LCA は、NDSEG ・ フェローシップ、NSF GRFP とマクガバン研究所の友人からの資金を認めています。EP は、ハリーとユーニス野原支給基金、1995 支給基金の MIT クラスと MIT 支給基金の資金を認めています。ESB は、NIH 2R44NS070453 03A1、IET ハーヴェイ賞とニューヨーク幹細胞財団・ ロバートソン賞からの資金を認めています。RD は、NIH の EY017292 からの資金提供を認めています。マイケル ・ ウィリアムズ整理、撮影前に消耗品を収集してチームに貢献しました。

注: 動物のすべてのプロシージャは NIH のガイドラインに従ってされ、マサチューセッツ研究所の技術委員会によって動物のケアに関する承認された。
 1 照明作製 <ol><li>250 μ m 径プラスチック光ファイバー 10 cm 以上必要な総照明の長さよりも長いであるのセクションをカットする鋭いはさみのペアを使用します。</li>。
	<li>22 ゲージのワイヤーストリッパーを使用してプラスチック光ファイバーの一方の端から 15-20 cm のポリエチレン ジャケットを削除します</li>。
	<li>テーブル万力クランプの繊維のストリップの端のほとんどの 3-5 cm 遠位固定します</li>。
	<li>は、一定の力で引き続けますとピンと張ったファイバーのジャケットの端を保持します。光ファイバーは、床、副に垂直に平行でなければなりません。加熱と冷却 (手順 1.5 および 1.6 以下)、繊維はそのまま直進し、ピンと張った薄めて全体繊維にこの一定のテンションを維持します</li>。
	<li>のデュアル温度熱銃 (570/1,000 ° F)、最も低い設定を使用して熱または人間の毛髪の直径約 60-100 μ m の直径に薄めてまで、繊維のストリップのセクション</li>。
	<li>は、クールな光ファイバーを許可しながら、繊維に一定のテンションを維持します。緊張感を維持するために失敗の原因をカールする繊維です</li>。
	<li>は、解剖顕微鏡の下で間伐の先端の直径を確認します。代わりに、1 つは代わりにノギスを使用可能性があります。
	<ol><li>場合繊維は十分に薄く、必要な先端の直径を達成するために必要に応じて 1.6 から 1.4 の手順を繰り返します</li>。
		<li>オプション引いて再場合マークを入れて小さな繊維の最も狭い部分で熱銃の中心ターゲット繊維の最も狭い部分は、再び熱される、場合</li>。
		<li>繊維があまりにも薄い場合やり直す</li>。
	</ol></li> <li>繊維は完全に冷却し、希望の直径を達成されている、いずれかの側の繊維の最も狭いポイントから 3 cm をピンチします。迅速で鋭い繊維の軸に沿ってプル、テーパーの先端を作成する側面を分離します</li>。
	<li>は、解剖顕微鏡の低消費電力 (例えば 4 X) の下でテーパーの先端を確認します。先端がフォークまたはカール ( 図 1 階)、繊維を破棄します</li>。
	<li>準備公開最後の 5 mm を残して、先端の終わり近くのラボ テープの部分を配置することによってテーパーの先端をエッチングします。テープは、発光の所望の長さ上のエッチングからファイバーを保護します。この先端の長さは、対象地域の霊長類の皮質の厚さに基づいて選ばれました。照明の希望の長さによって長いか短い長さを公開可能性があります。テーパーの先端に近づけたり、遠ざけたりするに、ラボのテープの端を近い移動ことができます異なるエッチング先端の長さが必要な場合です</li>。
	<li>は、親指と人差し指の間を 5 μ m シリコン カーバイド研磨シートの小さな (~ 1 インチ x 2 インチ) 広場を隠します。ラッピング シートの 2 つの側の間のファイバーの先端を置き、BB を親指と人差し指の間圧延まるで優しく小さな円運動を使用してファイバーをエッチングします。よく繊維を均等にすべての側面をエッチングに回転します。繊維のヒントが表示されます &#8220; 荒く &#8221; 非エッチング エリアは通常滑らかに表示中にエッチングされているエリアの肉眼に目にします</li>。
	<li>シートをラッピング 3 μ m アルミ酸化物を繰り返しステップ 1.11</li>。
	<li>は、エッチングの先端の反対側に照明器具の端のコネクタを貼ります。これにより、光ケーブルやレーザーに接続する照明 。
	注:このメソッドは、ガラスを固定するため、推奨される方法異なります/フェルールでシリカ光ファイバー。金属フェルールは研磨の過程で生成される金属の小さな破片としてプラスチック光ファイバー損傷することができます接着後の単位としてファイバーとフェルールを研磨、プラスチック光ファイバーより困難ですのでフラット切断繊維で自分自身を埋め込むことができます。
	<ol><li>ポリエチレン ジャケット 22 ゲージのワイヤーストリッパーを使用して照明器具の反対側の端から約 5 mm を削除します</li>。
		<li>フラット表面を滑らかにする熱いナイフで反対側の端をカットします</li>。
		<li>フラットひき続いてより良いラップと反対側の端をポーランド語シート: 5 μ m、3 μ、1 μ m、0.3 μ m.</li>
		<li>フラットを挿入反対側フェルールの端と同じ高さまで 260 μ m 内径ステンレス製フェルールにします</li>。
		<li>視覚的に反対側の端、ファイバー顕微鏡で研磨円滑かつ均等にことを確認します</li>。
		<li>フェルールから繊維を削除し、テーブルの端に垂直にフェルールを下向き繊維テープします</li>。
		<li>プラスチック エポキシ 1 mL 注射器で満たし、鈍 18 ゲージ針を注射器に接続します</li>。
		<li>は、フェルールにダウン エポキシを適用するのに針を使用します。エポキシとフェルールを完全に入力します</li>。
		<li>ファイバーをフェルールに挿入します</li>。
		<li>は、必要な場合を乾燥する前に湿った糸くずワイプで繊維の表面から任意の余分なエポキシを拭いてください。12-24 h. 後余分なエポキシを削除ことができますそれ以外の場合、</li>
		<li>校正まで優しく繊維を格納し、フェルールにダスト キャップを配置します</li>。
	</ol></li></ol> 2。照明器具の校正および品質管理 注: のキャリブレーションのためのこれらのメソッドを評価光出力が光ファイバーの先端から異なる距離に非直線性のため。通常に起因する光の偏在、&#8220; でこぼこ &#8221; または &#8220; 波状 &#8221; テーパ。
光吸収箔 ( 図 2) を使用して、積分球の上部に <ol><li>光シールドを作成するダイヤフラム 。
	注:光の反射の汚れを作成するから油の処理光肌を防ぐために箔を吸収するたびに手袋を着用します。
	<ol><li>倍 2 &#8221; 4 &#8221; 自体、2 を形成する上に箔を吸収する光の作品 &#8221; x 2 &#8221; 広場別の方法は、2 カット、&#8221; x 2 &#8221; 吸収側 1 つの光と反射面 (すなわち 1 つの光の広場。、標準的なアルミ箔の側);しかし、折り畳み式のメソッドは、次のステップで横隔膜の取り扱いの鈍いエッジを提供するため、安全です</li> <li>ラボまたは折り畳まれて非エッジをバインドする正方形のエッジに沿って電気テープを折る。これが両側を一緒に保持し、シャープなエッジからの削減に対する保護します</li>。
		<li>26 ゲージの針を使用して正方形の中心に穴をあける</li>。
		<li>積分球からキャップの大きいネジを外し、ダイヤフラムに開口部をカバーします。中心に穴を配置します。横隔膜が光吸収 1 つと 1 つの光の側面を反映して作成された場合を吸収側光と光の反射を積分球の内側に直面している側を配置します 。
		注:積分球に入るからほこりや破片を防ぐために、穴の中心を保つために、ラボのテープで積分球の外側にダイヤフラムをセキュリティで保護します</li>。
	</ol></li> <li>測定光マイクロマニピュレーターまたは固定アームと積分球を使用して 500 μ m 刻みの先端に沿って出力します 。
	注:レーザーが存在するときに、適切な波長の安全ゴーグルを着用ください。
	<ol><li>レーザーや光ファイバーの反対側の端に接続ソース、しかし、まだ出力光をトリガーされません</li>。
		<li>脳定位固定ホルダー (原石に照明を確保します。ラボ テープ rably) ホルダーの下 7-10 mm の先端と</li>。
		<li>ネジ固定の腕に固定ホルダー</li>
		<li>は、ダイヤフラムの中心の穴に照明器具の先端を合わせます。先端がダイヤフラムと同じレベルにあるとき、マイクロマニピュレーターをゼロします</li>。
		<li>に部屋のライトをオフ、積分球は 0.</li>
		<li>レーザー (または他の光源) をトリガーし、積分球を用いた出力合計の光パワーを測定します 。
		注:キャリブレーション テスト可能な最低の光出力を使用します</li>。
		<li>積分球と繰り返しステップ 2.2.6 繊維 500 μ m を下げる</li>。
		<li>続ける積分球に繊維を下げると電力光レベル オフまで 500 μ m 刻みで全光束を測定 
		注意:総光全体の先端が球に一度レベル。繊維を下げるため続行しないでください、エッチングを超えて 1-2 mm 以上長さのヒントします。積分球の底を先端に接触する場合、溶融/または積分球を台無しにする可能性があります</li>。
	</ol></li> <li>総光の直線性を確認するために積分球までどのくらいの繊維の機能が下がった出力電力をプロットすることによって均等にエッチングの繊維を確認します</li></ol>。
 3. 体内 照明
 注: これらのメソッドが表示されますここでは、ヒト以外の霊長類ではなく、プラスチック モデルを使用します。
<ol><li>25 mm 径記録室は、実験前に利益の脳領域に移植されたインプラント</li>。
	<li>は、実験前に解剖学的の磁気共鳴画像 (MRI) を実行します。商工会議所内カスタム記録グリッドを置き、グリッドの可視化と硬膜とターゲットの脳構造のレベルの決定を許可する生殖不能外科潤滑油を入力します</li>。
	<li>は、各テスト セッションの前にタワーのマイクロ ドライブを準備します。
	<ol><li>接辞ドライブの真ん中に上下斜めのヒントと 25 ゲージ ガイド チューブにクランプします。2 つのクランプを使用ガイド チューブがストレートであることを確認します。必要な場合、手動でこれらのクランプの両方移動できます 。
		注:ガイド チューブを epoxied またはクランプにはんだ付けがあります</li>。
		<li>は、同じドライブ上に上型クランプで大量の照明器具を固定します。このクランプは駆動モータに接続されています</li>。
		<li>ガイド チューブを介して大容量の照明を完全にスレッドし、過去のガイド チューブの先端照明器具の先端を拡張することを確認します 。
		注:経由で MRI ガイド チューブの先端として硬膜からターゲットの脳の領域の下端までの距離に等しい過去を拡張する照明の長さは決まります</li>。
		<li>ガイド チューブと照明 (例えば クロルヘキシジン) を消毒する消毒液に漬します</li>。
	</ol></li> <li>クリーン室の内部カスタム滅菌グリッドを置き、部屋の側面のネジであらかじめ指定された向きで固定します。ここで表示されるグリッドが 1 mm 間隔;必要に応じて、ただし、間隔をカスタマイズできます 。
	注:これはグリッドおよび解剖学的 MRI で使用される方向と同一にする必要があります</li>。
	<li>事前に決められた方向に録音室に定位のマイクロ ドライブ ホルダーをセキュリティで保護します</li>。
	<li>は、滅菌、鈍い鉗子を使用して照明器具を引いてガイド チューブから滅菌照明を撤回します。照明器具の先端は、ガイド チューブの先端の上の 5-10 の mm をする必要があります 。
	注:照明器具は、ガイド チューブとクランプの間外側弓でしょう。柔軟な照明破壊はしません</li>。
	<li>ホルダーにマイクロ ドライブを添付し、ターゲット グリッドの穴にガイド チューブを配置します</li>。
	<li>マイクロ ドライブ ステージを下げるは、ガイド チューブが硬膜のレベルを通してちょうどまで 。
	注:に応じて、電極を 2 番目のマイクロ ドライブをステージに配置、低下に別のグリッド穴することができます。この電極に潜在的なローカル フィールド照明配置を確認するための距離依存性の光アーティファクトが表示されます</li>。
	<li>と下照明器具手動で滅菌ピンセットで。
	<ol><li>、任意の抵抗がある場合は撤回照明 5 - 10 mm、待機を解決し、もう一度やり直してくださいする組織を許可する 10 分</li>。
		<li>まだ 2 番目の試みに抵抗がある、照明のヒントをガイド チューブに、低いガイド チューブ 0.25 ミリメートル、やり直してリトラクトします</li>。
		<li>何の抵抗もなくガイド管を通して照明器具スライドまで繰り返します</li>。
		<li>は、ピンと張ったまで照明を下げる 。
		注意:抵抗に対して強制的に照明を押し込まないでください。これらのケースでガイド チューブ通常浸透しているない硬膜完全に。繊維を力強く押すことそれ自体の繊維から脳に入るとおそらくヒント ( 図 1 g) を破壊することを防ぐことを曲げるになります</li>。
	</ol></li> <li>拡大光学系を設定またはレーザーにフェルール照明器具のもう一方の端を接続します</li>。
	<li>光が非ひと霊長類に表示されていないことを確認してください。
	<ol><li>ブラック アウトのシールドを使用または記録塔を完全に包含する箔を吸収光します</li>。
		<li>の光箔を吸収できたシールドの封筒ですべての光ファイバー接続を配置します</li>。
		<li>どちらかの光箔や黒の絶縁テープを吸収にすべてのパッチ ケーブルをシールドします</li>。
		<li>追加の予防措置としておとりの発光ダイオード (LED) 銀行非ひと霊長類の後ろに実験で使用される同じ光の色を配置し、2.5 Hz で Led に点滅し続ける。これは、目が闇に完全に適応するを防ぎます。このライトが点滅が行動のトリガーとしてからのリークを防ぐために役立つだろう、不注意な光漏れがあった場合</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).</li><li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass-coated+tungsten+microelectrode+enclosing+optical+fibers+for+optogenetic+exploration+in+primate+deep+brain+structures.">A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures.</a> J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+Electrical+Microstimulation+Systematically+Bias+Visuospatial+Choice+in+Primates.">Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates.</a> Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Ozden, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+coaxial+optrode+as+multifunction+write-read+probe+for+optogenetic+studies+in+non-human+primates.">A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates.</a> J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Chuong, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+inhibition+with+a+red-shifted+microbial+rhodopsin.">Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin.</a> Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+Induced+Behavioral+and+Functional+Network+Changes+in+Primates.">Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates.</a> Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior.">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li></ol>

病気および齧歯動物の生理学を研究する光遺伝学的ツールが広く使用されますが、照明の大脳ボリュームの技術的な課題は非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの使用を制限されています。おそらく小さなボリュームを照らす大きな光パワー密度 (20 W/mm2~ 100 mW/mm2 ) を使用サルの研究の先駆的な &#60; 1 mm3、および皮質4、興奮のオプシンと報...

生理機能や齧歯動物および無脊椎動物の行動を研究するミリ秒精度、光駆動型神経制御を可能にする光遺伝学的ツールが活躍しています。ただし、技術的な課題には、いる齧歯動物の脳1を超える x 数量 100 ~ 非ひと霊長類脳研究の使用が限られています。
2 つの競合する目標に対処するため設計された蛍光灯器具非ひと霊長類における光遺伝学の研究を促進する: 大量の照明と最小限の貫通ダメージ。これらの懸念の 1 つのアドレスに以前の試みは、他の高価で来ています。バンドル ファイバー照らす大きなボリュームが増加の直径と、したがって、ダメージ2,3。テーパー ガラス繊維を減らす狭くフォーカス ライトを発光表面積しますが、侵入被害 &#60; 100 μ m2 4,5。外部脳硬膜にある窓の照明が侵入被害の課題を回避大量照明を許可する可能性があります、いくつかの表面的な脳エリア6のみ使用できます。
大ボリューム ・小径照明 (図 1 a) を作成するには、プラスチック光学繊維は熱のテーパーし、コアとクラッドの先端エッチング (図 1 b, c)。狭いポイントにライトを集中する他のテーパ繊維とは異なり、エッチングは均等に大面積 (図 1 d, e) で光を広く配布するためが、先端側から脱出して光をことができます。侵入被害は浸透径に比例して、この照明は従来繊維よりもないより多くの浸透ダメージをまだそれはので &#62; 1 とより広く表面エリアと提供光発光 x 100/100 光パワー脳ファントム (1.75% の agarose) の密度 (図 1e)。彼らは彼らの発光面として等しい光パワー密度を持っているとき、モンテカルロ モデル (図 1 階) は従来ファイバーと大量の照明器具の光の広がりで違いを示しています。各照明を個別に (図 2 ab) ヒント (図 2 c) も光分布を確保するための積分球を使用して校正します。
この大量の照明器具は、動作と非ひと霊長類におけるニューロンの両方の光遺伝学的操作と検証されています。脳の任意の領域に、それぞれの動物の個々 の受容野マップに、繊維の先端の長さをカスタマイズできます。照明は、照明の長さにわたる神経録音用貫通電極と組み合わせられるかもしれない。さらに、繊維は、可視光の任意の色を運ぶことができます、ために、利用できる利用可能な光分子のいずれかと組み合わせることが。

<table><tbody><tr><td>Plastic optical fiber</td><td>Industrial fiber optics</td><td>SK-10</td><td>250 micron diameter, Super Eska line</td></tr><tr><td>Wire stripper</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 gauge</td></tr><tr><td>Vise Clamp</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Generic table mount vice clamp</td></tr><tr><td>Dual temperature heat gun</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1,000 &amp;deg;F</td></tr><tr><td>Lab marker</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR</td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>4 pack of violet color; however, tape color does not matter</td></tr><tr><td>Silicon carbide lapping sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>5 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Aluminum oxide lapping sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>3 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Aluminum oxide lapping&amp;nbsp; sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>1 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Calcined alumina lapping sheet</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>0.3 micron grit, 10 pack</td></tr><tr><td>Hot knife</td><td>Industrial fiber optics</td><td>IF370012</td><td>60 Watt, heavy duty</td></tr><tr><td>Fiber inspection scope</td><td>ThorLabs</td><td>FS201</td><td>optional</td></tr><tr><td>Stainless Steel Ferrule</td><td>Precision fiber optics</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 micron inner diameter</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed</td></tr><tr><td>Plastic epoxy</td><td>Industrial fiber optics</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge blunt needle</td><td>BD</td><td>305180</td><td>1.5 inch length</td></tr><tr><td>Lint-free wipe (KimWipe)</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>available from many vendors</td></tr><tr><td>Light absorbing foil</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Electrical tape</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Optional, may substitute other brands / models</td></tr><tr><td>26 gauge sharp needle&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>0.5 inch length</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>may substitute other brands/models</td></tr><tr><td>Steretactic arm</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>may substitute other brands/models</td></tr><tr><td>Laser safety goggles</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>must be selected based on the color of laser used, example given here</td></tr><tr><td>Laser or other light source</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>example of blue laser</td></tr><tr><td>Integrating sphere</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D</td></tr><tr><td>Ultem recording chamber</td><td>Crist instrument company</td><td>6-ICO-J0</td><td>Customized with alignment notch</td></tr><tr><td>Tower microdrive with clamps</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Guide tube</td><td>Custom</td><td>N/A</td><td>Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing</td></tr><tr><td>NAN driver system</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Custom grid design</td><td>custom</td><td>custom</td><td>plans available upon request</td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>generic stainless steel blunt forceps</td></tr><tr><td>Digital calipers</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.</td></tr><tr><td>Patch cable</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.</td></tr><tr><td>Clear plastic dust caps</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Package of 25</td></tr><tr><td>ceramic split mating sleeve</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

large volume, behaviorally-relevant illumination for optogenetics in non-human primates

このプロトコルでは、ヒト以外の霊長類の脳の光遺伝学的操作用に開発された大容量の照明について説明します。照明器具はエッチングされたヒントを変更したプラスチック光ファイバー発光面積は &#62; 100 倍、従来の繊維。大量の照明器具の構造を記述する、に加えてこのプロトコルも光の分布を確認するために使用する品質管理校正を詳細します。さらに、このプロトコルでは、挿入し、大量の照明器具を削除するためのテクニックについて説明します。浅と深い構造を点灯可能性があります。この大量の照明が、電極に物理的に結合する必要はありません、照明器具、ガラスではなくプラスチックで作られているのでそれが単に曲がる状況で伝統的な光ファイバーを破るととき。この照明は、行動関連組織ボリューム (≈ 10 mm3) 従来の光ファイバーより大きい浸透損傷なしに光を提供するため、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスを用いた行動の研究を容易にします。

ヒト以外の霊長類の大脳ボリュームの照明は行動に関連した光遺伝学的操作のためことができます。Acker さんら(2016) ハロロドプシンの赤いシフト、2 アカゲザルにおける記憶誘導性サッカード発生する前頭眼野 (FEF) の一時的な貢献を研究する顎7でこの大量の照明器具を使用します。具体的には、FEF ニューロンを顎を含むウイルスのベクトルを注入され、適用先のプ?...

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Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

最小直径と大量の光を提供するための組織貫通照明を構築するためのプロトコルが表示されます。

大ボリューム、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの行動に関連した照明

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

large-volume-behaviorally-relevant-illumination-for-optogenetics-non

Research

JoVE Journal

Behavior

8.0K ビュー.  Massachusetts Institute of Technology. 最小直径と大量の光を提供するための組織貫通照明を構築するためのプロトコルが表示されます。

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

神経科学

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

行動学

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate light-gated ion channels and pumps in neurons. While this bioluminescent optogenetics (BL-OG) approach confers a chemogenetic component to optogenetic tools, it is not limited to use in neuroscience. Rather, bioluminescence can be harnessed to activate any photosensory protein, thus enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells. A variety of luciferase-luciferin pairs can be matched with photosensory proteins requiring different wavelengths of light and light intensities.
Depending on the specific application, efficient light delivery can be achieved by using luciferase-photoreceptor fusion proteins or by simple co-transfection. Photosensory proteins based on light-dependent dimerization or conformational changes can be driven by bioluminescence to effect cellular processes from protein localization, regulation of intracellular signaling pathways to transcription. The protocol below details the experimental execution of bioluminescence activation in cells and organisms and describes the results using bioluminescence-driven recombinases and transcription factors. The protocol provides investigators with the basic procedures for carrying out bioluminescent optogenetics in vitro and in vivo. The described approaches can be further extended and individualized to a multitude of different experimental paradigms.

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence-light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small-molecule substrate, a luciferin-can be harnessed to activate photosensory proteins, thereby adding another dimension to light stimulation and enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells across temporal and spatial scales.

生物発光光遺伝学2.0:生体内および生体内で光感覚タンパク質を活性化するための生物発光の利用

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

生化学

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

へのガイド<em&gt;インビボ</emOptogenetically同定された皮質抑制性介在から&gt;シングル単位記録

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Optogenetic Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

光遺伝学機能MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

A MRI-Based Toolbox for Neurosurgical Planning in Nonhuman Primates

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using data extracted from magnetic resonance imaging (MRI). This protocol allows for the generation of 3D printed anatomically accurate physical models of the brain and skull, as well as an agarose gel model of the brain modeling some of the mechanical properties of the brain. These models can be extracted from MRI using brain extraction software for the model of the brain, and custom code for the model of the skull. The preparation protocol takes advantage of state-of-the-art 3D printing technology to make interfacing brains, skulls, and molds for gel brain models. The skull and brain models can be used to visualize brain tissue inside the skull with the addition of a craniotomy in the custom code, allowing for better preparation for surgeries directly involving the brain. The applications of these methods are designed for surgeries involved in neurological stimulation and recording as well as injection, but the versatility of the system allows for future expansion of the protocol, extraction techniques, and models to a wider scope of surgeries.

The method outlined below aims to provide a comprehensive protocol for the preparation of nonhuman primate (NHP) neurosurgery using a novel combination of three-dimensional (3D) printing methods and MRI data extraction.

非ヒト霊長類の脳神経外科計画のためのMRIベースのツールボックス

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using ...

生物工学

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we demonstrate the use of magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of optogenetic viral vectors into primary somatosensory (S1) and motor (M1) cortices of macaques to obtain efficient, widespread cortical expression of light-sensitive ion channels. Adeno-associated viral (AAV) vectors encoding the red-shifted opsin C1V1 fused to yellow fluorescent protein (EYFP) were injected into the cortex of rhesus macaques under MR-guided CED. Three months post-infusion, epifluorescent imaging confirmed large regions of optogenetic expression (&#62;130 mm2) in M1 and S1 in two macaques. Furthermore, we were able to record reliable light-evoked electrophysiology responses from the expressing areas using micro-electrocorticographic arrays. Later histological analysis and immunostaining against the reporter revealed widespread and dense optogenetic expression in M1 and S1 corresponding to the distribution indicated by epifluorescent imaging. This technique enables us to obtain expression across large areas of the cortex within a shorter period of time with minimal damage compared to the traditional techniques and can be an optimal approach for optogenetic viral delivery in large animals such as NHPs. This approach demonstrates great potential for network-level manipulation of neural circuits with cell-type specificity in animal models evolutionarily close to humans.&#160;

Here, we demonstrate magnetic resonance (MR)-guided convection enhanced delivery (CED) of viral vectors into the cortex as an efficient and simplified approach for achieving optogenetic expression across large cortical areas in the macaque brain.

オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

NHP脳神経外科計画のためのMRIからの自動3D脳と頭蓋骨のモデリング

A Neural Implant Design Toolbox for Nonhuman Primates

This paper describes an in-house method of 3D brain and skull modeling from magnetic resonance imaging (MRI) tailored for nonhuman primate (NHP) neurosurgical planning. This automated, computational software-based technique provides an efficient way of extracting brain and skull features from MRI files as opposed to traditional manual extraction techniques using imaging software. Furthermore, the procedure provides a method for visualizing the brain and craniotomized skull together for intuitive, virtual surgical planning. This generates a drastic reduction in time and resources from those required by past work, which relied on iterative 3D printing. The skull modeling process creates a footprint that is exported into modeling software to design custom-fit cranial chambers and headposts for surgical implantation. Custom-fit surgical implants minimize gaps between the implant and the skull that could introduce complications, including infection or decreased stability. By implementing these pre-surgical steps, surgical and experimental complications are reduced. These techniques can be adapted for other surgical processes, facilitating more efficient and effective experimental planning for researchers and, potentially, neurosurgeons.

著者スポットライト:NHP研究における脳神経外科計画の強化のための脳と頭蓋骨の合理化モデリング

This paper outlines automated processes for nonhuman primate neurosurgical planning based on magnetic resonance imaging (MRI) scans. These techniques use procedural steps in programming and design platforms to support customized implant design for NHPs. The validity of each component can then be confirmed using three-dimensional (3D) printed life-size anatomical models.

大ボリューム、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの行動に関連した照明

要約

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