J ・ チュア、n. a. フィッシャー、d. DeShazer、午前フリードランダー原稿で説明する手順を設計されています。J ・ チュア、n. a. フィッシャー、標準偏差 Falcinelli + DeShazer は、実験を実行しました。J ・ チュアは、原稿を書いていた。
著者は、ジョシュア ・ J ・ w ・粕毛、ノラ + ドイル、ニコラス ・ r ・ カーターとスティーブン A. Tobery の優秀なテクニカル サポートとデビッド p. Fetterer、スティーブン j. カーン統計分析のためにありがとうございます。
仕事によって、防衛脅威の減少代理店の提案 #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F と #CBS を受けました。D.D. に MEDBIO.02.10.RD.034
意見、解釈、結論及び提言、これらの者を必ずしも米国軍隊によって支持されません。
この文書の内容が必ずしも反映しないビューまたは国防省の政策も言及されている商号、商品、または組織は、米国政府によって裏書を意味します。

1. 歯擦音のゴキブリのコロニーを維持するための準備
<ol><li>住んでいるゴキブリをしっと叱るのケージを準備します。ケージから出して登山とエスケープからゴキブリをしっと叱るようにケージの上部にある内側の壁のまわりに石油ゼリー、幅で約 20 ~ 30 mm の薄い層を適用されます。 注: ゴキブリをしっと叱るは、様々 な大きな設置スペース、十分な高さのと蓋のある容器に保管できます。マウスのケージを使用して (~ 43 cm × 23 cm × 20 cm)。37 ° C に向けられたケージ、ワセリンは適用されません。</li>
	<li>自然内気な昆虫のための隠れ場所を提供するためにケージ内上下逆さまに配置段ボールの卵のカートンを含めます。発泡スチロールをプラスチックの摂取を防ぐために作ったものと段ボールの卵のカートンを代用しないでください。</li>
	<li>簡単にクリーンアップと孵化幼虫の可視性を高めるには、寝具を提供しません。</li>
	<li>〜 20% の粗蛋白質の組成を含む乾燥したドッグフードを取得します。粗く挽くフードプロセッサーやミキサーでドッグフードと 4 ° C で保存</li>
	<li>いくつかの浅い料理と水族館石や食料や水をスポンジを取得します。 注: ペトリ皿、recommeded。</li>
</ol>2. 歯擦音のゴキブリ繁殖と飼育
<ol><li>商業ブリーダーから (〜 5 cm) ゴキブリをしっと叱るザイモグラムのマダガスカルを取得します。このプロトコルで使用される種はGromphadorhina ホウライカガミです。受け取り後すぐに歯擦音のゴキブリを含む配送ボックスを展開します。</li>
	<li>動物の処理に個人用保護具の使用のための適切な制度的ガイドラインに従います。 注: は、歯擦音のゴキブリの瞼板の爪が鋭いようにゴキブリを処理するため厚い使い捨て手袋を使用します。</li>
	<li>最大 75 大きなゴキブリをしっと叱るを転送 (> 3 cm) 大きいケージごと。新しく孵化し、小さい幼虫を転送 (< 3 cm) 別々 のケージに。 注: は、大幅に上回る 75 を大きいのままに保つマウス ケージごとゴキブリ植民地の健康悪化につながることができるし、死につながる場合も音が聞こえます。</li>
	<li>軽く色、オフホワイトである新しく molted ゴキブリを処理し、それを圧迫を避けます。また、暗くして処理する前に強化外骨格を許可します。 注: ダニ、ブリーダーから受領ゴキブリをしっと叱ることが多いGromphadorholaelaps schaeferiを削除する必要はありません。有益なダニは歯擦音のゴキブリを清潔に保つ、人間には無害です。</li>
	<li>週に一度か二度地面浅い皿に乾燥したドッグフードとゴキブリをしっと叱るをフィードします。ゴキブリをしっと叱るが、次の授乳まで十分な食糧をあることを確認十分なドッグフードを提供します。ウェットとカビとなっている食品を破棄します。</li>
	<li>ドッグフードだけでなくカットされた果物や野菜、リンゴ、ジャガイモ、または浅い皿にレタスなどを提供します。カビや腐った食品を破棄します。</li>
	<li>浅い皿に水を飲んで一週間に一度か二度を提供するが、檻の中の流出を防ぐために皿を入れすぎないではないか。小型のニンフの着陸パッドを提供する料理に小さな水族館石やスポンジを配置します。利用可能な場合は、逆浸透膜水を使用します。</li>
	<li>21 ° C から 30 ° c. まで温度で暗闇の中でゴキブリをしっと叱るを維持大型のゴキブリをしっと叱る宛てで繁殖や妊娠を減らすため 〜 2 ヶ月間低温 (~ 21 ° C) で実験をしてください。対照的に、成長を早めるために高温 (28 ° C ~ 30 ° C) で幼虫を保ちます。 注: キャビネット部屋の温度 (21 ° C)、暗闇の中でケージを維持します。</li>
	<li>ゴキブリはインキュベーターになって音が聞こえる場合、水の別の鍋を含むによって湿度を提供します。</li>
	<li>ケージをきれいには、定期的に、または転送することによってヒスノイズきれいなケージにゴキブリすべて 2 〜 3 週間乾燥糞便をすくいします。ケージの下部を乾燥させておきます。余分な水分が蓄積し、ケージの下に排泄物とミックスする許可されている場合は、すぐにケージをきれい。</li>
</ol>3. ゴキブリ実験に備えて
<ol><li>37 ° C 加湿インキュベーター順化実験前に 1 〜 3 週間ケージでゴキブリをしっと叱るの適切な番号に転送します。インジェクションの制御グループが含まれます。この馴化期間は、実験中に温度ショックを避けるために重要です。</li>
	<li>宛てで 37 ° C 高い温度溶けるゼリーのでケージに石油ゼリーを適用されません。</li>
	<li>食料と水を交換し、ケージをきれいにゴキブリをしっと叱るすべての 1 〜 2 日間を確認します。</li>
	<li>実験中にゴキブリをしっと叱るをグループ化するための蓋付き透明な使い捨てのプラスチック食糧容器を取得します。換気、蓋や釘を使ってコンテナーの側面の穴をパンチ、ハンマーします。 注: スナップをスクリュー キャップの容器を使用キャップ バイオ セーフティ レベル 3 の設定内のコンテナーです。スナップ キャップ容器は、必要に応じてテープで補強することができます。</li>
	<li>注射の日、男女均等を確保するコンテナーごとにグループに 6 に 12 順応歯擦音のゴキブリを配布し、体重します。</li>
	<li>ゴキブリをしっと叱る個々 の性別を決定します。男性と女性の不足は、角の隆起によって性別を決定します。</li>
	<li>個々 の歯擦音のゴキブリの重量を量る。バランスの歯擦音のゴキブリの計量を容易にするには、tared された 2 つの重量を量るボートで囲みます。 注: 実験間の一貫性を保つのためには、4 に 8 g の重量を持つゴキブリをしっと叱るを使用します。しかし、感染後の生存率の差はありません小 (1.5 に 2 g) と大 (6 に 8 g) ゴキブリをしっと叱る。創薬研究、ゴキブリをしっと叱る ~ 5 g の重量とを取得する体当たりより一貫性のある薬物濃度質量。</li>
	<li>水皿の代わりに高水内容フルーツまたは野菜、リンゴやジャガイモのスライスなどがあります。腐った食べ物を破棄します。コンテナーを乾いた状態に保つ付加的な水を提供しません。</li>
	<li>注射までゴキブリをしっと叱るを 37 ° C に戻る。</li>
</ol>4. 細菌培養と準備
注: このプロトコルで使用される細菌種は、 B. thailandensis、B. pseudomallei B. 疽。クラス ii B. 疽とB. pseudomalleiのすべての操作を行う必要があります。 または 3 実験室バイオ セーフティ レベル (BSL) に位置するクラス III 生物学的安全キャビネット。操作b. thailandensisと同様の生物学的安全キャビネットある BSL2 または BSL3 研究室のいずれか。BSL3 仕事のため制度の標準運用手順に従います。細菌を処理するとき個人用保護具の使用のための制度のガイドラインに従ってください。
<ol><li>感染する前に、少なくとも 3 日細菌病菌のマスター プレートを準備します。ルリア-ベルターニカミラ (レノックス) (LB) を使用して、 B. pseudomalleiまたはB. thailandensisの寒天とB. 疽の 4% のグリセロールを添加使用 LB 寒天培。-80 ° C で保存されている 25% グリセロール ストックから連勝細菌 注: は常に冷凍のグリセロール ストック; から直接マスター プレートを連勝します。細菌の継を避けるためプレートにプレートからこれは減らされた毒性を引き起こす可能性があります。</li>
	<li>マスター プレートからB. pseudomalleiまたはB. thailandensisの何人かのコロニーを 10 〜 20 mL LB スープを接種します。B. 疽の 4% のグリセロールを添加した流体培養基 LB を同様に接種します。</li>
	<li>37 ° C 〜 18 時間で 175 に 250 rpm でスープ文化を振る。</li>
	<li>10 分間 5,000 × g で文化の 3 に 2 mL を遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2PO4、1.8 mM KH2PO4、pH 7.4) の細菌のペレットを再懸濁します。</li>
	<li>0.5, 600 で吸光度で測定の光学濃度 (OD) を達成するために PBS で細菌を希釈 nm の分光光度計です。</li>
	<li>直列細菌開始外径 0.5 から 10 倍の PBS で希釈します。感染症のこれらの懸濁液を使用します。</li>
	<li>シリアル希釈による接種の単位 (CFU) を形成し、寒天培地上に 100 μ L の因数のめっきの植民地を決定します。24 〜 48 時間の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>5. 医薬品製剤
<ol><li>体ごとに与えられる薬の適切な量を決定するマス。歯擦音のゴキブリに CLQ 投与は 50 mg/kg である哺乳類、標準投与量に基づいていた日。</li>
	<li>再懸濁します。 または車両に関心の薬を薄めます。たとえば、12 mg/mL の濃度で PBS における CLQ を希釈します。この濃度は 25 μ L でゴキブリがボリュームを注入音が聞こえる 〜 6 g に薬物の 300 μ g を提供します。</li>
	<li>必要に応じて、薬液滅菌 0.22 μ m シリンジ フィルターを通過します。</li>
	<li>使用するまで 4 ° C で薬液を格納します。少なくとも 21 ° C (常温) 注射前に薬液を温めます。</li>
</ol>6. インジェクターのアセンブリ
<ol><li>反復的なピペットの調整ネジを回して音量 (25 μ L) へのポインターを設定します。</li>
	<li>反復的なピペットのリリース棒を内側にプッシュし、プッシャーを引き出します。繰り返しのピペットは、ロードされた注射器を収容する準備が整いました。 注: は、バランスで放出された水の量を測定することによって反復的なピペットによって放出されるボリュームを調整します。</li>
	<li>細菌や薬物を含む懸濁液 1 mL 注射器を入力します。</li>
	<li>注射器を付ける滅菌 26 または 27 G x 1/2 インチ (または短い) 針。</li>
	<li>トップに気泡をフロートし、10% の漂白剤を入れた容器に泡といくつかの懸濁液を排出する注射器をタップします。</li>
	<li>上向き針ベベルと反復的なピペットのシリンジ クリップにシリンジをスナップします。</li>
	<li>リリース棒を外側に引っ張って、ディスペンサー ボタンでしっかりとシリンジのプランジャーがプッシャーに対してまで 10% の漂白剤を入れた容器に空の注射を実行するを押します。</li>
	<li>1 または 2 追加空白の注射液は注射器から排出されることを確認するを実行します。反復的なピペットは注射の準備ができて。</li>
</ol>7. ゴキブリ注射
<ol><li>クラス II、クラス III 生物学的安全キャビネット、BSL2 のすべてのゴキブリの注射を行ったり、BSL3 設定使用制度個人用保護具をお勧め。</li>
	<li>ゴキブリをしっと叱ると接触するキャビネットの安全でクリーンな作業面。70% エタノールに続いて 10% の漂白剤を使用すると、残留漂白剤を削除できます。ように、表面の空気が乾燥。</li>
	<li>片方の手でその側で歯擦音のゴキブリをグリップします。注入中に反跳することがその歯擦音のゴキブリを固定します。腹部の terga 間皮膚膜を露出するよう歯擦音のゴキブリを若干曲げます。</li>
	<li>もう片方の手には、針が 0 ° 30 ° の角度に歯擦音のゴキブリの背腹側正中線から繰り返しのピペットなどを保持します。後端から 3rd、4thや 5th tergum に隣接する皮膚膜を穿刺します。 注: 示された角度で歯擦音のゴキブリに針のエントリにより針はなく通過し、歯擦音のゴキブリを終了します。注射部位は、放出された物質が体液でいっぱい腹部キャビティの内で含まれていることを確認します。歯擦音のゴキブリを押しながら事業生きたバクテリア、あるいは薬物を注射する前に水を注入することを練習します。</li>
	<li>しっかりとボリュームを注入する調剤ボタンを押します。優しくエントリの使用と同じ角度で針を撤回します。</li>
	<li>まだ注入されていない歯擦音のゴキブリから区別するために別の容器に注入された歯擦音のゴキブリを配置します。注射部位から滲んでいるが可能性がありますすべての体液をふき取りなさい。</li>
	<li>同じ注射器と針を使用してグループ内で他のゴキブリをしっと叱るを注入することを続行します。注射シリンジのプランジャーは最後の注射では不完全な投与を防ぐためにバレルの底に到達する前に停止します。</li>
	<li>単一歯擦音のゴキブリ、これらの細菌と薬などで複数の注射の歯擦音のゴキブリの背側に tergum の別の側面に挿入します。また、異なる terga (3rd 5th) に注入することで複数の注射を行います。</li>
	<li>容器の蓋をしっかりと閉じを確認します。必要に応じて、テープで蓋を強化します。</li>
	<li>加湿の 37 ° C の定温器でゴキブリをしっと叱る孵化させなさい。</li>
</ol>8. ヒスノイズ ゴキブリの罹患率や死亡率の記録
<ol><li>個人用保護具を推奨クラス II、クラス III 生物学的安全キャビネット制度ですべての歯擦音ゴキブリ検査を実行します。70% エタノールに続いて 10% 漂白剤できれいな安全キャビネットの表面。乾燥空気を作業領域として使用できます。</li>
	<li>罹患率の表 (表 1) の得点を使用して 1-2 週間の期間にわたって毎日歯擦音のゴキブリを一度か二度のスコアします。</li>
	<li>死んでいる歯擦音のゴキブリをコンテナーから削除し、生存者の数を記録します。</li>
	<li>残りのライブ コンテナーの下部に余分な水分が蓄積してきた場合は、清潔な容器にゴキブリをしっと叱るを転送します。また、使い捨てのペーパー タオルを使用して余分な水分をふき取る。</li>
	<li>腐った食べ物は毎日、加湿の 37 ° C の定温器にゴキブリをしっと叱る戻り値を交換してください。</li>
	<li>研究の終わりに、バイオハザード バッグの残りの生存者を置き、安楽死-80 ° C で凍結します。</li>
	<li>データ14 LD50を決定するための統計的な分析、生存のためのカプラン ・ マイヤーとログ ランク分析。同様にすべての昆虫実験対照群のいくつかの死亡があります。これらの死の昆虫15の自然死亡率に起因しています。対照群の死亡口座についての詳細について、参照15を参照してください。</li>
</ol>

<ol>
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最適な実験条件は最小限の一貫性のある時間のコミットメントが必要です健康の歯擦音のゴキブリ コロニーで始まります。比較的長い間行くことができるゴキブリをしっと叱る (~ 週間) 食料と水、なし毎週または隔週のケージのメンテナンスを提供する必要があります。これは、食料と水の供給をチェックし、ケージの乾燥を確実に含まれます。順化と; 高温孵化の間に特に重要です乾燥の?...

昆虫病原細菌と自然免疫生体防御研究するため代替の非哺乳類動物モデルとしての使用は、近年勢いを得ています。ロジスティック、これは、比較的安価なコストと取得、処理、および哺乳類に比べて昆虫の世話のしやすさのためです。規制政策研究に昆虫の使用を支配するがもないです。範囲対象ではありませんまたは任意の動物によって定められた制限使用委員会や政府機関。サロゲートの動物モデルとして昆虫、特に病原因子、ホスト病原体の相互作用、および抗微生物薬の効果の評価のための包括的なスクリーニングの調査に。その使用はそれにより動物実験1,2の行為に内在する倫理的なジレンマのいくつかを克服する研究に使用される哺乳類の数を減らすことができます。
昆虫は、昆虫と哺乳類の1、3の生来の免疫システム間の共通性の高度があるため代理ホストとして役立つかもしれない。Plasmatocytes 昆虫と哺乳類のマクロファージは貪食微生物4です。好中球に昆虫相手は血球5,6です。昆虫および哺乳類細胞における細胞内オキシダティブ バースト経路が似ています。両方の活性酸素種は、オーソログ p47phoxと p67phox蛋白質5によって生成されます。フリー ダイヤル昆虫や Toll 様受容体受容体と哺乳類におけるインターロイキン-1 の下流シグナル伝達カスケードも非常に似ています。7ディフェンシンなどの抗菌ペプチドの生産の両方の結果します。このように、昆虫は後生動物によって共有される一般の生得的な免疫機構を研究対象に利用できます。
属Gromphadorhinaからゴキブリをヒス マダガスカルと呼ばれる昆虫は、存在する場合、通常満期 5 ~ 8 cm に達する最大のゴキブリの種のひとつです。マダガスカル島にのみネイティブ、歯擦音のゴキブリは8気門と呼ばれる呼吸器系の開口部から空気を追放するとき生じる音それが作る - シューという音によって特徴付けられます。独特のヒスノイズは求愛と侵略の9のゴキブリをしっと叱る間社会的なコミュニケーションの形として機能し、男性はその生息地で妨げられたときに聞くことができます。マダガスカルの音を立てるゴキブリは、アメリカのゴキブリと他都市害虫種に比べてゆっくり動くが。及び繁殖; 簡単です。妊娠中の歯擦音のゴキブリは、一度に 20 に 30 子孫を生成できます。5 ヶ月で性的に成熟に達する、ニンフと呼ばれるゴキブリ ヒス赤ちゃん後に 6 回の脱皮を受けているし、5 歳生きることができます野生と飼育下8の両方。
マダガスカル活用して病菌疽、B. pseudomallei、細胞内の病原体に感染し、 B. thailandensis 10、11.の代理ホストとしてゴキブリをヒスゴキブリをしっと叱るでこれらの病原体の病原性細菌病菌、シリアのハムスターのベンチマーク モデル動物に病原性を示したに比べていた。B. pseudomalleiとB. 疽の 50% 致死量 (LD50) 両方モデル11に類似していたことがわかった。興味深いことに、 B. thailandensis齧歯動物モデルにおける非病原性は歯擦音のゴキブリ11致命的です。B. thailandensis感染に関してこの違い歯擦音のゴキブリ モデルの有用性を強調します。B. thailandensis変異体の減衰は、齧歯動物モデルでより歯擦音のゴキブリでより容易に解決できます。さらに、 B. thailandensisとして使用され多くの場合B. pseudomallei B. 疽 10,12,13, それの減衰の突然変異を識別するためのモデル生物でした。その劇毒性の親戚に同じような目標に します。
B. 疽に減衰するB. thailandensisシリアのハムスターと歯擦音のゴキブリでの病原性の違い、6 型分泌システム-1 (T6SS-1) などの重要な病原因子の変異にもかかわらず、B. pseudomalleiが B. thailandensis 11同様に減衰します。さらに、歯擦音のゴキブリ モデルを検証すると、個別 T6SS 突然変異体 (T6SS-2 T6SS 6) B. pseudomallei、シリアンハム スターにおける病原性のベアリングを持たない、残る歯擦音のゴキブリ11病原性という点で。したがって、歯擦音のゴキブリは 3細菌病菌の種の実行可能な代理の動物モデルであります。我々 は最近、病菌感染10とその毒性に対する抗マラリア薬クロロキン (CLQ) の有効性を検証するサロゲートの動物モデルとして歯擦音のゴキブリを利用しました。
ここでは、マダガスカルのケアと育児について述べるゴキブリをヒスと病菌の 3 種でこの昆虫に感染する方法について詳細に説明します。さらに、我々 は歯擦音のゴキブリは病原性細菌病菌の感染症で薬の有効性と、それ可能性が高いとしても同様の研究で他の細菌の病原体の代理ホストを勉強するサロゲート実行可能なモデルを示しています。

<table><tbody><tr><td>Madagascar hissing cockroach&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC&amp;nbsp;</td><td>143668</td><td></td></tr><tr><td>Kibbles n Bits, any flavor</td><td>Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA</td><td>UPC #079100519378</td><td></td></tr><tr><td>Snap on disposable plastic containers or equivalent</td><td>Rubbermaid, Huntersville, NC</td><td>UPC #FG7F71RETCHIL</td><td></td></tr><tr><td>Screw on disposable plastic containers or equivalent</td><td>Rubbermaid, Huntersville, NC</td><td>UPC #FG7J0000TCHIL</td><td></td></tr><tr><td>Tridak STEPPER series repetitive pipette</td><td>Dymax Corporation&lt;br/&gt; www.dymax.com</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Needle (26 or 27G x 1/2)</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109, 305111</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Difco Luria- Bertani (Lennox)</td><td>Becton Dickinson, Sparks, MD</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G6279</td><td></td></tr></tbody></table>

the madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to investigate virulence, pathogenesis, and drug efficacy

自然免疫の多くの側面は、哺乳類と昆虫の間保存されます。昆虫、 Gromphadorhina、属からゴキブリをヒス マダガスカルは、病原性、宿主-病原体相互作用、生得の免疫反応および薬の有効性の研究のための代替動物モデルとして利用できます。子育てに関する詳細は、歯擦音のゴキブリの繁殖と飼育が提供されます。またどのようにそれは細胞内病原体B. thailandensis、B. pseudomallei 病菌疽などの細菌に感染することを示す.歯擦音のゴキブリの使用は高価ではない、研究における哺乳類の使用規制問題を克服します。さらに、歯擦音のゴキブリ モデルを使用して検索結果、再現性と哺乳類モデルを用いて得られたもののようです。したがって、マダガスカルの歯擦音のゴキブリは、動物実験を行う際に検討する必要があります魅力的なサロゲート ホストを表します。

このセクションは、マダガスカル ゴキブリをしっと叱るB. 疽、B. pseudomallei B. thailandensis; に感染していた場合に得られた結果を示しています。結果は細菌感染に対する薬物の効果、薬物の毒性病原性の勉強にこの昆虫が病菌の種の扱いやすい動物モデルであります。ゴキブリをしっと叱るよりは野生型B. pseudomallei K96243 親B. 疽に感染し...

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The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

細菌の病原性、病態、薬物毒性、薬効、生得の免疫反応の研究を実施する、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカルを利用するプロトコルを提案します。

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカル

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

the-madagascar-hissing-cockroach-as-an-alternative-non-mammalian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K ビュー.  United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. 細菌の病原性、病態、薬物毒性、薬効、生得の免疫反応の研究を実施する、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカルを利用するプロトコルを提案します。

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

遺伝学

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

昆虫<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;細菌性病因を調査するための強力な感染モデルとして

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

免疫・感染学

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

<meta charset="utf8"></head><body>C.エレガンスを用いたC.アルビカンスにおける非致死性病原性表現型を研究するための2つの感染アッセイ

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

C.エレガンスを用いたC.アルビカンスにおける非致死性病原性表現型を研究するための2つの感染アッセイ

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous characteristics. Altogether with well-annotated genome sequences, these advantages have made American cockroach, Periplaneta americana, an important hemimetabolous insect model. Limited by the shortage of knockout strategy, effective RNA interference (RNAi)-based gene knockdown becomes an indispensable technique in functional gene research of P. americana. The present protocol describes the RNAi operation techniques in P. americana. The protocol includes (1) selection of the P. americana at proper developmental stages, (2) preparation for the injection setting, (3) dsRNA injection, and (4) gene knockdown efficiency detection. RNAi is a powerful reverse genetic tool in P. americana. The majority of P. americana tissues are sensitive to extracellular dsRNA. Its simplicity allows researchers to quickly obtain dysfunctional phenotypes under one or multiple targeting dsRNA injections, enabling researchers to better use the P. americana for developmental and metamorphic studies.

The present protocol describes step-by-step guidelines for the RNAi operation techniques in P. americana.

アメリカのゴキブリにおけるRNA干渉の応用

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

発生生物学

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために<i&gt; S。ニューモニエ</i&gt;、<i&gt; H。インフルエンザ</i&gt;、<i&gt; K。ニューモニエ</i&gt;、<em&gt; P。緑膿菌</em&gt;または<em&gt; A。バウマニ</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

結核複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物ガレリアメロネラの使用

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

キイロショウジョウバエ 幼虫注入プロトコル

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒスマダガスカル

要約

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隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

昆虫

C.エレガンスを用いたC.アルビカンスにおける非致死性病原性表現型を研究するための2つの感染アッセイ

C.エレガンスを用いたC.アルビカンスにおける非致死性病原性表現型を研究するための2つの感染アッセイ

アメリカのゴキブリにおけるRNA干渉の応用

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために

結核複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物ガレリアメロネラの使用

キイロショウジョウバエ幼虫注入プロトコル

無脊椎動物モデルシステムとしてショウジョウバエを使用して毒性を実験室でテストするための実験プロトコル

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカル

要約

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隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

昆虫

C.エレガンスを用いたC.アルビカンスにおける非致死性病原性表現型を研究するための2つの感染アッセイ

C.エレガンスを用いたC.アルビカンスにおける非致死性病原性表現型を研究するための2つの感染アッセイ

アメリカのゴキブリにおけるRNA干渉の応用

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために

結核複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物ガレリアメロネラの使用

キイロショウジョウバエ 幼虫注入プロトコル

無脊椎動物モデル システムとしてショウジョウバエを使用して毒性を実験室でテストするための実験プロトコル

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒスマダガスカル

キイロショウジョウバエ幼虫注入プロトコル

無脊椎動物モデルシステムとしてショウジョウバエを使用して毒性を実験室でテストするための実験プロトコル