プロトコルは、アメリカのゴキブリを研究する簡単な方法を提供します。一般的な衛生害虫であり、伝統的な漢方薬にとって有益な昆虫です。特定の遺伝子をノックダウンすることによって、アメリカのゴキブリの複数の生命活動の分子メカニズムを探るのに役立ちます。
この技術の主な利点は、アメリカのゴキブリや遺伝子編集に適さない他の同様の昆虫の遺伝子をノックダウンできることです。この技術は、遺伝的およびエピジェネティックな調節、組織の発達過程、付属器の再生、交配行動、およびアメリカのゴキブリの他の興味深い側面など、さまざまな分野を探索するために使用することができます。この技術は操作が簡単で汎用性があります。
DSRA注射治療中は動物を健康に保つことをお勧めします。初心者は数回の練習セッションの後にこのテクニックを簡単に習得できると思います。まず、孵化したニンフを4ミリメートルの開口部のふるいでオテカエから分離します。
ガラス管で白い麦芽焼きのP.americanaを選んでください。P.americanaを新しい容器に入れ、治療の正しい段階を待ちます。反応系に、10マイクロリットルのT7 2Xバッファー、2マイクロリットルのT7 Express Enzyme Mix、および2マイクログラムのPCR産物を加える。
最後に、二重蒸留水で総容量を20マイクロリットルにします。手動で逆さまに静かに混ぜ合わせ、摂氏37度で30分間、次に摂氏70度で10分間インキュベートします。1マイクロリットルあたり4マイクログラムのRNase A溶液をDEPC水で1〜200の割合で希釈する。
次いで、1マイクロリットル当たり1マイクロリットルのRQ1 RNase 遊離ドナーゼおよび1マイクロリットルの希釈RNase A溶液を系に加える。摂氏37度で30分間インキュベートする。次いで、酢酸ナトリウムの全体積の10%およびイソプロパノールの全体積の3容量を加える。
手動で軽く逆さまに混ぜ合わせ、氷の上に5分間置き、13,000gで4°Cで10分間遠心分離します。上清をピペットで取り除きます。次に、残渣を75%エタノール、25%DEPC処理水で洗浄し、次いで13,000gで摂氏4度で5分間遠心分離する。
再度上澄み液を除去し、ペレットを室温で15分間風乾する。次いで、二本鎖RNAを約100マイクロリットルのDEPC水で溶解し、それを1マイクロリットル当たり2マイクログラムの最終濃度に希釈する。マイクロインジェクションポンプにプログラムをセットアップして、各インジェクションの体積が一貫していることを確認します。
その後、シリンジにDEPC水を8〜10回充填して洗浄します。マイクロインジェクションポンプに10マイクロリットルのシリンジを取り付けます。その後、ポンプを起動し、シリンジに10マイクロリットルの二本鎖RNA溶液を充填する。
ゴキブリを二酸化炭素で麻酔し、ピンセットで優しく拾い上げ、ゴキブリを手で針に向かって届けます。次に、2つの腹部ソマイト間の隙間を介して針を表皮に対して水平に挿入する。二本鎖RNA溶液をゴキブリに注入し、内臓の損傷を避けるために針先ができるだけ表皮に近づけるようにする。
最後に、針先を引き出します。注射されたゴキブリをきれいなバイオアッセイ容器に入れる。二酸化炭素の影響から回復するまで約10〜20分待ちます。
容器に注射日、二本鎖RNAの種類と用量、P.americanaの年齢をラベル付けします。Ddc又はDOPA脱炭酸酵素とDpp又はデカペンタプレッグ遺伝子を2つの例として選択し、動物における標的を有しないdsMocKと二本鎖RNA注入後の麦芽ゴキブリの表現型を観察し、ネガティブコントロールとした。RNAi効率をqRT PCRにより検出した。
遺伝子は有意にノックダウンされ、p値はdsDdcで0.01未満、dsDppで0.05未満であった。ノックダウンDdc遺伝子を有するP.americanaは、閉塞したメラニン化のために白い表皮を有していた。dsDpp注射の実験では、RNAiは四肢の再生を破壊した。
昆虫は健康で、害を及ぼすことなく注射されるべきです。この技術は、アメリカのゴキブリのように遺伝子編集ができない昆虫の遺伝子機能を探る簡単な方法を提供します。
