の吸光度比は 2.0 に近いする必要があります</li>。
	<li>Perform 逆相補的 DNA (cDNA) 逆のトランスクリプション キットを使用して、次の製造元を取得する転写 &#39; の指示 (参照 表の材料 および詳細については試薬)、20 μ L の RNA の 1 μ g を使用して反応混合物 (cDNA のより高い金額が必要な場合、反応混合物をそれに応じてスケール アップ).</li>
	<li>は次のように興味の各遺伝子の 3 通 qPCR 反応を準備: - 2 μ 10 μ M 前方プライマー 2 - μ 10 μ M 逆プライマー - 10 μ L SYBR グリーン PCR マスター ミックス - 5 μ L H 2 O -1 μ L の 4.3 のステップから新しく準備された cDNA 。
	メモ: は、このプロトコルで使用されるプライマーのシーケンスの 材料表 を参照してください</li>。
	<li>PCR プログラムを次のように設定する: - 95 ° C、15 分 - 94 ° C、30 秒 | 
	-40 56 ° C s | 40 回 - 30 のための 72 ° C s |</li>
	QPCR の結果を分析し、親間の遺伝子発現の変化を決定する <li>博士サンプル興味の各遺伝子のサイクル (Ct) のしきい値値 3 通で決定され、平均読み込み制御 (アクチン帳票平均を正規化) 博士 (Ct DR) の親細胞 (Ct 親)。親セルの値は、1 に正規化されます。ΔCt (Ct DR - 親 Ct) は最終的な mRNA のフォールドの変更を取得する決定は、グラフで表されます。増加 &#62; 2 増減の &#60; 0.5 が重要考慮され、ドセタキセルの確立の良い検証耐性表現型 ( 図 3 b) を取得します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Lapenna, S., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+kinases+as+therapeutic+targets+for+cancer.">Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8 (7), 547-566 (2009).</li><li>Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+anti-mitotic+therapies:+can+we+improve+on+tubulin+agents?.">Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents?.</a> Nature reviews. Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).</li><li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-binding+agents:+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics.">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li><li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol.">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li><li>Schiff, P. B., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol+stabilizes+microtubules+in+mouse+fibroblast+cells.">Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (3), 1561-1565 (1980).</li><li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (5), 379-393 (2007).</li><li>Kops, G. J. P. L., Weaver, B. A. A., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+road+to+cancer:+aneuploidy+and+the+mitotic+checkpoint.">On the road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint.</a> Nature reviews. Cancer. 5 (10), 773-785 (2005).</li><li>Derry, W. B., Wilson, L., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substoichiometric+binding+of+taxol+suppresses+microtubule+dynamics.">Substoichiometric binding of taxol suppresses microtubule dynamics.</a> Biochemistry. 34 (7), 2203-2211 (1995).</li><li>Jordan, M. A., Wendell, K., Gardiner, S., Derry, W. B., Copp, H., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+block+induced+in+HeLa+cells+by+low+concentrations+of+paclitaxel+(Taxol)+results+in+abnormal+mitotic+exit+and+apoptotic+cell+death.">Mitotic block induced in HeLa cells by low concentrations of paclitaxel (Taxol) results in abnormal mitotic exit and apoptotic cell death.</a> Cancer research. 56 (4), 816-825 (1996).</li><li>Orth, J. D., Kohler, R. H., Foijer, F., Sorger, P. K., Weissleder, R., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitosis+and+antimitotic+drug+responses+in+tumors+by+in+vivo+microscopy+and+single-cell+pharmacodynamics.">Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics.</a> Cancer research. 71 (13), 4608-4616 (2011).</li><li>Zasadil, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+paclitaxel+in+breast+cancer+is+due+to+chromosome+missegregation+on+multipolar+spindles.">Cytotoxicity of paclitaxel in breast cancer is due to chromosome missegregation on multipolar spindles.</a> Science translational medicine. 6 (229), (2014).</li><li>Dominguez-Brauer, C., Thu, K. L., Mason, J. M., Blaser, H., Bray, M. R., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Mitosis+in+Cancer:+Emerging+Strategies.">Targeting Mitosis in Cancer: Emerging Strategies.</a> Molecular cell. 60 (4), 524-536 (2015).</li><li>Torre, L. A., Bray, F., Siegel, R. L., Ferlay, J., Lortet-Tieulent, J., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics,+2012.">Global cancer statistics, 2012.</a> CA: a cancer journal for clinicians. 65 (2), 87-108 (2015).</li><li>Petrylak, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docetaxel+and+estramustine+compared+with+mitoxantrone+and+prednisone+for+advanced+refractory+prostate+cancer.">Docetaxel and estramustine compared with mitoxantrone and prednisone for advanced refractory prostate cancer.</a> The New England journal of medicine. 351 (15), 1513-1520 (2004).</li><li>Tannock, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docetaxel+plus+prednisone+or+mitoxantrone+plus+prednisone+for+advanced+prostate+cancer.">Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer.</a> The New England journal of medicine. 351 (15), 1502-1512 (2004).</li><li>Sweeney, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemohormonal+Therapy+in+Metastatic+Hormone-Sensitive+Prostate+Cancer.">Chemohormonal Therapy in Metastatic Hormone-Sensitive Prostate Cancer.</a> The New England journal of medicine. 373 (8), 737-746 (2015).</li><li>Mahon, K. L., Henshall, S. M., Sutherland, R. L., Horvath, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+chemotherapy+resistance+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Pathways of chemotherapy resistance in castration-resistant prostate cancer.</a> Endocrine-related cancer. 18 (4), R103-R123 (2011).</li><li>Follit, C. A., Brewer, F. K., Wise, J. G., Vogel, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+identified+targeted+inhibitors+of+P-glycoprotein+overcome+multidrug+resistance+in+human+cancer+cells+in+culture.">In silico identified targeted inhibitors of P-glycoprotein overcome multidrug resistance in human cancer cells in culture.</a> Pharmacology research &amp; perspectives. 3 (5), e00170 (2015).</li><li>Ranganathan, S., Benetatos, C. A., Colarusso, P. J., Dexter, D. W., Hudes, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+beta-tubulin+isotype+expression+in+paclitaxel-resistant+human+prostate+carcinoma+cells.">Altered beta-tubulin isotype expression in paclitaxel-resistant human prostate carcinoma cells.</a> British journal of cancer. 77 (4), 562-566 (1998).</li><li>Martello, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+microtubule+destabilizing+factors+in+a+Taxol-resistant/dependent+A549+cell+line+with+an+alpha-tubulin+mutation.">Elevated levels of microtubule destabilizing factors in a Taxol-resistant/dependent A549 cell line with an alpha-tubulin mutation.</a> Cancer research. 63 (6), 1207-1213 (2003).</li><li>Lee, A. J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+confers+intrinsic+multidrug+resistance.">Chromosomal instability confers intrinsic multidrug resistance.</a> Cancer research. 71 (5), 1858-1870 (2011).</li><li>Sansregret, L., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Aneuploidy+in+Cancer+Evolution.">The Role of Aneuploidy in Cancer Evolution.</a> Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 7 (1), (2017).</li><li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutational+landscape+of+lethal+castration-resistant+prostate+cancer.">The mutational landscape of lethal castration-resistant prostate cancer.</a> Nature. 487 (7406), 239-243 (2012).</li><li>Taylor, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+profiling+of+human+prostate+cancer.">Integrative genomic profiling of human prostate cancer.</a> Cancer cell. 18 (1), 11-22 (2010).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells.">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li><li>Vidal, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targetable+GATA2-IGF2+axis+confers+aggressiveness+in+lethal+prostate+cancer.">A targetable GATA2-IGF2 axis confers aggressiveness in lethal prostate cancer.</a> Cancer cell. 27 (2), 223-239 (2015).</li><li>Mar&#237;n-Aguilera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+docetaxel+resistance+genes+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Identification of docetaxel resistance genes in castration-resistant prostate cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 11 (2), 329-339 (2012).</li><li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+candidate+biomarkers+of+therapeutic+response+to+docetaxel+by+proteomic+profiling.">Identification of candidate biomarkers of therapeutic response to docetaxel by proteomic profiling.</a> Cancer research. 69 (19), 7696-7703 (2009).</li><li>Lin, H. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+are+associated+with+docetaxel+chemotherapy+outcome+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating microRNAs are associated with docetaxel chemotherapy outcome in castration-resistant prostate cancer.</a> British journal of cancer. 110 (10), 2462-2471 (2014).</li><li>Puhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+leads+to+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+and+is+mediated+by+reduced+expression+of+miR-200c+and+miR-205.">Epithelial-to-mesenchymal transition leads to docetaxel resistance in prostate cancer and is mediated by reduced expression of miR-200c and miR-205.</a> The American journal of pathology. 181 (6), 2188-2201 (2012).</li><li>Rodriguez-Bravo, V., Carceles-Cordon, M., Hoshida, Y., Cordon-Cardo, C., Galsky, M. D., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+GATA2+in+lethal+prostate+cancer+aggressiveness.">The role of GATA2 in lethal prostate cancer aggressiveness.</a> Nature reviews. Urology. 14 (1), 38-48 (2017).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

本稿では、抗癌剤表現の習得のメカニズムの研究ができるドセタキセル耐性前立腺癌細胞モデル システムを生成する手法について述べる。このアプローチには、高い信頼性と再現性ですが、いくつかの潜在的な制限を考慮されなければなりません。以来だけでセルの一括人口のごく一部は、抗癌剤28出展、細胞の大規模な人口を持つ開始勧め (我々 は通常約 1.2 × 10 を占める 150 cm2、20 のフラスコをプレート8細胞)。プロトコルの主要な手順は、プロシージャの成功のために考慮されなければなりません。最初に、長期にわたって使用 (-80 ° c に正しく格納するとき年因数を用することができます 10 mM 在庫) の株式が作りたて同じドセタキセルを使用する非常に重要です。因数のドセタキセルのわずかな変化は IC50 のセル行タイミングの生成結果とコロニー形成結果に影響します。第二に、以来、バリエーションは、細胞の新しいバッチを使用する場合に発生することが個々 のセル各行の IC50 を決定するプロトコルを起動することが重要です。第三に、監視、エラーを迅速に検出して修正できるように、顕微鏡下で細胞を頻繁にチェックして、薬物治療が有効であることが不可欠です。最後に、常に汚染やプロトコルの途中で細胞の生存率に影響を与える可能性があります予期しない問題の場合中間段階の在庫を保つことをお勧めします。重要なは、我々 のプロトコルは高用量ドセタキセルの 72 h 最高を模倣する試みで薬の濃度一定ではなく、長い回復期間が続くために前立腺がんの細胞をさらすことによって薬剤耐性のモデルを生成することを目的と臨床このタキサン エージェント15,16前立腺癌治療のためにシナリオが報告されました。
さらに、薬剤耐性細胞が時間をかけて取得した耐熱性の進歩的な損失につながる可能性があります高い可塑性を示すことに注意してください。したがって、これらの細胞の文化 2-3 ヶ月以上の使用を拡張するはお勧めしません。恒久的な供給が必要な場合それは継続的に抵抗力がある細胞の新しいバッチを生成することをお勧めします。ただし、長時間細胞のバッチ培養される場合コロニー形成法と qPCR 使用できます彼らの抵抗を再評価します。別の方法としては、72 h (500-1,000 nM) のドセタキセルの高用量とセルを扱うことによって衰退の抵抗を高めるためです。1 〜 2 週間の回復期間後、表現型再テストできます qPCR とコロニー形成によって試金。(FBS、10 %dmso) で液体窒素に扱われた細胞の因数を格納する推奨されませんにも可能、です。凍結融解サイクル後抗癌剤の表現常に評価すべき再と上記の方法に注意してください。
これらの警告にもかかわらず我々28,29など30,31,32,33正常に主小説細胞を識別するためにこれらのモデル システムを採用することができたと腫瘍開始容量、細胞の存続およびドセタキセル耐性細胞における積極性に結びつく分子メカニズムが昇格。これら癌細胞モデル システムを使用して、その細胞の上皮、前立腺関連の分化マーカーの有無と対象の過剰発現の発達によって特徴付けられる、画一的な表現型を示すがわかりました (ノッチとハリネズミ) シグナル伝達経路は、化学療法の露出28 を生き残る。2 番目の研究では、公開されている患者の遺伝子データ セット24,25、一緒にこれらのモデルを使用して我々 を発見、先駆的転写因子 GATA2 非常において過剰発現転移性去勢抵抗性化学療法抵抗性の前立腺癌細胞。GATA2 直接シグナリング ネットワーク29IGF2 依存型の下流のキナーゼを活性化によって細胞の生存を増加します。特に、これらの研究は高度な転移性前立腺癌攻撃34GATA2 の新規のキーの役割を識別するを助けた。
薬剤耐性の開発は、ドセタキセルと前立腺がんに限定されない問題はがん化学療法薬の広い配列で処理の他の多くの種類の間で流行。確かに、実験的なモデルの可用性に同様の制限が適用されます、我々 のプロトコルは、他のがんの種類とそれぞれの抗癌剤メカニズムを研究に適応できると考えられる。
このプロトコルで記述としてドセタキセル耐性の細胞の生成は、抗癌剤の新規関連分子 · 細胞メカニズムを識別するために機能的なツールとして使用できます。これは、極めて悪性の前立腺がんの新しい治療法の開発が明確に、この病気について知っていることとどのように我々 の治療の境界を押してもう一度、新たな目標を見つけることへの扉を開きます。

細胞周期制御の損失によって引き起こされる増殖の増加率は、がん1の特徴です。この機能のプロパティをレンダリングします癌細胞細胞周期の主要なプロセスを忠実に一意に依存して中に S と M-相、様々 な細胞周期 DNA 損傷や細胞分裂の欠陥を誘発する薬を摂動の発展につながっています。従来の微小管ターゲット エージェント (Mta) が唯一の臨床的に承認された方法であり続ける分裂期キナーゼまたはモーター蛋白質の阻害剤のような多数の抗有糸分裂エージェントが現在開発中とテストの臨床試験、がん2,3,4の有糸分裂を対象とします。Mta はどちらか不安定 (ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン) または (タキサン派生剤パクリタ キセル、ドセタキセルまたはカバジタ キセル) 微小管を安定化および機能有糸分裂紡錘体5,6の形成を防ぐ。これらのエージェントは、紡錘アセンブリ チェックポイント7,8、長引く分裂逮捕および培養細胞9,10の最終的な細胞死と細胞分裂腫瘍11 欠陥で起因するトリガーします。 ,12と前立腺癌13多種多様なそれらの間の癌の治療に有用。
前立腺癌は最も頻繁に診断されるがんとがんの主要な原因関連の男性14人が死亡。ドセタキセルなど体エージェントは、前立腺がん患者の生存率を改善し、この病15,16,17の治療の主力は。残念ながら、初期腫瘍収縮にもかかわらず腫瘍細胞はしばしば治療中に薬剤耐性を開発します。いくつかの細胞メカニズムをアポトーシスと炎症性経路の規制緩和や ATP 結合カセット運送者のような薬剤の流出ポンプの活性化/過剰発現を含む抗癌剤の開発の原因に関与しています。P 糖タンパク質 (P ・ gp/ABCB1)、後者の場合、結果セル18,19の化学療法剤の輸出。タキサン系薬剤への抵抗は、チューブリンのアイソタイプやチューブリン変異は、薬剤とそのターゲット20,21間の相互作用を防ぐための表現の変更など、他の原因でリンクされています。さらに、抵抗は、ゲノム不安定性の蓄積と腫瘍の不均一性22,23に関連しています。ただし、タキサン抵抗のメカニズム完全に理解されない、明らかであるその外観を防ぐ治療戦略の不在によって。したがって、これらのメカニズムの解剖で支援実験モデルを生成し、これらの薬剤に抵抗性の発達を防ぐため新規の治療法を識別するために緊急の必要性があります。
この記事では前立腺癌細胞ドセタキセル耐性 (DR) の生成を可能にする方法をについて説明します。我々 はさらに、これらの細胞のコロニー形成アッセイおよび定量的 RT-PCR を用いた抵抗状態を検証する方法を説明します。このメソッドによって生成される細胞さた公開ひと腫瘍サンプル データベースに対してさまざまな実験的アッセイを実行する汎用性を提供する付加的な利点は、分子機能の多くの利点があります。腫瘍のサンプルで許可されているよりも時間の長い期間。療法の抵抗のこれらの癌モデルことができます多くの週の組織培養とその他のアプローチの間で展開される、遺伝子操作、顕微鏡法による可視化および分析できる遺伝子発現の。さらに、腫瘍形成と成長の生体内での効果をさらに分析するためにマウスで xenotrasplanted をすることができます彼ら。現在、前立腺癌の薬剤耐性を検討する主な方法は、腫瘍のサンプルの直接分析です。これらのサンプルは、遺伝子発現および特定の腫瘍の突然変異の状態に関する情報を収集するために非常に強力なシステムを提示、それらへのアクセスは非常に限られていることができます、彼らはさらに操作の実験的分析を維持することは困難でこのプロトコル24,25生成細胞を簡単に実行できます。重要なは、今後、代替アプローチなど患者から直接人間の派生オルガノイドの生成は、非常に強力なツールと現在法26,27に代替。どのような腫瘍が、元の環境で 3 D コンテキストで要約するが、ので organoids は細胞とひと腫瘍の完全なモデルになります。しかし、このプロトコルで記述した実験細胞モデルはまだ維持するために手頃な価格で高速な解析に適した。これらの細胞株を勉強して得た結果に外挿する、人間のサンプルや 3 D 文化の裏付け。したがって、このプロトコルは私達のプロトコルは、他の薬とがんの種類の研究に合わせることができるのですべてのセル行の抗癌剤メカニズムを研究に研究を細胞モデルを求めての関心の可能性があります。ここで説明する方法があらゆる研究室は、手頃な価格で適用し、薬剤耐性の分子・細胞メカニズムについての予備研究を許可する.

<table><tbody><tr><td>DU145 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>22Rv1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2505</td><td></td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1148</td><td>in DMSO (10mM)</td></tr><tr><td>Tissue culture flask 150cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td></tr><tr><td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini</td><td>900208</td><td></td></tr><tr><td>1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>0.05%Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Primers for qRT-PCR:</td><td>Life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACTIN R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of prostate cancer cell models of resistance to the anti-mitotic agent docetaxel

微小管ターゲット エージェント (Mta) は、腫瘍の広い範囲の治療の主力です。しかし、薬剤抵抗性獲得は、病気の進行の一般的な機構と悪性腫瘍の予後決定因子の機能です。前立腺癌 (PC)、Mta にタキサン ドセタキセルなどの抵抗が予後不良と高い死亡率率によって定義される病気の致命的な段階の方の進行と同様、治療の失敗に影響を与えます。何十年も学び、獲得抵抗性に貢献するメカニズムの配列完全に理解されていない、従ってこれらの進行した段階の患者に恩恵を受けることができる新しい治療上の作戦の開発に重大な制約をもたらす病気。末期前立腺がんの致命的な特徴を模倣し、ため、メカニズムを研究することができますドセタキセル耐性前立腺癌細胞の生成について述べるこのプロトコルで取得する抗癌剤によって発生します。潜在的な制限はありますが、時間をかけて抵抗特性の損失に基づくセルのモデルに組み込みドセタキセル耐性細胞株がこのメソッドによって作成された最近の研究で使用されているし、を進める機会を提供私たち致命的な前立腺癌で取得した抗癌剤の分子的理解。

このプロトコルは、ドセタキセル耐性 (DR) の前立腺癌の細胞の生成に します。図 1 a 図 1 bのプロトコル手順の概略にまとめたよう完了までの日程は 4 から 7 ヶ月まで及ぶかもしれない。時間の投資選択のセル行とプロトコルで説明されているように使用される薬物濃度の範囲によって異なる可能性があります。重要なは、各セルライン ドセタキセル IC50 濃度の定量は、選択 (図 2 a) の細胞のプロトコルで使用する薬剤の濃度範囲をエスカレートの設計をことができます。プロトコルが開始されると、プロトコルが正しく動作している場合を監視を顕微鏡下で異なる時点で初期ドセタキセルに及ぼす DU145 と 22Rv1 の細胞を観察できます。ドセタキセル治療プロセスを監視する時間のポイントを示唆: 72 h、7 日と 14 日のドセタキセル暴露後ドセタキセル暴露 (ベースライン) の前に。少数の腫瘍細胞はドセタキセルの露出を存続 (図 2 b) 顕微鏡の下で観察することができますのクローンを生成することに注意してください。
代表的な植民地形成アッセイと親の定量化グラフと新しく生成されたドセタキセル耐性 (DR) 細胞は、図 3 aに表示されます。生成されたドセタキセル耐性細胞が親細胞最大 1,000 倍以上の薬物濃度を生き残ることができることに注意してください。
最後に、ドセタキセル耐性の表現型は qRT PCR (図 3 b) によって検証できます。ABCB1 および GATA2 の発現特性と CK19 と CDH1 のダウンレギュレーションをドセタキセル耐性細胞、親細胞と比較してが表示すること注意してください。これらの遺伝子は、我々 はすでに実験以前に発行された仕事 GATA2 アップレギュレーション両方 DR セル モデル28,29CDH1 と共に CK19 のダウンレギュレーションで示されているために、検証に選ばれました。他、一貫して薬剤耐性細胞18,19で亢進によって示されている定番遺伝子 ABCB1 遺伝子も選ばれました。ただし、文献によると、細胞モデルと耐性細胞の生成の研究者により選択された薬剤によって他の遺伝子が選択されるかもしれないことに注意する重要です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig1.jpg"> 
図 1: ドセタキセル耐性前立腺癌細胞モデルの生成のためのタイムライン。(A) ドセタキセル耐性細胞モデルの生成のためのプロトコルのタイムラインの代表的な図。図は、ドセタキセル治療、検証手順、および各部分に必要な時間を示しています。(赤) は 72 h の示されたドセタキセル濃度親およびドセタキセル耐性細胞の機能的なコロニー形成アッセイを含むプロトコルの検証手順の模式図 (B) 代表コロニー割合および表現型検証に qRT PCR のグラフ。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig2.jpg"> 
図 2: 世代のドセタキセル耐性前立腺癌細胞モデル システム。(A) 図描いた DU145 と 22Rv1 親の前立腺癌細胞株におけるドセタキセル IC50 の決定 (プロトコルのステップ 1)。細胞生存率とビンブラスチン投与量の濃度が必要とドセタキセルの予想される割合が含まれます。代表 DU145 と 22Rv1 細胞生存率のグラフを示す 5 nM IC50 ドセタキセル露出の 72 h が含まれて後に。実験トリプリケートしデータを表す DU145 の平均 ± SD. (B) 代表的な明るいフィールド顕微鏡画像おり、22Rv1 細胞のドセタキセル抵抗 (プロトコルの手順 2) 発生時。赤い矢印は、プロトコルが完了した後にドセタキセル耐性クローンを示しています。スケール バー = 50 nm。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig3.jpg"> 
図 3: ドセタキセル耐性細胞モデルの機能および表現型特性。(A) 代表的な植民地形成アッセイの親およびドセタキセル耐性細胞 72 h コロニーのパーセントのための示されたドセタキセル濃度ごとの治療濃度が含まれているグラフで表されるため。実験、トリプリケートし、データを表す平均 ± SD. スケール バー = 5 mm (B) DR/ペアレンタル相対 mRNA 倍増加額 GATA2, CK19 と CDH1 ABCB1 の qRT PCR による定量化が表示されます。すべての qPCR の生データは、アクチンに正規化されます (詳細についてはプロトコルを参照してください)。実験は、トリプリケートし、データを表す平均 ± SD. * p &#60; 0.05。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel at JoVE.com

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

抗有糸分裂エージェント ドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成

がん治療への抵抗は、病気の進行と死亡に貢献します。抵抗性のメカニズムの基盤を決定する治療応答の改善に不可欠です。この原稿の詳細 PC 患者におけるドセタキセル抵抗への進行に関与する経路を解剖するため (PC) 前立腺癌のタキサン耐性細胞モデルを生成するプロトコル。

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

generation-prostate-cancer-cell-models-resistance-to-anti-mitotic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.2K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. がん治療への抵抗は、病気の進行と死亡に貢献します。抵抗性のメカニズムの基盤を決定する治療応答の改善に不可欠です。この原稿の詳細 PC 患者におけるドセタキセル抵抗への進行に関与する経路を解剖するため (PC) 前立腺癌のタキサン耐性細胞モデルを生成するプロトコル。

ビデオ: Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

がん研究

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

遺伝学

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate organoids are androgen responsive, three-dimensional (3D) cultures grown in a defined medium that resembles the prostatic epithelium. Prostate organoids can be established from wild-type and genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer. Importantly, patient derived organoids closely resemble tumors in genetics and in vivo tumor biology. Moreover, organoids can be genetically manipulated using CRISPR/Cas9 and shRNA systems. These controlled genetics make the organoid culture attractive as a platform for rapidly testing the effects of genotypes and mutational profiles on pharmacological responses. However, experimental protocols must be specifically adapted to the 3D nature of organoid cultures to obtain reproducible results. Described here are detailed protocols for performing seeding assays to determine organoid formation capacity. Subsequently, this report shows how to perform drug treatments and analyze pharmacological response via viability measurements, protein isolation, and RNA isolation. Finally, the protocol describes how to prepare organoids for xenografting and subsequent in vivo growth assays using subcutaneous grafting. These protocols yield highly reproducible data and are widely applicable to 3D culture systems.

Presented here is a protocol to study pharmacological responses in prostate epithelial organoids. Organoids closely resemble in vivo biology and recapitulate patient genetics, making them attractive model systems. Prostate organoids can be established from wildtype prostates, genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer.

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

医学

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse. We also depict representative results produced by these protocols. Finally, we discuss the advantages and utilization of these protocols.

マウス前立腺マイクロ解剖と外科的去勢

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Crystal Violet Staining: A Technique to Visualize Drug-Resistant Cancer Cells Using Colony Formation Assays

Source: Mohr, L. et al., <a href="https://www.jove.com/v/56327">Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a cell viability assay using a crystal violet staining procedure for chemotherapeutic drug-resistant cancer cells.

Crystal Violet Staining:コロニー形成アッセイを用いた薬剤耐性がん細胞の可視化技術

Source: Mohr, L. et al., Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)
In this video, ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学的手法

染色技術

細胞染色

Generating Chemoresistant Prostate Cancer Cells: A Procedure for Obtaining Drug-resistant Cancer Cells In Vitro

Source: Mohr, L. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56327" target="_blank">Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video describes a protocol for generating taxane-resistant cell models of prostate cancer. These models can help study the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in prostate cancer patients.

化学療法抵抗性前立腺癌細胞の作製:in vitroで薬剤耐性癌細胞を得るための手順

Source: Mohr, L. et al. Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)
This video ...

抗有糸分裂エージェントドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

マウス前立腺マイクロ解剖と外科的去勢

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

Crystal Violet Staining:コロニー形成アッセイを用いた薬剤耐性がん細胞の可視化技術

化学療法抵抗性前立腺癌細胞の作製:in vitroで薬剤耐性癌細胞を得るための手順

抗有糸分裂エージェント ドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

マウス前立腺マイクロ解剖と外科的去勢

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

Crystal Violet Staining:コロニー形成アッセイを用いた薬剤耐性がん細胞の可視化技術

化学療法抵抗性前立腺癌細胞の作製:in vitroで薬剤耐性癌細胞を得るための手順

抗有糸分裂エージェントドセタキセルに対する抵抗性の前立腺癌細胞モデルの生成