Name: megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

著者は、(プロジェクト助成 1012409 BHC にリンク) オーストラリア健康と医学研究評議会のサポートを認めます。

このプロトコルは南東シドニー人間研究倫理委員会で承認され、大学のニュー ・ サウス ・ ウェールズの人間研究倫理委員会によって批准されました。健康なドナーから得られる臍帯血によって、シドニーの臍帯血バンク (シドニー, ニューサウス ウェールズ州, オーストラリア) が提供されました。約 100 mL のボリュームは、この手順で使用されました。
メモ: クラス II バイオ セーフティ キャビネットの無菌技術を使用であります。70% エタノールで臍帯血バッグの外側を消毒します。この手順 (はさみ、ピンセット) 滅菌器具を使用します。
1. 臍帯血細胞調製と CD34 の単離細胞の+
<ol>
	<li>滅菌分離バッファー (SB) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で、pH 7.2, と含まれている 0.5% のウシの血清アルブミンと 2 mM EDTA を準備します。</li>
	<li>(血液の 10 mL あたり 1 つの管が必要) 50 mL コニカル チューブに SB の 10 mL を分注します。10 mL のシリンジにマウントされている G18 鈍針を使用して、バッグから 10 ミリリットルの血液を描画し、SB の 10 mL を含む 50 mL チューブに分注します。</li>
	<li>2 つの層を作成する、希釈血液の入ったチューブの底部に 15 mL のリンパ球分離培 (材料の表を参照) を追加します。 注: は、異なる層の混合を避けるために管の下でゆっくりとメディアを調剤します。</li>
	<li>区切りなしとアクセラレータなし室温 (RT) で 30 分間 1,200 × g でチューブを遠心します。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用して新しい 50 mL チューブに単核細胞 (各チューブから約 5-10 mL) を格納筒の中心に近い層を転送します。各容量 50 mL のチューブに SB を追加します。</li>
	<li>RT。 破棄で 10 分の 400 × g で遠心上清。</li>
	<li>浮遊細胞 SB. コンバインの 5-10 mL のパスツール ピペットで注意深く細胞ペレットを再懸濁します、SB にて 50 mL にボリュームをもたらします。</li>
	<li>トリパン ブルー染色および診断を使用して、または自動のセルを数える細胞カウンター (材料の表を参照してください)。CD34 のパーセンテージを決定+のセルをサンプルでは、2.5 × 10 を再懸濁します5セル SB と染色の 100 μ L で 4 ° C で 15-30 分の抗 CD34 PE 抗体の 10 μ L を追加することによってフローサイトメトリー (図 1 a) によって分析します。</li>
	<li>4 ° C で 10 分間 400 × g で遠心管上清を捨てます。 注: すぐに必要でなければ、単核細胞はこの段階で冷凍することができます。</li>
	<li>SB の 300 μ L 108細胞/細胞を再懸濁します。FcR はヒト IgG の 100 μ L を追加 (ブロッキング試薬、材料表を参照) と 10 の8セルあたり CD34 磁気ビーズの 100 μ L。穏やかに混合し、, 4 ° C、30-40 分で。 メモ: 単一細胞懸濁液は必要です (必要に応じて、細胞を通過も 30 μ m フィルター試薬を追加する前に)。記載されている以下の 10 の8セルの試薬ボリュームを使用します。以上 10 の8セル試薬 (SB、ブロッキング、および、CD34 磁気ビーズ) をそれに応じてスケール アップします。</li>
	<li>マグネット ホルダーに LS 列を配置し SB. 破棄の 3 mL 洗浄廃液、潜伏期間中に LS 分離カラムを準備します。 注意: LS 分離カラムは最大 2 × 10 の8セルの総数をロードできます。小さくより大きい列があります。</li>
	<li>セルの混合物に SB の 5-10 mL を追加し、400 × g で 10 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>SB の 1.5 mL の細胞を再懸濁します、LS 列に細胞懸濁液 (1.5 mL) を読み込みます。15 mL コレクション チューブ (負の分数 #1) のラベルのないセルを含む流れを収集します。ドレインし、SB の 1.5 mL でコラムを洗浄液ができます。</li>
	<li>(3 mL) を通じて収集した流れを列に読み込むし、同じ 15 mL コレクション チューブ (負の分数 #1) の流れを収集します。SB の 3 mL で 3 回 LS 列を洗います。 注: 必要な場合、負の分数 (12 mL) でセルと汚されることができる抗 CD34 抗体 CD34 のキャプチャを確認するために+ LS 列による細胞します。</li>
	<li>磁選機から列を削除し、SB の 2 mL で新しい 15 mL チューブに注射器のプランジャーをゆっくりと細胞をフラッシュします。</li>
	<li>列に戻って戻って磁気分離装置と負荷セルの 2 mL に列を配置します。流れを収集し、2 ml の SB を洗います。これは、負の分数 #2 (4 mL) です。</li>
	<li>磁気分離装置から LS 列を削除し、CD34 を収集するためにシリンジのプランジャーで着実に、しっかりと SB. フラッシュ セルの 2 mL を追加+細胞画分。トリパン ブルー染色、検定または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>4 ° C で 15 分間 400 × g で肯定的な分画遠心分離機管上清を捨てます。Cd34 陽性の血清自由な媒体の細胞を再懸濁します+細胞 (SFM、材料表を参照してください)。 注: すぐに必要でなければ、セルを固定できる液体窒素でこの段階で。</li>
</ol>
2. 純度チェック分離 cd34 陽性細胞の+
<ol>
	<li>2 x 104 10 μ L 抗 CD34 PE 抗体と 4 ° C (アイソタイプ コントロールのために個別のチューブ使用) で 15 分の 20 μ L 抗 CD45 PerCP 抗体陽性分画細胞を染色 (図 1 b)。</li>
	<li>洗浄する SB の 1 mL を追加します。400 × g で 10 分間の遠心分離機の SB の 200 μ L にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる解析を行い、ゲートの残骸 (図 1 b) を除外する生きているセルの人口。PE、PerCP アイソタイプ コントロール (図 1 b) を使って PE、PerCP の肯定的な人口のためにゲートを設定および cd34 陽性の割合を決定する+/CD45+細胞。</li>
</ol>
3. 巨核球分化
<ol>
	<li>シード 5 × 105セル/mL cd34 陽性細胞 12 ウェル プレートのウェルあたり 50 ng/mL の組換え人間トロンボポエチン (rhTPO) を添加した SFM の 2 mL の+ 。37 ° c、5% CO2加湿雰囲気の中で細胞を孵化させなさい。分析のために必要である前に、細胞が合流、セルを収穫し、新鮮なメディアと rhTPO の複数の井戸に分割します。 注: 2 つまたは 3 つの井戸は、異なる時点 (例えば7、9、および 10 日間) で分化を監視するために特に準備されるべき。</li>
	<li>他の井戸のセルを妨げないで分化を監視するために脇の井戸から細胞を採取します。</li>
	<li>20 μ L 抗アスピリン/CD41 FITC 抗体で染色細胞と 100 μ L の最終巻で 10 μ L 抗 GPIX/CD42a Alexa Fluor 647 抗体コントロール設定はそれぞれアイソタイプ コントロール抗体を用いた管します。4 ° C で 15-30 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄する SB の 1 mL を追加します。</li></ol>400 × g で 10 分間破棄上澄みで遠心し、フローサイトメトリーによる SB. 分析の 200-300 μ L でペレットを再懸濁します。
	<li>各 fluorophore の FITC と Alexa 小麦粉 647 の肯定的な人口のためのゲートを設定するアイソタイプ コントロールを分析します。CD41 の割合を判断する染色細胞サンプルの分析+/CD42a+ダブル陽性細胞、成熟した MK (図 1) を表わす。</li>
	<li>可視化セルの表面マーカーは、3.3 で説明したように細胞を染色します。<ol>
		<li>洗浄する SB の 1 mL を追加します。400 × g で 10 分間遠心分離が 100 でペレットを再懸濁します SB と 30 s. 空気乾燥、メタノールで浸ることによってスライドの 5 分修正セル 1,000 x g でスライド ガラス上にスピンの μ L を追加 DAPI を含むメディアのマウントの 20 μ L (材料の表を参照)、、coverslip でカバーし、蛍光顕微鏡 (図 2 a) を使って視覚化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>細胞内抗原の可視化は、PBS のセルを再懸濁します、室温で 15 分間パラホルムアルデヒド (最終濃度が 1%) で修正します。セルを permeabilize トリトン X100 (0.1%) を追加し、PBS/0.1% トリトン X100 2 mL を 15 分洗浄セル間インキュベートします。PBS/0.1% トリトン X 100 の 100 μ L で再懸濁します抗 vWf や抗 CD62p 抗体 (希釈 1: 200) 追加して、室温で 30 分間インキュベートします。<ol>
		<li>2 mL PBS/0.1% トリトン X100 で洗って 10 分 400 × g で遠心分離機、同じバッファーの 100 μ L で再懸濁し、抗マウス IgG Alexa 594 と抗うさぎ IgG アレクサ 488 (1: 100) を追加します。室温で 30 分間インキュベート、2 mL PBS/0.1% トリトン X100 で洗って、同じバッファーの 100 μ L で再懸濁します、CD42b APC アンチの 20 μ L を追加します。3.6.1 の手順で説明するようにスライド ガラスに細胞をスピンし、3.6.1 の手順で説明するよう、顕微鏡可視化のサンプルを準備します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>倍数性決定のため日 12 または 13 分化細胞を収穫します。洗浄する SB の 1 mL を追加します。10 分の 100 μ L の最終巻に 20 μ L 抗アスピリン/CD41 FITC 抗体染色 400 × g で遠心 4 の ° c で 30 分間加温。<ol>
		<li>SB の 1 mL で 1 回洗浄し、低張性クエン酸バッファー (1.25 mM クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム 2.5 mM、3.5 mM ブドウ糖) 含む 20 μ g/ml propidium ヨウ化物及び 0.05% の 300 μ L でペレットを再懸濁しますトリトン X 100。光から保護 4 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>最終濃度 20 μ G/ml に RNase を追加し、光から保護 4 ° C で 30 分間インキュベートします。CD41 FITC+の人口 (図 2) の 30,000 に 50,000 イベントを収集して、フローサイトメトリーによる propidium ヨウ化物の強度を決定します。</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet カウント、血小板の列挙、および血小板の活性化
<ol>
	<li>1 × 104細胞/ウェル 50 ng/mL rhTPO を添加した新鮮な SFM の 200 μ L で 48 ウェル プレートでの日 8 または 9 の分化と種 (ステップ 3.1) から細胞を採取します。37 ° C、5% で 5 日間文化 CO2. 注: 定量用、種子は 3 通の井戸します。この低密度は可視化に必要な文化の 2 日後に表示される proplatelet 担 MK. Proplatelets 通常のカウント開始。ピークは、4 日から 5 日間です。</li>
	<li>10 X、20 X 目標を用いた倒立顕微鏡上全体の井戸の proplatelet ベアリング MK の数をカウントします。 注: 温水 (37 ° C) 顕微鏡のステージは、proplatelet 拡張子の収縮を引き起こす長時間室温で細胞を維持するので望ましい。Proplatelets は、MK の体から長い拡張子として観察されます。各 MK proplatelet いくつかの突起があります。Proplatelets を開発し、MK の本体サイズが小さくなります。</li>
	<li>細胞を収穫し、室温で 10 分間 400 × g で遠心分離機します。3.3 と 3.4 の手順で説明するように 20 μ L 抗ひと CD41 FITC 抗体で細胞を染色します。Proplatelet ベアリング MK (pbMK) のパーセンテージを計算: pbMK (%) = [(Proplatelet ベアリング MKs よく/)/(総 CD41+細胞/ウェル)] x 100</li>
	<li>培養液中に放出される血小板をカウントするには、優しくパスツール ピペットで細胞をミックスし、14 または 15 文化の日で 100 μ L を収集します。<ol>
		<li>4 ° C で 20-30 分の 20 μ L 抗ひと CD41 FITC 抗体で染色します。それぞれのアイソタイプ コントロール抗体を用いた制御管を設定します。</li>
		<li>SB の 150 μ L とビーズを数えるの 50 μ L を追加します。</li>
		<li>フローサイトメトリーによる解析、FSC と SSC を対数スケールを設定します。血小板豊富な血しょうから使用通常ひと血小板は、セクション 4.4.1 血小板 (図 3 a) のゲートを設定するの説明に従って CD41 FITC と汚れます。</li>
		<li>フローサイトメトリーによるビーズを数えるとステンド グラスの血小板を分析します。SSC 散布図 (図 3 a) と FSC を用いたビーズを数える 1,000 イベントを収集します。CD41 FITC ポジティブなイベント (図 3 b) 数式を使用してに基づく血小板の数を計算します。 Μ L あたり血小板 = [(CD41 FITC 肯定的なイベントの番号)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/ボリュームのサンプル)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血小板の活性化を分析するには、優しくパスツール ピペットで細胞をミックスし、14 または 15 文化の日で 100 μ L を収集します。細胞のペレットに 5 分間、200 x g でタイロード バッファー (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、 0.2 mM Na2HPO4、12 mM NaHCO3、5.5 mM D-グルコース、pH 6.5) および遠心分離機の 1 mL を追加します。<ol>
		<li>血小板サイズの粒子をペレットに 10 分間、800 × g で遠心、上清を収集します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、タイロード バッファーの 100 μ L で再懸濁します。PAC1 FITC 抗体とアデノシン二リン酸 (ADP) の 20 μ L を加える最終濃度 20 μ M の FITC 肯定的なイベントの割合を決定するため 20 分分析フローサイトメトリーによる部屋の温度で加温。肯定的な制御 (図 3) と同じように扱われる新鮮なひと血小板を使用します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation.">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li><li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+(TPO)+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells.">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li><li>Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis:+State+of+the+Art.">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li><li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional.">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation,+transcriptional+activity+and+platelet+production.">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li><li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34+CD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage.">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells:+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution.">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li><li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+thrombocytopenia:+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro.">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li><li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia:+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count.">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li><li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells.">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li><li>Lu, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice.">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li><li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming.">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208 (2016).</li><li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells:+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood.">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+proplatelet+elaboration.">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).</li><li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34++cells.">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).</li><li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds.">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li><li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34+-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand.">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li><li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation,+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1/S+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation.">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li><li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+Immune+Thrombocytopenia.">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li><li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+thrombocytopenic+purpura:+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management.">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明されているプロトコルは、MK と臍帯血から文化における血小板の一貫生産に適しています。これらの細胞は、MK 増殖、分化、proplatelet の形成と血小板の生産に及ぼす薬や生物学的活動など様々 なプロセスを研究に使用できます。
文化メディアとサイトカインの組み合わせの様々 な文献で紹介されています。また幹細胞因子、フェルマーの最終定理 3 配位子、...

通常研究室用プライマリ ヒト巨核球 (MK) の十分な数の分離は不可能です、骨髄での低周波による有核細胞1の ~0.01% のアカウントは、彼ら。便利な代替手段は、拡張前のヴィヴォと造血幹・前駆細胞の特定の成長因子の存在下で分化です。巨核芽球の文化の最も効果的な成長および分化因子は、MKs。 トロンボポエチン (TPO) を生産する培養システムの採用 (SCF; c キット リガンド) 幹細胞因子とインターロイキン (IL)-3 IL 11 などサイトカインの数がされています。単独で、または SCF と IL 32などの他のサイトカインが有効であります。TPO は、増殖と MKs2の成熟の両方で発生する幹細胞集団を操作できます。
1000 までは毎日 150-400 x 109/L. 血小板生産の in vitroの血小板数を維持するために形成された proplatelets と呼ばれる細胞質突起から MK プロデュース血小板や、生体内で約 1 × 10 の11の血小板が-これは CD34 を使用して多数の培養条件に上昇を与えているし体内の見積もり3より低いフォールド+を改善する MK と血小板生産体外造血前駆細胞。CD34 の初期ソース+ MK 分化用細胞は、ひと末梢血4だった。骨髄5,6、胚性幹細胞/誘導多能性幹細胞 (ESC/iPSC)7臍帯血 (UCB)8,9,10 などの他の細胞の源.ひと骨髄 CD34+ 11とマウス系統負, 骨髄細胞5生産 MK と血小板体外;人間の骨髄の可用性の欠如が CD34 のソースとしての使用を制限するそれにもかかわらず、+のセル。対照的に、ESC と iPSCの in vitro血小板の生産のための細胞の無制限のソースを表します。これらの細胞からの血小板の生産には、フィーダー細胞マウス OP9 細胞長期培養などが必要です。フィーダー無料条件で派生した血小板は、少ない機能12のように見えます。iPSC 由来血小板が大規模に拡張することができますので、臨床の現場で使用する可能性があります。このプロセスには、転写因子と長期的な細胞文化13レンチウイルスベクターを介した情報伝達が必要です。
UCB は CD34 のアクセス ソース+で容易に使用することができます細胞研究設定。TPO だけではコードの分化を促進することができます血由来 CD34+の血清添加またはフィーダー細胞との共培養を必要とせず非常に純粋な成熟した MKs を生じさせる細胞とこれ。他のサイトカイン SCF UCB CD34 から分化が低下するなど、+細胞、フェルマーの最終定理 3 配位子と IL-11 未熟な巨核球14の生産を推進中。このプロトコルは非常に純粋な臍帯血 CD34 から MK 文化+の生産を記述する無血清条件下で細胞。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Culture Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Serum-free media for CD34+ cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;CD34 Isolation Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)</td></tr><tr><td>Sterile separation buffer (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flow Cytometry and Cell Staining Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>340669</td><td>Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>PerCP mouse anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>347464</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>PerCP isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Final antibody concentration 1:5 dilution.</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-Human CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody</td></tr><tr><td>Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>V450 mouse anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>1: 20 dilution</td></tr><tr><td>V450 isotype control</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>1:20 dilution</td></tr><tr><td>PAC1-FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>1:10 dilution</td></tr><tr><td>Anti CD62p mouse monoclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Isotype control antibody</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Counting beads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Smaller and larger columns are also commercially available</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator magnet</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile</td><td>In Vitro technologies</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium with DAPI</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica</td><td>DMIRB inverted microscope</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Single cell analysis software</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope software</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 blue edition</td><td></td></tr></tbody></table>

megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells

血小板は、骨髄血小板と呼ばれるプロセスで主に発生します。血小板産生、中に造血前駆細胞は巨核球は、proplatelets と呼ばれる長い細胞質プロセスから血小板を解放する区別する末期と呼ばれるフォーム血小板前駆細胞に区別します。巨核球は骨髄に閉じ込められた珍しいセルであり、実験室の使用のための十分な数字で収穫することは困難であるため。ヒト巨核球を効率的に生産することができます達成体外CD34 を養殖+の適した条件下のセルします。ここで詳細なプロトコル CD34 の分離を記述する臍帯血液サンプルから磁気セルソーターによる細胞の+ 。無血清条件下で非常に純粋な成熟した巨核球の生成に必要な手順を示します。巨核球分化の表現型解析および proplatelet の形成と血小板の生産の決定の詳細もあります。巨核球分化および/または抗血小板抗体などトロンボポエチン ヒューマンミメティック最前線の proplatelet の形成に影響を与えるエフェクターは、生物学的機能を調べるための培養細胞に追加できます。

このプロトコルにより、コードから高純度の MK 文化準備血由来 CD34+細胞。CD34 の割合+細胞コード血は約 1.315 (図 1 a)、10 x 90-300 から単核細胞 (ステップ 1.8) 範囲の総数 UCB 単位6 。CD34 の純度 + CD45 陽性細胞分離範囲は 90 から 99% (図 1 b) 後。MK (CD41 として定義されている+細胞...

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Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

巨核球の人口は非常に純粋なコードから得られる血由来 CD34+細胞。CD34 のメソッド+細胞分離と巨核球分化をここで説明します。

巨核球分化および人間の血小板形成臍帯血由来 cd34 陽性細胞の+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

19.6K ビュー.  University of New South Wales. 巨核球の人口は非常に純粋なコードから得られる血由来 CD34+細胞。CD34 のメソッド+細胞分離と巨核球分化をここで説明します。

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

免疫・感染学

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine induced differentiation of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineage cells. CD34+ cells are isolated from human umbilical cord blood and co-cultured with MS-5 stromal cells in the presence of cytokines. Immunophenotypic characterization of the stem and progenitor cells, and the differentiated myeloid lineage cells are described. Using this protocol, CD34+ cells may be incubated with small molecules or transduced with lentiviruses to express myeloid disease mutations to investigate their impact on myeloid differentiation.

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Here, we present a protocol for immunophenotypic characterization and cytokine induced differentiation of cord blood derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells to the four myeloid lineages. The applications of this protocol include investigations on the effect of myeloid disease mutations or small molecules on myeloid differentiation of the CD34+ cells.

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

発生生物学

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

マウスメガ核球前駆細胞の分離

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

生物学

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing platelets allows an in-depth study of the mechanisms underlying platelet biogenesis. Available culture protocols are mostly based on hematopoietic progenitors derived from bone marrow or cord blood raising a number of ethical, technical, and economic concerns. If there are already available protocols for obtaining CD34 cells from peripheral blood, this manuscript proposes a straightforward and optimized protocol for obtaining CD34+ cells from leukodepletion filters readily available in blood centers. These cells are isolated from leukodepletion filters used in the preparation of blood transfusion products, corresponding to eight blood donations. These filters are meant to be discarded. A detailed procedure to collect hematopoietic progenitors identified as CD34+ cells from these filters is described. The method to obtain mature megakaryocytes extending proplatelets while discussing their phenotypic evolution is also detailed. Finally, the protocol present a calibrated pipetting method, to efficiently release platelets that are morphologically and functionally similar to native ones. This protocol can serve as a basis for evaluating pharmacological compounds acting at various steps of the process to dissect the underlying mechanisms and approach the in vivo platelet yields.

This protocol describes in detail all the steps involved in obtaining leukofilter-derived CD34+ hematopoietic progenitors and their in vitro differentiation and maturation into proplatelet-bearing megakaryocytes that are able to release platelets in the culture medium. This procedure is useful for in-depth analysis of cellular and molecular mechanisms controlling megakaryopoiesis.

巨核球分化と血小板形成を研究する細胞源としての白血病の枯渇フィルター由来CD34+細胞

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

<meta charset="utf8"></head><body>臍帯血および骨髄からのHSPCを使用した赤血球生成のモデリング

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 billion cells per day), is crucial for maintaining individual health. Any disruption in this pathway can have significant consequences, leading to health issues. According to the World Health Organization, an estimated 25% of the global population presents symptoms of anemia. This protocol describes how to generate human erythroid cells both in vitro using hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from sources such as umbilical cord blood (UCB) or blood taken from healthy donors and ex vivo with HSPCs isolated from patients' bone marrow. Using genetic approach, genes of interest can be modulated in HSPCs, and their impact on erythropoiesis can be monitored at various stages of the differentiation process. This method allows for the screening of compounds perturbing, enhancing, or rescuing the capacity of HSPCs to differentiate into mature erythroid cells and to investigate the role of genes of interest during the erythroid differentiation process.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:赤血球生成研究の進歩 - 骨髄異形成症候群における造血幹細胞機能の評価のための簡素化されたパイプライン

Modeling erythropoiesis provides a valuable chance to comprehend the biological significance of actors in this process and to evaluate novel therapeutic approaches that may alleviate differentiation defects. Here, we describe a simple and reliable method to efficiently differentiate CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells ex vivo.

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

巨核球分化および人間の血小板形成臍帯血由来 cd34 陽性細胞の⁺

要約

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この動画の章

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

の臨床応用

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

マウスメガ核球前駆細胞の分離

巨核球分化と血小板形成を研究する細胞源としての白血病の枯渇フィルター由来CD34+細胞

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化インビトロからのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

巨核球分化および人間の血小板形成臍帯血由来 cd34 陽性細胞の+

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初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

の臨床応用

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

マウスメガ核球前駆細胞の分離

巨核球分化と血小板形成を研究する細胞源としての白血病の枯渇フィルター由来CD34+細胞

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

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