V.R.-B. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 &#38; 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 K22 CA207458-01 '과 법학. 건강의 미국 부 로부터 자금을 받습니다 &#38; 번호 1를 부여 하는 인간 서비스, 국립 보건원, 국립 암 연구소 R01 CA207311-01.

1. 식민지 형성 능력 (IC50)에서 50%를 일으키는 Docetaxel 농도 감소 참고:이 프로토콜에서 Docetaxel IC50 농도 평가 식민지 형성을 사용 하 여 능력입니다. 조사에 따라 세포 생존 능력 (즉, MTS 분석 실험)를 평가 하는 데 사용 하는 대체 메서드를 사용할 수 있습니다 &#39; 환경 설정.
<ol><li>성장 DU145 또는 22Rv1 75 cm 2 플라스 크에 세포와 10mm Docetaxel 미래 실험에 사용 되는 DMSO에 희석의 충분 한 재고를 준비.</li>
	<li>IC50 Docetaxel의 결정에 대 한 셀을 접시, 플라스 크에서 미디어를 제거, 신중 하 게 씻어 5 mL PBS, 셀 및 2 mL 0.05% 품 어 세포를 플라스 크 표면에서 분리를 37 ° C에서 3-5 분에 대 한 트립 신-EDTA.</li>
	<li>신선한 미디어의 5 mL을 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀 린스 하 고 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 원심 (300 x g, 3 분, 실 온 (RT))에 의해 셀을 펠 렛.</li>
	<li>는 상쾌한 제거 하 고 신선한 미디어의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend는 셀. 2-2.5 x 10 5 셀/mL DU145 및 22Rv1에 대 한 10 5 셀/mL x 4-4.5 세포 현 탁 액을 희석 아래로 pipetting으로 잘 혼합 하 고 두 6 잘 플레이트의 각 음에 서 스 펜 션의 2 개 mL를 씨앗.</li>
	<li>후 24 h, 70-80% 합류에 셀 때 추가 복용량 고조 Docetaxel 농도 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM, 그리고 각 잘 1000 nM. DMSO와 잘 컨트롤 Docetaxel ( 그림 2A)에 사용 되는 높은 볼륨에서 취급.</li>
	<li>후 72 h 발음 마약 미디어를 포함 하 고 신선한 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다. 약 4-5 일 이내 번호판 얼룩에 대 한 준비가 될 것입니다.</li>
	<li>식민지, 얼룩에 부드럽게 2-3 mL PBS로 세척 하 고 조직 문화 후드 또는 증기 두건 안쪽 20 분 동안 2-3 mL 크리스탈 바이올렛 솔루션 (0.1 w/v %10% 포 르 말린에) 그들을 품 어.</li>
	<li>H 2 O 2-3 mL에 대 한 솔루션 및 세척의 접시 얼룩 제거, H 2 O를 제거 하 고 접시 건조.</li>
	<li>어느 Docetaxel 농도 50% (IC50) 세포 생존 능력을 감소 하는 확인 하려면 우물을 시각화 하 여 결과 분석 합니다. 수동으로 ()을 피하기 위해 같은 식민지를 두 번 계산 마커 펜의 도움으로 식민지를 계산 하 고 그래프 ( 그림 2A)에서 세포 생존 능력의 비율을 나타냅니다. 마지막으로, ( 그림 3A에서 같이) 그림 표현에 대 한 번호판의 디지털 이미지를 받아.</li>
</ol> 2. Docetaxel 내성 전립선 암 세포의 생성 참고: 세포 치료 같은 Docetaxel 솔루션 주식 결심 IC50 약의 사용을 사용 하 여 수행 (사전에 충분 한 재고를 준비 실험 사용 하 여). 항상 뭔가 잘 작동 하지 않는 경우에 이전 단계에서 세포의 작은 술병을 유지. 부모의 셀을 전체 절차를 통해 작은 술병에 병렬로 성장 하 고 Docetaxel 취급 플라스 크에 사용 금액을 흉내 낸 해당 볼륨에서 차량 (DMSO)에 노출 한다.
<ol><li>미디어의 20 mL를 포함 하는 150 cm 2 플라스 크에 접시 DU145 또는 22Rv1 셀 (3.5 x 10 6 세포 플라스 크 당 DU145 및 6.5 * 10에 대 한 22Rv1에 대 한 플라스 크 당 6 셀). 10 ~ 20 셀의 플라스 크를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 충분 한 세포를가지고 것이 좋습니다.</li>
	<li>후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류 ( 그림 2B, Docetaxel 전에), 프로토콜의 1 단계에서 결정 IC50 농도에서 Docetaxel 추가 (5이이 프로토콜에서 설명 하는 셀에 대 한 nM).</li>
	<li>후 72 h 발음 마약 미디어를 포함 하 고 신선한, Docetaxel 무료 미디어 ( 그림 2B, Docetaxel 후 72 h)를 추가 합니다. 모든 3-4 일 미디어를 변경 합니다. 약 1-2 주 이내 저항 클론 ( 그림 2B, Docetaxel 후 7 ~ 14 일) 현미경 분명 나타납니다.</li>
	<li>미디어 발음, 신중 하 게 씻어 15 mL PBS와 셀 및 4 mL 0.05% 품 어 세포를 플라스 크 표면에서 분리를 37 ° C에서 3-5 분에 대 한 트립 신-EDTA.</li>
	<li>Resuspend 8 mL 신선한 매체를 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀. 모든 치료 플라스 크에서 수영장 셀입니다. 원심 (300 x g, 3 분, RT)에 의해 셀을 펠 렛.</li>
	<li>제거는 상쾌한, 셀 펠 릿 20 ml 신선한 매체의 resuspend와 150 cm 2 플라스 크에 세포 격판덮개 (3.5 x 10 6 세포 플라스 크 당 DU145 및 6.5 * 10에 대 한 22Rv1에 대 한 플라스 크 당 6 셀).</li>
	<li>후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류, 추가 5 nM Docetaxel (초기 IC50 농도) 다시.</li>
	<li>2.3 2.6에 하루 3 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>후 24 h, 세포는 약 70-80%에서 합류, 2 X IC50 Docetaxel 농도와 치료 세포 (10 nM이이 프로토콜에서 설명 하는 셀에 대 한).</li>
	<li>반복 2.3을 2.8, Docetaxel 농도의 복용량 단계적 확대를 다음 단계 (25 nM, 50 nM, 100 nM와 250 nM), 최종 높은 농도에서 플라스 크에서 성장 하는 세포의 안정 되어 있는 인구를 생성. 최대 6 개월 1000 nM 농도 ( 그림 1A)를 도달할 때까지 높은 농도 대 한 복용량 에스컬레이션 프로토콜을 구현할 수 있습니다.</li>
</ol> 3. 기능 특성의 인수 Docetaxel 저항 식민지 대형 분석 결과 의해 참고:이 프로토콜 chemoresistance 평가 식민지 대형 분석 실험을 사용 하 여. 조사에 따라 세포 생존 능력 (즉, MTS 분석 실험)를 평가 하는 데 사용 하는 대체 메서드를 사용할 수 있습니다 &#39; 환경 설정.
<ol><li>접시 2000 셀 (DU145 또는 22Rv1, 보호자 및 Docetaxel 방지) 6-잘 접시에 잘, 당 사용 하 여 미디어의 2 mL 잘 당.</li>
	<li>후 24 h 추가 Docetaxel의 증가 농도 (부모의 셀: 0.25, 0.5, 1, 2.5 및 5 nM; 박사 셀: 50, 125, 250, 500 및 1000 nM). DU145 및 22Rv1 셀 라인에 대 한. 동일한 볼륨 높은 Docetaxel 복용량에 대 한 사용에서 컨트롤 한 잘에만 DMSO를 추가.</li>
	<li>72 h 후 미디어를 포함 하는 약물을 발음 하 고 신선한 Docetaxel 무료 미디어 추가.</li>
	<li>식민지 현미경 아래에서 표시 됩니다 때까지 1-2 주에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>식민지, 얼룩에 부드럽게 2-3 mL PBS로 세척 하 고 조직 문화 후드 또는 증기 두건 안쪽 20 분 동안 2-3 mL 크리스탈 바이올렛 솔루션 (0.1 w/v %10% 포 르 말린에) 그들을 품 어.</li>
	<li>H 2 O 2-3 mL에 대 한 솔루션 및 세척의 접시 얼룩 제거, H 2 O를 제거 하 고 접시 건조.</li>
	<li>우물을 시각화 하 고 수동으로 마커 펜 ()을 피하기 위해 같은 식민지를 두 번 계산의 도움으로 식민지를 계산 하 여 결과 분석 하 고 그래프에서 세포 생존 능력의 비율을 나타냅니다. 그림 표현 ( 그림 3A)에 대 한 번호판의 디지털 이미지.</li>
</ol> 4. Phenotypic 특성의 Docetaxel 저항 인수 형 qRT-PCR 분석 통해 참고: Docetaxel (DR) 내성 세포 전시 그들의 부모의 세포 라인에 비해 다른 식 프로필 28 , 29. 따라서 선택의 성공 qRT-PCR에 의해 확인할 수 있습니다 특정 표식에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 (뇌관 시퀀스에 대 한 참조 자료 섹션; 대 한 자세한 내용은, 결과 섹션을 참조 하십시오). 이 세 번째 라운드 후 시작 선택의 각 라운드 후 할 수 있습니다. 또는, 서쪽 blotting에 의해 Docetaxel 저항 표현 형의 평가 또한 가능 하다.
<li>RNA 추출 키트를 사용 하 고 제조 업체에 따라 보호자와 Docetaxel 내성 세포에서 RNA 추출 <ol>&#39; s 지침 (테이블의 재료 및 시 약 대 한 자세한 내용은 참조). 최소를 사용 하 여 1-2 10 6 셀 x 좋습니다.</li>
	분 광 광도 계를 사용 하 여 <li>계량 RNA 260 nm absorbance 최고의 순도, 260 nm/280 nm 흡 광도 비율 2.0에 가까운 이어야 합니다.</li>
	<li>Perform 역방향 역방향 전송 키트를 사용 하 고 제조 업체에 따라 보완 DNA (cDNA)를 전사 &#39; s 지침 (참조 테이블의 자료와 정보에 대 한 시 약), 20 µ L에서 RNA의 1 µ g를 사용 하 여 반응 혼합 (cDNA의 높은 금액 필요한 경우, 그에 따라 반응 혼합 최대 규모).</li>
	<li>관심사의 각 유전자에 대 한 다음과 같은 3 중에서 정량 반응을 준비: -2 µ L 10 µ M 앞으로 뇌관의 -2 µ L 10 µ M 역 뇌관의 -10 µ L SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스 -5 µ L H 2 O -1 µ L의 4.3 단계에서 새로 준비 된 cDNA. 
	주:이 프로토콜에 사용 되는 뇌관의 시퀀스에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
	<li>PCR 프로그램을 다음과 같이 설정: -15 분 동안 95 ° C -94 ° C 30에 대 한 s | 
	-40 56 ° C s | 40 번 -72 ° C 30에 대 한 s |</li>
	<li>정량 결과 분석 하 고 부모의 사이 유전자 발현에 변화를 확인 하 고 박사 샘플, 관심사의 각 유전자의 사이클 임계값 (Ct) 값 3 중에 결정 됩니다 평균 로드 제어 (말라 triplicate 평균으로 정규화 ) 박사 (박사 Ct) 및 부모의 셀 (부모의 Ct). 부모 셀에 대 한 값을 1로 정규화 됩니다. ΔCt (Ct 박사-부모의 Ct) 최종 mRNA 배 변화를 결정 하 고 그래프에 표시. 증가 &#62; 2 또는의 감소 &#60; 0.5 중요 하 게 고려 하 고는 Docetaxel의 설립의 좋은 유효성 검사 인수 저항 형 ( 그림 3B).</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+are+associated+with+docetaxel+chemotherapy+outcome+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating microRNAs are associated with docetaxel chemotherapy outcome in castration-resistant prostate cancer.</a> British journal of cancer. 110 (10), 2462-2471 (2014).</li><li>Puhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+leads+to+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+and+is+mediated+by+reduced+expression+of+miR-200c+and+miR-205.">Epithelial-to-mesenchymal transition leads to docetaxel resistance in prostate cancer and is mediated by reduced expression of miR-200c and miR-205.</a> The American journal of pathology. 181 (6), 2188-2201 (2012).</li><li>Rodriguez-Bravo, V., Carceles-Cordon, M., Hoshida, Y., Cordon-Cardo, C., Galsky, M. D., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+GATA2+in+lethal+prostate+cancer+aggressiveness.">The role of GATA2 in lethal prostate cancer aggressiveness.</a> Nature reviews. Urology. 14 (1), 38-48 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 원고에서는 우리 chemoresistance 표현 형의 획득에 기여 하는 메커니즘의 연구에 대 한 수 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델 시스템을 생성 하는 방법 설명. 이 접근은 매우 안정적이 고 재현, 일부 잠재적인 제한 사항은 고려해 야 합니다. 이후만 셀의 대량 인구의 극히 chemoresistance28을 전시할 것 이다, 것이 좋습니다 세포의 큰 인구와 함께 시작 (우리가 일반적으로 약 1.2 x 10에 대 한 계정을 150 cm2, 20 플라스 크 플레이트8 셀)입니다. 프로토콜의 주요 단계는 절차의 성공을 보장 하기 위해 고려 되어야 한다. 첫째, 그것은 매우 사용 같은 Docetaxel 갓 긴 기간 사용 (10 m m 재고-80 ° C에서에 제대로 저장 될 때 년에 aliquots를 사용할 수 있습니다)에 대 한 재고를 준비 하는 것이 중요. Aliquot Docetaxel에 약간의 변화 IC50, 셀 라인 타이밍의 세대의 결과 식민지 형성 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 그것은 유사 세포의 새로운 배치를 사용 하는 경우 발생할 수 있으므로 각 개별 셀 라인, IC50를 결정 하는 프로토콜을 시작 하는 중요 한. 셋째, 오류 수 있습니다 신속 하 게 감지 하 고 수정 현미경 세포를 자주 확인 하 여 약물 치료는 효과적인 모니터링에 필수적 이다. 마지막으로, 오염 또는 프로토콜 가운데 세포의 생존 능력에 영향을 미칠 수 있는 예기치 않은 문제 중간 단계의 재고를 항상 유지 하 고 좋습니다. 중요 한 것은, 우리의 프로토콜 72 h 뒤에 약의 더 낮은 일정 농도 보다는 긴 회복 기간, 최고의 모방 하려고 Docetaxel의 고용량을 전립선 암 세포를 노출 하 여 약물 내성의 모델을 생성 하는 것을 목표로 임상 시나리오가 taxane 에이전트15,16전립선 암 치료에 대 한 보고.
또한, 약물 내성 세포 전시 시간이 지남에 인수 저항 속성의 진보적인 손실로 이어질 수 있는 높은 소성을 주목 한다. 따라서 문화에 2-3 개월 이상에 대 한 이러한 세포를 사용 하 여 확장는 권장 하지 않습니다. 영구적인 공급 필요 하다 면 그것은 지속적으로 저항 세포의 새 일괄 처리를 생성 하는 것이 좋습니다. 그러나, 만약 셀의 일괄 처리 오랜된 시간 동안 경작 되는, 식민지 대형 분석 실험 및 정량 그들의 저항을 재평가 하 사용할 수 있습니다. 또 다른 대안은 72 h (500-1000 nM) Docetaxel의 높은 복용량으로 세포를 치료 하 여 말기 저항을 높일 것 이다. 1 ~ 2 주간의 회복 기간 후 phenotype 시험 될 수 있다 다시 정량 및 식민지 형성에 의해 분석 실험. 그것도 가능, 치료 세포의 aliquots (FBS, 10 %DMSO)에서 액체 질소에 저장을 권장 되지는 않지만. 그 후 동결-해 동 주기 chemoresistance 형 항상 다시 평가 해야 상기 방법으로 note 하시기 바랍니다.
이러한 경고에도 불구 하 고 우리28,29 등30,31,,3233 키 소설 세포를 식별 하기 위해 이러한 모델 시스템을 성공적으로 수 있었다 고 분자 메커니즘을 선도 높은 종양을 시작, 세포 생존, 용량과 Docetaxel 내성 세포에 공격. 이러한 암 세포 모델 시스템을 사용 하 여, 우리는 세포가 상피 및 전립선 관련 분화 마커의 부재와 대상의 overexpression 발달 특징 undifferentiated 형 전시 발견 (노치 및 고슴도치) 신호 경로, 화학요법 노출28살. 두 번째 연구에서 공개적으로 사용 가능한 환자 유전자 데이터 세트24,25, 함께이 모델을 사용 하 여 우리가 발견 그 초기 전사 요소 GATA2는 높은 overexpressed 전이성에 거세 저항 화학 요법에 저항력이 전립선 암 세포입니다. GATA2 신호 네트워크29IGF2 종속 다운스트림 키를 직접 활성화 하 여 세포의 생존을 증가 시킵니다. 특히, 이러한 연구 고급 전이성 전립선 암 공격34GATA2의 소설 키 역할을 식별 하는 데 도움이.
그것은 많은 다른 유형의 다양 한 화학요법 약물으로 치료 하는 암 중 널리 퍼진 약물 저항의 개발 Docetaxel과 전립선 암에 국한 되지 않습니다 하는 문제입니다. 실제로, 실험 모델의 가용성에 유사한 제한이 적용, 그리고 그것은 우리의 프로토콜 다른 암 종류 및 그들의 각각 chemoresistance 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 된 대로 Docetaxel 저항 세포의 생성 chemoresistance의 소설 관련 분자 및 세포 메커니즘을 식별 하는 기능적 도구로 사용할 수 있습니다. 이는 높은 악성 전립선 암에 대 한 새로운 치료법의 개발 수 똑, 우리가이 질병에 대해 무엇을 알고 하 고 우리는 환자를 치료 하는 방법의 경계를 한 번 더 밀고 새로운 목표를 찾아내기에 문을 엽니다.

세포 주기 통제의 손실에 의해 발생 하는 확산의 증가 속도 암1의 특징입니다. 이 기능 속성 렌더링 암 세포 고유 셀 사이클의 주요 프로세스의 충실도에 따라 동안 S-및 M-단계는 다양 한 세포 주기 perturbing DNA 손상 또는 mitotic 결함을 유발 하는 약물의 개발을 주도하 고 있다. 비록 mitotic kinases 또는 모터 단백질의 억제제 같은 수많은 안티 mitotic 에이전트는 현재 개발 되 고 임상 시험된에서 레거시 microtubule 대상 에이전트 (Mta) 계속를 위한 유일한 임상 승인 된 접근 암2,,34유사 분열을 대상으로. Mta 중 불안정 (Vinblastine Vincristine, Vinorelbine) 또는 (taxane 파생 에이전트 Paclitaxel, Docetaxel 또는 Cabazitaxel) microtubules 안정화 및 그로 인하여 작동 mitotic 스핀 들5,6의 형성을 방지. 이 트리거는 스핀 들 어셈블리 검사점7,8, 장기간된 mitotic 체포와 배양된 세포9,10 에 최후 세포 죽음 및 종양11에에서 mitotic 결함에 결과 ,12 고 따라서 전립선 암13큰 다양 한 그들의 사이에서 암 치료에 유용.
전립선 암은 가장 자주 진단 암과 암의 주요 원인이 남자14죽음 관련. Antimitotic 에이전트 Docetaxel 등 전립선 암 환자의 생존 향상 되며이 질병15,,1617의 처리에서 주류. 불행히도, 초기 종양 수축 량에도 불구 하 고 종양 세포 치료 중 약물 저항 자주 개발. 몇 가지 세포 메커니즘 chemoresistance, apoptotic와 염증 경로, 규제 완화 등 활성화/overexpression ATP 묶는 카세트 운송업 자 같은 마약 경과 펌프의 개발 원인에 연루 되어 P-당단백질 (P-gp/ABCB1), 후자는 결과 셀18,19에서 화학요법 에이전트의 수출. Taxanes 저항 또한 tubulin isotypes 또는 tubulin 돌연변이, 약물 및 그 대상 20,21사이의 상호 작용을 방지 하는 식의 변화와 같은 다른 원인으로 연결 되었습니다. 또한, 저항 게놈 불안정성 축적 및 종양이22,23관련 되어 있다. 그러나, taxane 저항에 기여 하는 메커니즘은 완전히 이해 되지,는 분명 모양을 방지 하는 치료 전략의 부재. 따라서, 이러한 메커니즘의 해 부에 지원 실험 모델을 생성 하 고 이러한 약물 저항의 개발을 방지 하는 새로운 치료 접근을 식별 하는 긴급 한 필요가 있다.
이 문서에서 우리는 전립선 암 세포 Docetaxel 저항 (DR)의 생성을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 추가 저항 상태 식민지 대형 분석 실험 및 양적 RT-PCR를 사용 하 여 이러한 셀의 유효성을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드에 의해 생성 세포 분자 기능을 통해 다양 한 실험적인 분석 실험을 수행 하는 융통성을 제공 하는 추가 혜택으로 공개적으로 사용 가능한 인간 종양 샘플 데이터베이스에서 발견의 많은 업과의 이점을 종양 샘플에서 허용 하는 것 보다 시간의 긴 기간 치료 저항의 이러한 암 모델 수 많은 주 조직 문화, 그리고 다른 접근 들에 대 한 확장, 유전자 조작, 현미경 검사 법 방법으로 시각 고 유전자 발현에 대 한 분석. 또한, 추가로 종양 형성 및 성장 vivo에서 효과 분석 하는 쥐에 xenotrasplanted 수 있습니다. 현재, 전립선 암의 맥락에서 약물 내성 연구를 주요 대체 방법 종양 샘플의 직접 분석 이다. 이러한 샘플 유전자 발현 및 주어진된 종양의 mutational 상태에 대 한 정보를 수집 하는 매우 강력한 시스템을 제시 하는 동안 그들에 게 액세스 매우 제한 될 수 있습니다 그리고 그들은 더 조작 및 실험 분석에 대 한 유지 하기 어려운이 이 프로토콜24,25생성 된 셀 라인으로 쉽게 할 수 있습니다. 중요 한 것은, 미래에 대안 같은 환자에서 인간의 파생된 organoids의 생성 될 것 이라고 매우 강력한 도구 현재 메서드26,27대안 접근 한다. 이후 그들은 어떤 종양은 그것의 원래 환경에서 3D 컨텍스트에서 정리 것 이다, organoids 세포와 인간 종양 사이의 완벽 한 모델 될 것입니다. 그러나,이 프로토콜에서 설명 하는 실험 셀 모델은 여전히 더 많은 유지 저렴 하 고 빠른 분석에 적합. 이러한 세포 선을 공부 하 여 얻은 결과를 추정 하 고 인간의 샘플 및 3 차원 문화에서 확인 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 우리의 프로토콜은 다른 약물과 암 종류의 연구에 적용할 수 있습니다 이후 어떤 셀 라인 chemoresistance 메커니즘 연구를 셀 모델을 추구 하는 연구원에 대 한 관심의 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 어떤 실험실, 저렴 한 가격에 적용 하 고 약물 내성의 분자 및 세포 메커니즘의 예비 연구를 허용 쉽습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DU145 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22Rv1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docetaxel</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1148</td>
			<td>in DMSO (10mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask 150cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>355001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>900208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05%Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III first strand synthesis system for RT-PCR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR:</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTIN R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of prostate cancer cell models of resistance to the anti-mitotic agent docetaxel

Microtubule 대상 에이전트 (Mta)는 다양 한 종양의 치료에 주류. 그러나, 화학요법 약물에 저항을 획득된 질병 진행의 공통 메커니즘 및 악성 종양의 전조 결정 기능 이다. 전립선 암 (PC), taxane Docetaxel 같은 Mta에 저항 치료 실패 뿐만 아니라 빈약한 예 지 및 높은 사망 율에 의해 정의 된 질병의 치명적인 단계 향해 진행을 지시 한다. 수십 년 동안 공부, 인수 저항에 기여 하는 메커니즘의 배열 완전히 이해 되지 않는다 고 따라서 이러한 고급 단계에 있는 환자를 유익할 수 있던 새로운 치료 전략의 개발에 상당한 제한이 포즈 질병입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 단계의 전립선 암의 치명적인 기능을 모방 하는 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 Docetaxel 내성 전립선 암 세포 라인의 세대는 인수 chemoresistance에 의해 발생. 잠재적인 제한 시간이 지남에, 저항 속성의 손실 등 셀 기반 모델에 내장에 불구 하 고이 메서드에 의해 생성 Docetaxel 저항 셀 라인 성공적으로 최근 연구에서 사용 된 및 발전 기회를 제공 우리의 치명적인 전립선 암에 인수 chemoresistance의 분자 이해.

이 의정서는 Docetaxel 저항 (DR) 전립선 암 세포의 생성으로 이어질 것입니다. 완료에 대 한 타임 라인 프로토콜의 단계 그림 1A 와 그림 1B의 도식 표현에 요약 된 대로 7 개월 4에서 범위 수 있습니다. 시간 투자 수 선택의 셀 라인 및 프로토콜에 설명 된 대로 사용 하는 약물 농도의 범위에 따라 달라 집니다. 중요 한 것은, 각 셀 라인 Docetaxel IC50 농도의 결정 선택 (그림 2A)의 셀에 대 한 프로토콜에서 사용 하 여 농도 범위를 확대 하는 약물의 디자인 수 있습니다. 프로토콜이 시작 되 면 모니터링 프로토콜 제대로 작동 하는 경우를 현미경 아래 다른 시간 지점에서 DU145 및 22Rv1 세포에 초기 Docetaxel 효과 관찰할 수 있습니다. 시간 포인트 Docetaxel 처리 과정을 모니터링 하는 제안: 72 h, 7 일 및 14 일에 대 한 Docetaxel 노출 후 Docetaxel 노출 (초기), 전에. 종양 세포의 단지 소수 민족 Docetaxel 노출 생존과 생성 (그림 2B) 현미경 관찰 될 수 있는 클론 note.
대표적인 식민지 대형 분석 실험 및 보호자의 부 량 그래프와 새로 생성 된 Docetaxel (DR) 내성 세포 그림 3A에서 표시 됩니다. Note 생성된 Docetaxel 내성 세포 약물 농도 부모의 셀 보다 더 높은 최대 1,000-fold 살아남을 수 있습니다.
마지막으로, Docetaxel 저항 표현 형 qRT-PCR (그림 3B)에 의해 유효성 수 있습니다. Note Docetaxel 내성 세포, 부모 세포에 비해 특성 최대-ABCB1 GATA2의 규정과 다운 레 귤 레이 션 CK19 및 CDH1의 표시. 때문에 우리는 이미 실험적으로 우리의 이전 게시 작업 GATA2 upregulation에 두 박사 셀 모델,2829CDH1 함께 CK19의 downregulation이이 유전자는 유효성 검사에 대 한 선정 됐다. ABCB1 유전자 약물 내성 세포18,19upregulated 일관 되도록 다른 사람에 의해 표시 되었습니다 주식 유전자로도 선정 되었다. 그러나, 그것은 문학에 따르면 고 셀 모델와 연구원에 의해 저항 세포 생성을 위해 선택 하는 약물에 따라 다른 유전자를 선택할 수 있습니다 주의 하는 것이 중요.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig1.jpg"> 
그림 1: Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델의 생성에 대 한 타임 라인. (A) Docetaxel 저항 셀 모델의 생성에 대 한 프로토콜 타임 라인의 대표 다이어그램. 그림 묘사 Docetaxel 처리, 유효성 검사 단계 및 각 부분에 필요한 시간. 보호자 및 Docetaxel 방지 셀 (빨간색)에서 72 h에 대 한 표시 Docetaxel 농도와 치료의 기능 식민지 대형 분석 실험을 포함 하는 프로토콜의 유효성 검사 단계 (B) 회로도 표현을 대표 식민지 비율과 qRT-PCR phenotypic 유효성 검사에 대 한 그래프. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig2.jpg"> 
그림 2: Docetaxel 내성 전립선 암 세포 모델 시스템의 생성. (A) 다이어그램 부모의 전립선 암 세포 선 DU145 및 22Rv1에서에서 Docetaxel IC50의 묘사 (프로토콜의 1 단계). 세포 생존 능력 및 복용량 고조 농도 필요 Docetaxel의 예상된 비율 포함 되어 있습니다. 대표 DU145 및 22Rv1 세포 생존 그래프 5를 나타내는 IC50 Docetaxel 노출의 72 h 포함 후로 nM. 실험은 triplicates 및 데이터 DU145의 평균 ± sd (B). 대표적인 밝은 분야 현미경 이미지 나타내고 22Rv1 세포에서 Docetaxel 저항 (프로토콜의 2 단계)의 생성 하는 동안 시간 표시. 빨간색 화살표 프로토콜 완료 Docetaxel 저항 복제를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig3.jpg"> 
그림 3: Docetaxel 저항 셀 모델의 기능 및 phenotypic 특성. (A) 보호자 및 Docetaxel 방지 셀 표시 Docetaxel 농도 72 h. 식민지의 비율에 대 한 모든 치료 농도 포함된 그래프에 표시 됩니다에 대 한 치료의 대표적인 식민지 대형 분석. 실험은 triplicates 및 데이터가 나타내는 sd. 스케일 바 평균 ± 5 mm. (B) 박사/부모의 상대 mRNA 배 증가 = ABCB1의 qRT-PCR에 의해 계량 GATA2, CK19 및 CDH1 표시 됩니다. 말라에 모든 정량 원시 데이터 정규화 (자세한 내용은 프로토콜 참조). 실험은 triplicates 및 데이터 대표 평균 ± sd. * p &#60; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

암 치료에 저항을 질병의 진행 및 죽음에 기여 한다. 저항의 기계 론 적인 토대를 결정 하는 것입니다 치료 응답을 개선 하기 위한 중요 한. 이 원고 전립선 암 경로 해 부 하기 (PC)의 taxane 저항 셀 모델을 생성 하는 프로토콜 PC 환자에서 Docetaxel 저항 진행에 관련 된 세부 사항.

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

generation-prostate-cancer-cell-models-resistance-to-anti-mitotic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.2K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. 암 치료에 저항을 질병의 진행 및 죽음에 기여 한다. 저항의 기계 론 적인 토대를 결정 하는 것입니다 치료 응답을 개선 하기 위한 중요 한. 이 원고 전립선 암 경로 해 부 하기 (PC)의 taxane 저항 셀 모델을 생성 하는 프로토콜 PC 환자에서 Docetaxel 저항 진행에 관련 된 세부 사항.

비디오: Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

연구

암 연구학

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. Recently, impressive advances in novel therapies have dramatically prolonged survival and improved quality of life for many cancer patients. Sadly, incidence of brain metastatic recurrences is fast rising, and all current therapies are merely palliative. Hence, good experimental animal models are urgently needed to facilitate in-depth studies of the disease biology and to assess novel therapeutic regimens for preclinical evaluation. However, the standard in vivo metastasis assay via tail vein injection of cancer cells produces predominantly lung metastatic lesions; animals usually succumb to the lung tumor burden before any meaningful outgrowth of brain metastasis. Intracardiac injection of tumor cells produces metastatic lesions to multiple organ sites including the brain; however, the variability of tumor growth produced with this model is large, dampening its utility in evaluating therapeutic efficacy. To generate reliable and consistent animal models for brain metastasis study, here we describe a procedure for producing experimental brain metastasis in the house mouse (Mus musculus) via intracarotid injection of tumor cells. This approach allows one to produce large number of brain metastasis-bearing mice with similar growth and mortality characteristics, thus facilitating research efforts to study basic biological mechanisms and to assess novel therapeutic agents.

Brain metastasis has become an urgent unmet medical need as its incidence has increased while therapeutic options have remained palliative. Creating experimental animal models of brain metastasis via intracarotid arterial injection of cancer cells facilitates mechanistic studies of the disease biology and evaluation of novel intervention regimens.

Intracarotid 암 세포 주입 뇌 전이의 마우스 모델을 제작하기

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) for prostate cancer are hampered by tumor heterogeneity and its complex microevolution dynamics. Traditional prostate cancer mouse models include, amongst others, germline and conditional knockouts, transgenic expression of oncogenes, and xenograft models. Generation of de novo mutations in these models is complex, time-consuming, and costly. In addition, most of traditional models target the majority of the prostate epithelium, whereas human prostate cancer is well known to evolve as an isolated event in only a small subset of cells. Valuable models need to simulate not only prostate cancer initiation, but also progression to advanced disease.
Here we describe a method to target a few cells in the prostate epithelium by transducing cells by viral particles. The delivery of an engineered virus to the murine prostate allows alteration of gene expression in the prostate epithelia. Virus type and quantity will hereby define the number of targeted cells for gene alteration by transducing a few cells for cancer initiation and many cells for gene therapy. Through surgery-based injection in the anterior lobe, distal from the urinary track, the tumor in this model can expand without impairing the urinary function of the animal. Furthermore, by targeting only a subset of prostate epithelial cells the technique enables clonal expansion of the tumor, and therefore mimics human tumor initiation, progression, as well as invasion through the basal membrane.
This novel technique provides a powerful prostate cancer model with improved physiological relevance. Animal suffering is limited, and since no additional breeding is required, overall animal count is reduced. At the same time, analysis of new candidate genes and pathways is accelerated, which in turn is more cost efficient.

This protocol describes a newly established method for virus delivery to the murine prostate. Using either CRISPR/Cas9 technology, gene overexpression, or Cre recombinase delivery, the technique allows orthotopic alteration of gene expression and implements a novel mouse model for prostate cancer.

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell lines or increasing its expression with overexpression cell lines. Transient and stable transfection are two methods that are often used for exogenous gene expression. Transient transfection is only useful for short-term expression, whereas stable transfection allows exogenous genes to be integrated into the host cell genome where it will be continuously expressed. As a result, stable transfection is usually employed for research into long-term genetic regulation. Here we describe a simple protocol to generate a stable cell line overexpressing tagged death receptor 3 (DR3) to explore DR3 function. We picked single clones after a retroviral infection in order to maintain the homogeneity and purity of the stable cell lines. The stable cell lines generated using this protocol render DR3-deficient HT29 cells sensitive to antimitotic drugs, thus reconstituting the apoptotic response in HT29 cells. Moreover, the FLAG tag on DR3 compensates for the unavailability of good DR3 antibody and facilitates the biochemical study of the molecular mechanism by which antimitotic agents induce apoptosis.

Establishing a stable cell line overexpressing a gene of interest to study gene function can be done by stable transfection-picking single clones after transfecting them via retroviral infection. Here we show that HT29-DR3 cell lines generated in this way elucidate the mechanisms by which death receptor 3 (DR3) contributes to antimitotics-induced apoptosis.

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...