1(電子トーン)生物発光光遺伝学は、遺伝的にコードされた光源が細胞内および細胞間の生物学的機能およびネットワークを視覚化および制御できるプラットフォーム技術である。生物発光は、光ファイバーおよび拡張された物理的光曝露による組織および細胞損傷なしに、標的細胞集団において発現されるすべての光感知ドメインに到達する。まず、凍結乾燥CTZの5ミリグラムをそれぞれの溶媒の250マイクロリットルに溶解してルシフェリンストックの調製を開始する。
ピペッティングによって壁に沿ってCTZの溶解を確実にする。バイアルを直接光から保護しながら、0.5ミリリットルの黒色微量遠心管に50マイクロリットルのアリコートを準備し、将来の使用のためにマイナス80°Cでアリコートを保管します。赤色光で照らされた層流フード内の明るいタイトな部屋で、さらにすべての操作を実行します。
単一の生物発光光刺激を行うために、細胞培養培地中のルシフェリンの作用溶液を調製し、100マイクロモルの最終濃度で細胞に添加する直前に。ルシフェリン含有培地を細胞に加え、所望の光刺激期間にわたってインキュベートする。赤色のライトをオフにします。
目が完全な暗闇に調整されるまで数秒間待った後、目で発光を監視します。写真を撮って発光を記録します。ルシフェリン含有培地を培養液と交換して光刺激を終了し、次いで培養培地で細胞を1回または2回洗浄して、実験感度に応じてすべてのルシフェリンを除去する。
細胞損失を避けるために、PDLコーティングされたディッシュに細胞をプレートし、細胞をインキュベートする。繰り返し生物発光光刺激を行うには、箱と黒いシートを用いて生細胞イメージング顕微鏡の周囲に光密な区画を作成して生細胞イメージングチャンバーを設置する。部屋の中に存在するすべての光源を覆っていることを確認してください。
摂取のための所望の溶液と廃容器につながるチャンバ出力で灌流システムをセットアップする。繰り返し刺激の数に応じて、調製した作業ルシフェリン画像化溶液を微量遠心チューブにアリコートする。トランスフェクトされた細胞を含むカバースリップをチャンバー内に配置します。
ポンプを作動させたまま、ポンプの入口チューブを吸気ビーカーから取り外します。入口チューブをルシフェリン溶液に素早く浸し、チューブ内の空気空隙を避けるために移行時間を短く保ちます。ルシフェリン溶液が取り込まれたらすぐに、導入チューブを吸気ビーカーに戻します。
細胞が露出するはずの生理学的パターンに応じて、数分から数時間の間隔で、必要な回数だけ導入管をルシフェリンに除去して浸漬することを繰り返す。その後、転写のために、または光刺激の効果が評価されるまでの期間、細胞を光で保護された環境に16〜24時間保持する。生体内で生物発光活性化を行うには、CTZバイアルをマイナス80°Cから取り出してルシフェリンを調製し、その後、光保護領域で室温まで昇温させる。
500マイクログラムのCTZを含む各バイアルに対して、ピペットを使用して250マイクロリットルの滅菌水を加え、ゴム栓をバイアルに戻す。再構成されたガラスバイアルを摂氏55度で強化した水浴中で数分間インキュベートし、粉末を完全に溶解させる。溶液を黒い微量遠心管に移し、壁をすすぎ、すべてのCTZを取得する。
必要な量の溶液を除去した後、残りの溶液を摂氏4度で保存する。同様の方法でビヒクルを準備し、再構成し、および分注した後、選択された動物のサイズおよび適用経路に必要なルシフェリンまたはビヒクルの体積を除去することによって生物発光光刺激をプリフォームする。動物にルシフェリンまたは設計どおりの車両を注射する。
特定の行動パラダイム中の所望のリコンビナーゼ活性化のために、行動試験の直前に動物を注射する。位相転写のために、動物を数日間にわたって繰り返し注射し、設計どおりに生物発光刺激動物からデータを収集します。高速光および活性調節発現系は、細胞内カルシウムイオンおよび光の増加を伴うレポーター遺伝子の転写を可能にした。
青色LEDは堅牢なレポーター蛍光をもたらし、FLuc発現はルシフェリン添加後の発光測定によって決定された。in vivoイメージングシステムでは、LEDとCTZの両方がFLuc発現を堅牢に増加させたが、転写因子成分のみの存在は、おそらく自発的なタンパク質分解のために、かなりのバックグラウンドシグナルをもたらした。NanoLucは、CRY/CIB二量体化および感光性転写因子EL222による光原性調節に使用された。
HEK-293細胞へのhCTZの添加および15分後の除去によって誘導された生物発光は、CRY/CIBおよびEL222に対するLED曝露の20分よりも効率的であった。hCTZを同時トランスフェクトした場合、両系間で転写有効性に有意差は認められなかったが、CRY/CIBの融合タンパク質はEL222よりも効率的であった。CRY/CIBは、hCTZ濃度とは無関係にEL222と比較して一貫して高いバックグラウンドレベルを示した。
VVD LOVタンパク質iCreVに基づく感光性スプリットCreリコンビナーゼの生物発光を試験した。CTZアプリケーションの結果、CTZの存在はバックグラウンドにわたって発現を強力に増加させ、LEDアプリケーションに類似していることが明らかになりました。生物発光を利用して鉄の動く光受容体だけでなく、光感覚ドメインを活性化し、光刺激に別の次元を加え、時間的および空間的スケールにわたって細胞機能の操作を拡大します。
生物発光光遺伝学は、細胞およびモデル生物に適用されている。これらのプロトコールは、インビトロおよびインビボで広範囲の指向性仮説を試験するようにカスタマイズすることができる。
