この作品は、薬物乱用研究所（NIDA）助成R01 DA24040（DCC）、コロラド大学の革新的なシード·グラント（DCC）、およびNIDA訓練助成T32 DA017637（MVB）によってサポートされていました。

1。ウイルス保管と準備<ol><li>げっ歯類の脳にオプシン遺伝子を送達するための複製不能AAVベクターの使用は、生物学的安全性レベル1（BSL-1）のために承認され、米国政府の出版物に記載された正しい保護と取り扱い手順を必要とし、微生物学および生物医学研究所でバイオセーフティさ、で入手（AT疾病管理のウェブサイトのためのセンター<a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ）。 </li><li> -80°Cの冷凍庫内でクラスIIバイオセーフティーキャビネットおよびストア内の小さな作業アリコートに、製造業者のバイアルから凍結融解の繰り返し、ピペットウイルスを回避するためである。 </li><li>定位注射の前に、分量を氷上で解凍した後、簡単にベンチトップ遠心機でスピンダウンできる。 </li><li>ゆっくりシリコーン又は鉱油少量のハミルトンガラスシリンジと針を埋め戻す。目に見える気泡がシリンジバレルに存在しないことを確認してください。マイクロインジェクターポンプ内に注射器を挿入し、垂直定位アーム（ すなわち定位マニピュレータ）に直接ポンプを取り付けます。 </li><li>針の先端がウイルスアリコートチューブの底に触れるまで定位腕を下げます。ウイルスの所望の容量（1μL注入用の1.5μl）を撤回する微量注入ポンプ用のコントローラを使用してください。 </li><li>ウイルスと接触するすべての材料および表面は、塩素系漂白剤（10％）などの消毒剤で除染する必要があります。 </li></ol> 2。手術やウイルス注入<ol><li>カクテル、キシラジン（10 mg / kgを、IPラット） - ;ケタミン（125 mg / kgを、IPラット）で動物を麻酔。麻酔の有効性を評価するために、つま先のピンチに反射反応をチェックし、必要に応じてケタミンの追加投与を与える。標準無菌手術法を使用して、定位固定装置（デビッドKopfのINに動物を配置トゥルメント）。 </li><li>小さな外​​科的ハサミやメスで動物の頭蓋骨の上に皮膚を通って正中切開を行います。優しく結合組織を分離し、小さな骨のスクレーパーで頭蓋骨の上部を清掃してください。 </li><li>動物の頭がレベルブレグマとラムダのためのz座標が等しいようなものであることを確認します。このような定位座標定位座標 （キース·B·J·フランクリンやジョージPaxinos、アカデミックプレス中 （ジョージPaxinosとチャールズ·ワトソン、アカデミック·プレス、2007）またはマウス脳におけるラット脳脳アトラスから、対象の脳領域の定位座標を決定、2007）。外科ペンで注射の意図された部位をマーク。 </li><li>慎重に薄い手持ちドリルを用いて標的領域の上の頭蓋骨およびドリルビットは、頭蓋骨の底部に到達すると停止する。極細ピンセットを使用して、硬膜を露出させるために薄くなった骨を除去。 </li><li>ターゲット上に注射針を配置しているそれは硬膜に触れ、z座標の計算にこのポイントを使用するまで、針を下ろします。適切なz位置に到達するまで非常にゆっくりと脳に注射針を下げる。このプロトコルでは、内側前頭前皮質の縁前方の領域または背側海馬台ブレグマ（-6.0ミリメートル前方（ブレグマ2.7ミリメートルの前方には、正中線、および硬膜から-2.2ミリメートル、横0.5ミリメートル、±）、横3.0ミリメートルは±正中線、および硬膜から-2.0ミリメートル）に、成人のSprague Dawley雄ラット（約275グラム）で対象としています。 </li><li> 0.1μL/分の速度でウイルスを注入する。注入が完了した後、脳の表面へのウイルスの逆流を避けるために針を引き抜く前に10分待つ。 </li><li>肌を密封し、傷口に抗生物質を適用するために取り付けられた針で縫い縫合糸を使用してください。 </li><li> AAVベクターからのChR2およびNpHR機能発現の時間経過は、実験計画やウイルス力価に応じて異なります。この実験のために、 インビボ </eM&gt;記録は18〜21日後に注入を実施した。 </li></ol> 3。光配送およびChR2をまたはNpHR発現ニューロンのin vivoでの記録では <ol><li>スーパー接着剤を用いてガラスキャピラリーチューブ（フィッシャー·サイエンティフィック）にタングステン電極（〜1〜1.5MΩ、マイクロプローブ）を取り付けます。 </li><li>エタノールでマルチモード光ファイバの裸の終わり（直径200μmコア、ソーラボ）とクリーンファイバーの先端を露出させ、ファイバストリッパ（ソーラボ）を使用します。非常に軽く、くさび形のダイヤモンドナイフ（ソーラボ）でファイバ先端を獲得し、慎重に過剰繊維（細いピンセットで）を削除する。繊維はスコアを簡単に切断する必要があります。 </li><li> 200 mWの単一のダイオードレーザー（の出力ポート上のPCのコネクタに、ファイバのFc端を接続<a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a>所望の波長を持つ）。レーザーで作業するときに、適切な保護メガネを常に着用していることを確認します。 </li><li> Lを測定光パワーメータ（用いた光ファイバの先端のASER強度<a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">をwww.Lumiphy.com</a> ）。 in vivoでの記録のために、20〜100ミリワット/ 平方ミリメートルほど小さな光強度が確実に神経活動のそれぞれにChR2またはNpHR媒介活性化やサイレンを呼び起こすことができます。 </li><li>キャピラリーチューブに光ファイバを挿入します。約500ミクロンのタングステン電極の先端の上にファイバ先端を置き、電極と繊維がまっすぐになるように先端付近のいくつかのポイントで2回細い縫合糸を結ぶ。電極の先端と最も近い結び目の間の距離は、対象領域への挿入のために十分な長さであることを確認してください。 </li><li>ステップ2.1および上記の2.2のような動物を準備します。オプトロード（位置決めするための頭蓋骨に新しいクリーン小さな窓を作るためのガイドとして、最初の開頭術を使用<a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.comを</a> ）。 D上の小さな切開を作る細い針を使用してURA。 </li><li>慎重にマイクロマニピュレーター（ナリシゲ）を使用して形質導入した領域に頭蓋骨の窓から、脳にオプトロードを下げる。その後、光応答性細胞の出現まで、10から50ミクロンのステップでゆっくりとオプトロードを進める。 </li><li>カスタム·ソフトウェア·ユーザー·インターフェース（NeuroLuxプロ<a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a>のLabVIEW（ナショナルインスツルメンツ）で書かれた）は、単一のダイオードレーザを制御し、継続的な神経活動を可視化し、記録するために使用される。記録された信号をろ過ExAmp-20K（Kation科学）アンプ、バンドパス（0.3から8 kHzの）、およびデジタルボード（のNI USB-6009）ナショナルインスツルメンツのアナログで撮影している。 NeuroLux Proユーザー·インタフェースは、アナログ入力（神経細胞およびTTL信号用の2つのチャネルを選択します）とデジタル出力を選択することができます。ユーザは、サンプリングレート（20kHz）の、ベースライン期間（プリ発光）、およびポスト光期間を定義することができる。ユーザーは、TTLレーザーを定義することができstimulatiパルス幅、周波数、および刺激期間（周波数は20 Hzおよび刺激期間は500ミリ秒である場合には、定義されたパルス幅のレーザパルス10が供給される）上に。また、ユーザは、連続光の配信（ 例えば 、 図1）を選択することができます。繰り返し記録のために、ユーザは、パルス列の数と列の間の間隔を定義することができる。データは、またはディスクに記録せずに取得することができます。 </li><li>記録後、動物をケタミン/キシラジンのカクテルで麻酔し、経オプトロードの配置およびオプシンの発現を確認するために、生理食塩水とパラホルムアルデヒド（4％）で灌流した。 </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

技術の広い配列は、げっ歯類での個別の脳領域に微生物オプシンの遺伝子を遺伝的に標的とするための利用可能です。ウイルス遺伝子送達は、細胞型特異性でのChR2およびNpHR表現を仲介するため、比較的安価で迅速なアプローチを提供します。 AAVベクター系は、貯蔵中に安定なままで高い生産力価、病原性の欠如、および長期的な遺伝子発現10を産生するその能力にoptogenetic実験に使用するための共通の選択である。細胞型特異的プロモーターとオプシン構築物の多くは、ペンシルバニア大学（などのベクター中核施設からのAAV血清型の様々な商業的に入手可能である<a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ）または大学チャペルヒル校、ノースカロライナ（ <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ）。 AAV技術の欠点の1つである細胞特異的ターゲッティングのために使用することができる導入遺伝子カセットのサイズに制限を置く限られたパッケージング能力（〜4.7キロバイト）。代替として、より大きなパッケージング能力を有するレンチウイルスベクターは、より大きなプロモーター配列の制御下に標的化オプシンを収容することができる。 オプトロードの使用は、時間的に正確な光の送達と組み合わせて、電気生理学的信号の確実な検出を可能にする。しかしながら、上述したように、十分な注意は、その構築に必要とされる。切断された光ファイバは壊れやすいので、きつく縫合糸を接続すると、繊維が破損する恐れがあります。送られる光の電極と品質のインピーダンスが低下しますので、オプトロードは、複数の記録に使用することができるにもかかわらず、電極および光ファイバを挿入する前に洗浄（または手動で光ファイバ裸の終了などの場合切断される）する必要があります繰り返し使用した。 エレメントの間にctrophysiologicalレコーディングにはオプトロードをゆっくり前進することが重要です。 （：125ミクロン、光ファイバのコア：タングステン電極を200μm）、ここで使用されるオプトロードは、約350ミクロンの厚さを有しており、すぐにそれを低下させることが脳組織の動きにつながる可能性があります。光誘起アーティファクトは、特定の記録と光配信のセットアップ11月12日であると考えている可能性があります。我々は我々の実験条件では光によって誘発されるアーティファクトを発見したが、形質導入脳領域外の録音は、潜在的に光のアーティファクトのコントロールとして使用することができます。記録プロセス中の別の考慮事項は、特に長い持続時間記録のために、またはChR2をNpHR発現ニューロンの変化を観察するために必要な光強度である。強力なレーザー強度と長いレーザー照射は組織損傷および/ ​​または12月13日以降のお届け光に減少した応答をもたらす可能性があります。行動実験のためのコントロールウイルスベクターを使用することがeliminatinに必要ですグラムの繊維から配信熱による影響。市販のoptogenetic構築物の多くはオプシン遺伝子配列が除去された相補的な制御構造が存在する。 それは、ChR2を、特定の実験の質問14〜15により適しているであろう他のサイレンオプシンと一緒に開発されており、改善された特性と動態変異体設計に留意すべきである。例えば、「ケタ」と呼ば標的突然変異誘発を介して確立新しいChR2を変異体は、元のChR2 14のそれより上（少なくとも200ヘルツまで）の周波数で高音質の神経スパイクを駆動することができます。 in vivoでの光伝達および神経細胞応答の同時録画の組み合わせは、遺伝的に標的とする細胞集団とそれに対応する時間がロックされた行動のイベントでパターン化された活動との因果関係を確立する上で重要なステップです。手続きおよびHAここで概説rdwareはげっ歯類では、生体内のヘッド固定記録のために光遺伝学を実装するための簡単な方法を提供する。

一時的に正確な方法で神経回路内の特定の細胞型を有効にするか沈黙させる能力は、神経回路が感情と認知の基礎となる様々なタイプの情報を処理する方法を理解するために重要です。そのまま神経活動上の実験制御が用意されていませんloss-/gain-of-functionツール（ 例えば 、電気刺激、薬理学的調節、病変）を採用したか、時間的または空間的な規模で、神経細胞の特定の集団を制御するために、選択的に必要。直接これらの技術的な課題に対応する、遺伝的にコード化可能感光性ツールの開発とアプリケーションは、明確に定義された行動のイベント中に選択した細胞型の電気的活動を制御する神経科学者を可能にしました。これらの感光性タンパク質の多くはhalorhodop、光依存性カチオンチャネル、チャネルロドプシン2（ChR2を）1、および光駆動塩化ポンプで、微生物由来のものである広く使用されている罪（NpHR）2,3、。 光遺伝学の主要な利点は、不均一な脳領域および技術における遺伝的に標的特異的細胞集団への能力は、正常モデル生物（ヒト以外の霊長類の無脊椎動物）4-6の数に適用されている。多くのoptogeneticトランスジェニック動物は、しかしトランスジェニック系統を確立することは、労働集約的でコスト法外ことができ、生成され、7,8、市販されているされています。ここでは、組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いてラットの縁前方の皮質と背側海馬台におけるCaMKIIαプロモーター下にChR2およびNpHR遺伝子の、ウイルス媒介性送達するためのプロトコルを記述します。前脳内では、CaMKIIα式はグルタミン酸作動錐体ニューロン9に排他的である。 AAVは、一般的に、その相対的な生産および病原性の欠如のしやすさだけでなく、基礎研究のために使用される強力かつpersiこれらのベクター10で達成されたステントの導入遺伝子の発現。さらに私たちは、麻酔をかけた頭を固定したラットの同時光伝達と記録するための手順やハードウェアの概要を説明します。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Optogenetic方法が種の幅広い行動の多様なセットの基礎となる神経回路の活動を解明するための強力なツールとして浮上している。微生物起源のOptogeneticツールは、行動関連のタイムスケール上で（ 例えば 、チャネルロドプシン2、ChR2を）または沈黙（ 例えば 、ハロロドプシン、NpHR）神経活動ingenetically定義セル型を活性化することができる感光性膜タンパク質で構成されています。まず、背側海馬台とラットの前頭前野の縁前方の領域へのChR2およびNpHR導入遺伝子のアデノ随伴ウイルス媒介送達のための簡単な方法を示しています。 ChR2をとNpHRが遺伝的に標的化可能であるため、我々は神経細胞の特定の集団高い時間精度で異質な組織に埋め込 ​​まれて（ つまり 、錐体ニューロン）の電気的活動を制御するには、この技術の使用を記載している。我々は、ここにカスタムソフトウェアをハードウェアについて説明しますユーザー·インターフェース、およびin vivoでの準備、麻酔中の形質導入錐体細胞からの同時光配送および電気的記録を可能に手続き。これらの光応答ツールは、情報処理や行動への異なる細胞型の寄与原因を特定するための機会を提供する。

図1は、神経活動の同時記録に用いられる光パルスパラメータ（ すなわち、パルス周波数、パルス幅、刺激期間）を制御するカスタマイズされたソフトウェアLabVIEW環境で開発され（プロNeuroLux）（ナショナルインスツルメンツ）のスクリーンショットを示す。ソフトウェアプログラムは、単一のダイオードレーザを制御するためのTTLパルスを生成するデジタル取得装置に指令信号を送信する。さらに、ソフトウェアプログラムが表示され、保存する記録し、神経活動や配信TTL信号。これらの信号は、定義されたサンプリング·レート（ 例えば 、20 kHzの）で取得装置によってデジタル化される。記録された信号は、バイナリファイル内の2次元倍精度配列として保存されます。 図2は、光ファイバに接続されたタングステン電極で構成されるカスタムオプトロードを示しています。光ファイバは3で細い縫合糸を使用し、電極に固定されているポイント。必要に応じて、スーパー接着剤は、それらを接着するために使用することができる。しかし、電極は光ファイバを通る光透過率は、繰り返しの使用で劣化しますし、脳内にあらゆる挿入で切断し、洗浄または交換する必要があり、何回か再利用することができるがあるため、電極に光ファイバを固定永久に避ける。 実際にChR2およびNpHR式を示す強化黄色蛍光タンパク質の図3を示して蛍光画像の左パネル、。これらの写真は、ラット背側海馬台（ 図3A）と縁前方の皮質においてChR2を発現（ 図3B）の代表NpHR発現を示す。ウイルス発現（ 例えば 、いくつかの蛍光が歯状回（左図3A）で観察された）背側海馬台と縁前方の皮質に主に限定されていた。電極（細いトラック、矢じり）と光ファイバ（太いトラック、矢印）のトラックもまた観察された。 図4のS = &quot;jove_content&quot;&gt;左側のパネルには、ChR2をラット縁前方の皮質で、時間的に正確なスパイクを誘導したことを示している。 図4（a）は 、ラットの縁前方のに対して10ミリ青色光パルスの20 Hzの配信を受けてChR2をトリガ型活動電位のトレース例である皮質。ラスタープロット（ 図4B）は、6つの代表的神経細胞におけるChR2を誘導活性化を示している。記録されたすべてのニューロンは完璧な忠実度で光誘発スパイクを示した。 ChR2を、NpHRとは対照的に、迅速かつ可逆的にラットの縁前方の皮質（ 図4の右パネル）の生体内で自発的な活動を沈黙。 図4Cは、下にNpHRを表現縁前方の皮質の連続532 nmの照明（10秒）ことを示す一例トレースですCaMKllαプロモーターは、生体内で自発的な単一ユニット活動を排除します。縁前方の錐体細胞活性の完全なサイレンがタイムロック10秒連続光の配信であることに注意してください。低いERラスタプロット（ 図4D）6代表ニューロンにおけるNpHR誘導サイレンシングを示しています。両方のin vivoでの記録は、微生物のオプシン遺伝子のAAV媒介性送達は18〜21日前までに発生した大人のSDラットから得られたものの典型的なものである。 図5は、ラット縁前方の錐体ニューロンの反復ChR2を刺激した結果を示している。青色の光パルス（10ミリ秒）を5秒（100パルスの合計）が20 Hzで配信されました。光誘発スパイクの電圧トレースを繰り返し（61回繰り返し合計）2時間の記録セッション中に2分毎に取得した。この反復刺激プロトコルを使用した場合であっても、ChR2を光送達に応答して安定的かつ強固なスパイクを誘発した。 図6と図7は、NpHR誘発の光阻害とラットsubicularニューロン活動のChR2を主導型の光活性化の結果を示す。縁前方の皮質の場合のように、NpHRおよびChR2ををすることができました光誘起時間ロック阻害および再現性オプシン形質導入subicularニューロンの活性化を媒介する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> 図1。同時光配送および電気生理学的記録のためのNeuroLux Proソフトウェア·インターフェースのスクリーンショット 。写真のトレースは連続532 nmの光配信の10秒に対応してラット縁前方の錐体細胞の自発活動のNpHR誘導サイレンシングを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> 図2。カスタムオプトロードのハイパワーイメージ 。光ファイバは、ガラス毛細管タングステン電極に取り付けられ、縫合糸を用いて電極に固定に挿入される。 betw中心間距離EEN電極先端とファイバーの先端は約500μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> 図3。ウイルス発現およびオプトロードの配置 。 （左）写真は、代表背側海馬台におけるNpHR式（A）と縁前方の皮質（B）中のChR2の発現を示す。各写真が撮影された場所を表す（右）図。各写真に写っている矢印と矢印は、タングステン電極の位置と光ファイバを示し、それぞれ。サブ：海馬台、DG：歯状回、PL：縁前方の皮質<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> 図4。にChR2またはNpHR形質導入されたラットprelimbからのin vivo電気生理学的記録IC皮質。 （A）青（473 nm）の光パルス（10ミリ秒、青いバー）の20 Hzの配信を受けてChR2をトリガ型活動電位の例跡。 （B）6代表ニューロンにおいてChR2を誘発されるスパイクを示すラスタープロット。各単位は、活性点としてプロットされる。 （C）連続緑色（532 nm）の光照射（10秒、緑色のバー）の間の自発的な活動のNpHR誘発の抑制の例跡。 （D）6代表ニューロンにおけるNpHR誘導サイレンシングを示すラスタープロット。各ユニットの活動は、ドットとしてプロットされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> 図5。 in vivoでのラットの縁前方の錐体ニューロンの繰り返し20 HzのChR2を主導型のスパイク 。光誘発スパイクの（A）の電圧トレース録音の開始後の時点0、30、60、90、120分で取得した。 （B）全61回の繰り返し（2分試行間の間隔、120分計）光誘起活性化を示すラスタープロット。各ユニットの活動は、ドットとしてプロットされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> 図6。NpHRを形質導入したラット背側海馬台からのin vivo電気生理学的記録 。 （A）NpHRを表現する背側海馬台の10秒連続532 nmの照明（緑のバー）が自発的活動を排除することを示す例トレース。 （B）上記のトレースから記録された2つのユニットの平均波形。振幅閾値は、2つの別個のニューロンを同定するために使用した。 （C）5の繰り返しを示すラスタープロットこれらのユニットのNpHR誘導サイレンシングのS。各単位は、活性点としてプロットされる。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> 図7。 in vivoでのラット後subicularニューロンの繰り返し20 HzのCR2駆動型スパイク 。光誘発スパイクの（A）の電圧トレースは、時点0、30、60、90、録画の開始後120分で取得しました。挿入図：このセルの典型的なバースト活動。 （B）全61回の繰り返し（2分試行間の間隔、120分計）光誘起活性化を示すラスタープロット。各ユニットの活動は、ドットとしてプロットされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。

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A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K ビュー.  University of Colorado Boulder. 遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。 

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

神経科学

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.