主要なメガ核球前駆細胞集団の単離は、単一細胞レベルまで、分子アッセイ上の細胞培養における系統階層の微細な分析を可能にする。このプロトコルは、MEPおよびMKP集団の細胞分類のための効率的なプロセスにおいて、必要な動物の数を最小限に抑えることによって、より倫理的な実践を組み合わせた。骨の場合、コレクションは70%エタノールで8〜12週齢のC57ブラックシックスマウスの体をスプレーします。
はさみを使用して、脊椎に垂直な皮膚の切開部を5〜1センチメートルにする。そして、それを引っ張ることによって、全身の周りの皮膚を引き裂きます。解剖パッドの上にマウスの顔を下に置き、露出した背骨に沿って上から下に指やはさみをスライドさせて骨盤の骨を見つけます。
腸骨の紋章を見つけるには、後肢近くの腰部の小さな隆起を特定します。はさみを脊椎に平行に置き、椎骨に対して、腸骨の凸部に近い、骨盤骨の上の背骨の側に沿って筋肉を切断し、椎骨に沿ってはさみを尾まで滑らせて進む。その後、椎骨と腸骨の頂上の間を切断し、可能な限り椎骨の近くに滞在します。
そして、体から手足を切り離すために残りの筋肉をカットします。取り外した手足をきれいな表面に移します。制度的なガイドラインに従って体の残りの部分を廃棄した後、周囲の組織を除去することによって、骨盤、大腿骨、脛骨の骨を露出させるために鉗子とメスを使用する。
鉗子を使用して大腿骨の遠位端を保持し、骨盤骨から大腿骨の頭部を慎重に切断し、精神病の周りの筋肉をメスで優しくスライスします。骨盤骨から残りの筋肉を削り取り、大腿骨頭を保持していた空洞の真ん中で切断する。イリウムを保持し、骨の三角形の薄い側を捨てます.
メスを使用して、イリウムの周りの残留組織を除去し、2%新生児子牛血清を補充滅菌PBSに洗浄した骨を置く。その後、はさみを使用して足首の脚から足を切り落とします。脛部の下部を鉗子で保持し、筋肉を膝に向かってこすり上げます。
フィブラを捨てる。その後、メスで脛目の高原を横切ってカットを行い、滅菌PBS 2%NBCSに脛を置きます。大腿骨の周りの残留組織を取り除いた後、鉗子で大腿骨の上側を保持し、膝蓋骨の基部にメスの刃を置きます。
膝蓋骨に向かって力を加える,大腿骨に平行に膝蓋骨を外す。次に、大腿骨を滅菌PBS2%NBCSに入れる。層流キャビネットで、滅菌PBS 2%NBCSで満たされた滅菌ペトリ皿に骨を移します。
メスを使って大腿骨の頭を切り落とします。1ミリリットルのシリンジに滅菌PBS 2%NBCSを充填し、21ゲージ針をコンセントに取り付けます。その後、滅菌PBS 2%NBCSの2ミリリットルで5ミリリットルのポリプロピレンチューブを充填します。
大腿骨を鉗子で保持し、左の溝に針を挿入し、回転を適用してニーキャップ除去した後、針が骨に完全に挿入されることを確認し、ベベルまで。針を挿入した後、2ミリリットルのPBS 2%NBCSを含むチューブに針を入れた骨を移す。その後、PBS 2%NBCSを分配し、吸引し、注射器から骨がはっきりするまで引き出す。
大腿骨から針を取り出し、大腿骨の頭部があった反対側の穴に挿入します。緩衝液を分配し、吸引した後、骨を捨てる。腸骨の紋章と脛骨の場合は、鉗子を使用して骨を保持し、回転を適用して開いた側に針をそっと挿入します。
針が完全に骨に挿入されていることを確認します, ベベルまで.次に、針で骨を2ミリリットルのPBS 2%NBCSを含むチューブに移します。骨がはっきりするまで、注射器からPBS2%NBCSを分配し、吸引する。
すべての細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーキャップを通し、無菌5ミリリットルポリスチレンチューブに入れ、PBS 2%NBCSの500マイクロリットルを加えます。総骨髄として細胞懸濁液の100マイクロリットルを脇に置きます。その後、染色手順のために氷の上に保管してください。
ペレットは遠心分離により濾過懸濁液を用いた。上清を捨て、作りたての一次抗体カクテルでペレットを氷の上のインキュベーションで30〜45分間再懸濁します。細胞懸濁液の10マイクロリットルを無菌5ミリリットルポリスチレンチューブに取り付け、リン・ポール・フラクションとラベル付けし、PBS 2%NBCSの90マイクロリットルを追加します。
一方、30秒間完全に渦を出して、バイアルで再懸濁して、磁気枯渇のためのビーズを準備します。ターゲットセルあたり2つのビーズに対応するビーズの体積を5ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、PBS 2%NBCSで2回ビーズを洗浄し、マグネットにチューブを置きます。滅菌ガラス低温殺菌ピペットで洗浄バッファーを除去した後、無菌PBS2%NBCSの500マイクロリットルでビーズを再懸濁する。
磁気枯渇の最初のステップでは、洗浄された細胞のペレットに250マイクロリットルのビーズを加え、氷の上で5分間穏やかな混合でインキュベートします。その後、2ミリリットルの滅菌PBS 2%NBCSを加え、穏やかな混合で、チューブを磁石に2分間入れます。無菌ガラスパスツールピペットで非磁性分画を収集する。
そして、磁気枯渇の第二のステップのために、磁気ビーズの残りの250マイクロリットルにそれを追加します。パラフィンで密封したチューブをチューブローラーに20分間、摂氏4度で置きます。次に、穏やかな混合で滅菌PBS 2%NBCSの2ミリリットルを追加します。
そして、磁石でチューブを2分間置きます。非磁性分画を無菌5ミリリットルポリプロピレンチューブに集め、無菌ガラスパストルールピペットを用いて非磁性リンネ画分を、テキスト原稿に記載されているように、巨核球前駆体の細胞選別を進める。細胞選別のための格言戦略では、Lin Neg集団において、C-kitを発現する細胞、およびSca-1またはCD16/32抗原の発現が低いから低い細胞が選択される。
この集団では、MEPはCD150陽性およびCD9薄暗細胞として同定される。CD150陽性、およびCD9明るい細胞としてのMKP。代表的なフローサイトメトリー分析では、MEPおよびMkpとして同定された細胞は、巨核球および血小板系統のCD41aおよびCD42c古典マーカーに対する蛍光共役抗体で標識した。
両方のマーカーをMKp集団の細胞によって発現させ、MEP集団の細胞の表面で検出されなかった。並べ替えられた巨核球のDNA含有量は、細胞が主にMEP集団にとって2nであることを実証した。そして、MKp細胞のごく一部は異物である。
より高いプロイド細胞は、これらの集団において有意に検出されなかった。半固体クロノゲンアッセイでは、CFU-MKはMEPおよびMKp集団の両方で検出された。BFU-EはMKp集団では検出されなかったが、MEPおよび、CD150陰性CD9薄暗い前駆細胞集団で検出された。
分化3日目の顕微鏡観察は、MEPおよびMKpが主に巨核球を産生し、大細胞として同定したことを示す。3日間培養した後に得られた巨核球は、CD41およびCD42c発現を用いて同定し、MEPおよびMKp細胞集団から産生された細胞の54、および82%をそれぞれ表す。生成された巨核球のプロイドは、MKp集団に由来する巨核球からより大きかったが、MEP集団と比較した。
MKp集団に由来する細胞のみ、プロ血小板放出が可能であったため、MKp集団に対するより高度な成熟段階を示唆した。骨盤骨の使用は、細胞数に大幅に増加し、一方、2段階の磁気枯渇は系統枯渇の有効性を改善する。このプロトコルは、単一細胞のMEPおよびMKp集団のその後の培養を可能にし、トランスクリプトミックおよびプロテオミクス分析と共に、関与するメカニズムを確かに解読し、実施された生物新生を有する。
