このプロトコルは、前立腺オルガノイド培養における薬理学的応答を評価するための標準的かつ再現可能な方法を提供する。前立腺オルガノイド培養は、細胞が基体膜マトリックスに三次元構造を採用できるようにすることで、生体内生物学と薬理反応の多くの側面を維持するインビトロシステムを提供する。特に、これらの方法を用いて、遺伝子型が前立腺の薬理学的反応を指示する方法を評価し、薬剤耐性をモデル化することに興奮しています。
これらの方法はドームめっき法を用いたオルガノイド培養系に適用することができる。しかしながら、成長因子などの培地中の成分は、組織の種類によって異なる場合がある。視覚的なデモンストレーションにより、プロトコルの手順と、研究者が利用できる他の多くの公表されたオルガノイド培養システムとの違いについて、より具体的かつ詳細な議論が可能になります。
オルガノイド培養は、典型的には二次元細胞培養よりも時間がかかる。これらのメソッドに余分な時間を割り当てるようにしてください。マウスまたはヒト組織から前立腺オルガノイドを単離することから始めます。
ミンチを酵素的に組織を消化して単一の細胞懸濁液を生成し、その後、5分間gの300倍で遠心分離して細胞を採取する。細胞を数え、基質膜マトリックスで再懸濁します。次に、事前に温めたオルガノイド培養プレート上のマトリックスドームの適切な密度でそれらをプレートします。
ドームは互いに離れて、井戸の側面から2ミリメートルでなければなりません。固まったら、ウェルの側面から静かにメディアを加えてマトリックスを破壊しないようにします。ドームが固まったら、完全に覆われるようにドームの上にメディアを追加します。
オルガノイドを、標準的なカウント方法で細胞数を決定する下流用途に必要な量まで成長させます。オルガノイドを使用する準備ができたら、Pten00ピペットで媒体を描画し、それを上下にピペットして基質膜マトリックスを破壊します。懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を300回gで5分間移動します。
上清を吸引し、細胞ペレットを5ミリリットルのPBSで洗浄する。遠心分離を繰り返し、トリプシン交換の4ミリリットルでペレットを再中断し、摂氏37度で振りながら5〜10分間消化させます。10%FBSのオルガノイド培地の等量を加えて、トリプシン置換を阻害し、チューブを300回gで5分間遠心します。
上清を吸引し、PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。その後、40マイクロメートルフィルターで細胞をひずんで単一細胞懸濁を確実にし、ヘモサイトメーターを使用して数えます。細胞懸濁液を10マイクロモルロキナーゼ阻害剤Y27632でオルガノイド培地を用いて10マイクロリットル当たり100細胞に希釈する。
1,100個の細胞を新しい円錐形チューブに移し、285マイクロリットルの基質膜マトリックスを加え、70%のマトリックス濃度になります。次に、細胞を35マイクロリットルのマトリックスドームにあらかじめ温めた24ウェルプレートに播種し、サンプルあたり3〜5個の複製物をプレートします。プレートをめくり、細胞インキュベーターに入れ、地下マトリックスを固めます。
10分後、インキュベーターからプレートを取り出し、ローキナーゼ阻害剤を含む培地を添加する。2日ごとに、7日後に培地をリフレッシュし、ドームごとに確立されたオルガノイドの数を数え、細胞の総数から形成されたオルガノイドの割合を計算する。先に説明したようにオルガノイドを単離した後、最終的な細胞数を決定するためのプロキシとしてオルガノイド形成効率および成長速度を用いてマトリックスドーム内のシード1,000〜10,000細胞を用いた。
その後、24ウェルプレートにマトリックスドームの35マイクロリットルをシードし、ドームを固めます。ローキナーゼ阻害剤と選択した薬物を含む培地を追加します。対照として薬物が溶解した車両を用いて、最大阻害濃度の半分を決定するために、ログ10インクリメンタルを行う。
培地を2~3日ごとにリフレッシュし、7日目にオルガノイドを分析し、原稿に記載されているように細胞生存率アッセイを行うことにより薬剤に対する薬理学的反応を判定する。トリプシン法を使用せずにオルガノイド断片をプレートするには、Pten00ピペットを使用して培地を吸引し、ピペットを上下に使用して基原膜マトリックスを破壊します。マトリックスが完全に破壊されたら、懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を300回gで5分間転送します。
上清を吸引し、PBSを5ミリリットル加えます。洗浄後、PBSの1ミリリットルでオルガノイドを再中断し、ガラスパスツールピペットでトリチュレーションによってオルガノイドを破壊する。前述のように100個のフラグメントで、オルガノイドフラグメントとシード5個の複製の数を定量化します。
7日後、原稿の指示に従って細胞生存アッセイを行う。野生型前立腺基底細胞は、発光細胞に比べて優れたオルガノイド形成を示した。PtenまたはP53のCRISPR-Cas9媒介性損失およびさらに増加した形成能力の両方の損失でオルガノイド形成のわずかな増加が達成された。
抗アンドロゲン分子の増殖に及ぼす影響は、異なる遺伝子型を有するマウスオルガノイドで試験された。P53の損失は抗アンドロゲン分子に対する耐性を引き起こさなかったが、Ptenの損失は抵抗性を増加した。しかし、P53とPtenの二重損失は完全な抵抗をもたらした。
アンドロゲン受容体阻害はまた、異型を変更しました。野生型Ptenが削除され、P53がオルガノイドを削除するとオルガノイドの大きさが減少し、PtenとP53の両方の損失を伴うオルガノイドは典型的に影響を受けなかった。予想通り、これらの細胞を脇腹に皮下に移植すると、二重に削除されたPtenおよびP53オルガノイドのみが成長した。
2つの異なるヒト前立腺癌オルガノイドMSKPCA2およびMSKPCA3は、抗アンドロゲン分子に対するそれらの応答について試験された。MSKPCA2オルガノイドの増殖は強く阻害されたのに対し、MSKPCA3オルガノイドは影響を受けなかった。MSKPCA2は、高レベルのアンドロゲン受容体とFKBP5ならびに顕著な発光タンパク質を発現した。
MSKPCA3はまた、基底および間葉マーカーを発現し、これらのオルガノイドが非発光アンドロゲン非依存表現型をモデル化することを示唆するFKBP5の発現を示さなかった。オルガノイドは、生き残るためには、ガラスピペットによるトリプシン化またはトリチュレーションのいずれかによって定期的に破壊される必要があります。頻度は種の起源と遺伝子型に依存する。
次世代シーケンシングまたはプロテオミクス実験の任意のタイプは、記載の手順に従って行うことができる。これらの実験は、フェノタイプと薬理学的応答の分子基盤を調査するであろう。この3次元オルガノイド培養技術は、研究者が体外で高度に制御された遺伝的文脈における薬理学的応答を研究することを可能にする。
これは、生体内研究で長いの信頼性の高い代替手段とすることができます。
