Name: the madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to investigate virulence, pathogenesis, and drug efficacy
Uploaded: 2017-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
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J. Chua, N.A. 피셔, D. DeShazer 및 오전 프리 원고에 설명 된 절차를 설계 되었습니다. J. Chua, N.A. 피셔, 사 우 스 다코타 Falcinelli와 D. DeShazer는 실험을 수행. J. Chua 원고를 썼다.
저자는 조슈아 J. W. 부드러운 양 가죽, 노라 디도 일, 니콜라스 R. 카터 및 우수한 기술 지원에 대 한 스티븐 A. Tobery와 데이비드 P. Fetterer와 스티븐 제이 컨 통계 분석에 대 한 감사합니다.
작품으로는 방위 위협 감소 기관 제안 #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F 및 #CBS를 지원 했다. D.D. 하 MEDBIO.02.10.RD.034
의견, 해석, 결론, 및 권장 사항 그 저자의 이며 반드시 미국 육군에 의해 승인 되지 않습니다.
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1. 치찰음 바퀴벌레 식민지를 유지 하기 위한 준비
<ol><li>감 금 소에 살고 치찰음 바퀴벌레에 대 한 준비. 감 금 소에서 등산과 탈출에서 치찰음 바퀴벌레를 방지 하기 위해 감 금 소의 위쪽 내부 벽의 둘레에 석유 젤리, 폭, 약 20 ~ 30 m m의 얇은 레이어를 적용 됩니다. 참고: 치찰음의 바퀴벌레 다양 한 있는 대형 바닥 공간, 충분 한 높이의 뚜껑 컨테이너에에서 보관 수 있습니다. 마우스 케이지를 사용 하 여 (~ 43 cm x 23 cm x 20 cm). 감 금 소에 대 한 37 ° C에 대 한 운명, 석유 젤리는 적용 되지 않습니다.</li>
	<li>자연스럽 게 수 줍 어 곤충에 대 한 숨어있는 장소를 제공 하기 안에 거꾸로 배치 판지 계란 판지 포함. 폴리스 티 렌 거품의 플라스틱의 섭취를 방지 하기 위해 만든 한 골 판지 계란 판지를 대체 하지 않습니다.</li>
	<li>쉽게 정리 하 고 새로 부 화 nymphs의 가시성을 높이기에 침구를 제공 하지 않습니다.</li>
	<li>건조 한 개밥 ~ 20%의 조 단백질의 구성 포함 된 얻을. 덜 갈기 음식 프로세서 또는 믹서 기 개밥 및 4 ° c.에 저장</li>
	<li>여러 가지 얕은 요리 및 수족관 돌 또는 음식과 물에 대 한 스폰지를 얻을. 참고: 접시는 추천.</li>
</ol>2. 치찰음의 바퀴벌레 관리 및 번 식
<ol><li>Outbred 마다가스카르 쉿 하는 바퀴벌레 (~ 5 cm)는 상업적인 종 축에서 얻을. 이 프로토콜에서 사용 하는 종 Gromphadorhina laevigata입니다. 수령 즉시 치찰음 바퀴벌레를 포함 하는 배송 상자를 풀으십시오.</li>
	<li>동물 처리에 개인 보호 장비의 사용에 대 한 적절 한 제도적 지침을 따릅니다. 참고: 치찰음의 바퀴벌레의 tarsal 발톱 날카로운로 바퀴벌레를 처리 하기 위한 두꺼운 일회용 장갑을 사용 합니다.</li>
	<li>최대 75 큰 치찰음 바퀴벌레를 전송 (> 3 cm) 큰 감 금 소 당. 새롭게 부 화 하 고 작은 nymphs 전송 (< 3 cm) 별도 감 금 소에. 참고: 유지 75 보다 훨씬 더 큰 치찰음의 바퀴벌레 마우스 케이지 당 식민지의 건강 악화으로 이어질 수 및 또한 죽음 귀 착될 수 있었다.</li>
	<li>부드럽게 컬러로, 하얀은 새로 molted 바퀴벌레를 처리 하 고 그것을 당기고 피하십시오. 또는, 어둡게 하 고 처리 하기 전에 강화 외 골격을 하실 수 있습니다. 참고: 그것는 진드기, Gromphadorholaelaps schaeferi 를 종종 종 축에서 수령 시 치찰음 바퀴벌레를 제거할 필요가 없습니다. 도움이 진드기 쉿 하는 바퀴벌레를 청결 한 유지 하 고 인 간에 게 무해 하다.</li>
	<li>치찰음 바퀴벌레 먹이 지상 건조 한 개밥 얕은 접시에 일주일에 한 두 번. 쉿 하는 바퀴벌레는 충분 한 음식을 사용 하 여 다음 수 유까지 되도록 충분 한 개밥을 제공 합니다. 우기와 썩 되는 어떤 음식을 삭제 합니다.</li>
	<li>개 음식 뿐만 아니라 컷-업 과일, 야채, 사과, 감자, 또는 얕은 접시에 상 추 등을 제공 합니다. 폐기 썩 또는 썩은 음식.</li>
	<li>얕은 접시에 일주일에 한 두 번 식용 수를 제공 하지만 장에 흘림을 방지 하기 위해 접시 연극 하지 마십시오. 작은 님프에 대 한 상륙 패드를 제공 하기 위해 접시에 작은 수족관 돌 또는 스폰지를 놓습니다. 역삼 투 물를 사용 하 여 사용 가능한 경우.</li>
	<li>온도 21 ° C에서 30 ° c.에 배열에서 어둠 속에서 바퀴벌레 치찰음 유지 계속 큰 치찰음 바퀴벌레 번 식와 임신 ~ 2 개월 (~ 21 ° C) 낮은 온도에서 실험에 대 한 운명. 반면, 성장을 촉진 하 더 높은 온도 (28 ° C ~ 30 ° C)에서 님프를 유지. 참고: 캐비닛 실내 온도 (21 ° C)는 어둠 속에 감 금 소를 유지.</li>
	<li>치찰음의 바퀴벌레는 인큐베이터에 보관 하는 경우 물 별도 팬을 포함 하 여 습도 제공 합니다.</li>
	<li>정기적으로 또는 전송 하 여 치찰음 바퀴벌레 깨끗 한 케이지를 2 ~ 3 주마다 건조 배설물 밖으로 떠 서 여 감 금 소를 청소. 감 금 소의 바닥 건조 유지. 과잉의 물을 축적 하는 감 금 소의 바닥에 배설물과 혼합 수 있다면 즉시 케이지 청소.</li>
</ol>3. 바퀴벌레 실험에 대 한 준비
<ol><li>적절 한 수 장에 치찰음 바퀴벌레의 전송 37 ° C 습도 인큐베이터 새 환경 순응 실험에 앞서 1 ~ 3 주. 주입에 대 한 컨트롤 그룹을 포함 합니다. 이 새 환경 순응 기간 실험 동안 온도 충격을 피하기 위해 중요 하다.</li>
	<li>석유 젤리 케이지 때문에 높은 온도 녹아 젤리 37 ° C에 대 한 운명에 적용 되지 않습니다.</li>
	<li>확인 치찰음 바퀴벌레 1 ~ 2 일 마다 음식과 물을 대체 하 고 감 금 소를 청소.</li>
	<li>분명 일회용 플라스틱 음식 용기 실험 동안 쉿 하는 바퀴벌레를 그룹화 하는 데 뚜껑을 얻을. 환기, 뚜껑 또는 못을 가진 컨테이너의 측면에 구멍을 펀치와 망치. 참고: 스냅인을 통해 사용 나사 뚜껑 컨테이너 컨테이너 biosafety 수준 3 설정에서 모자. 필요한 경우 테이프, 스냅 캡 용기를 강화 수 있습니다.</li>
	<li>주입의 하루에 6 ~ 12 acclimatized 치찰음 바퀴벌레 섹스에 의해 동등 하 게 분배 되도록 하는 컨테이너, 당 그룹으로 고 신체 질량.</li>
	<li>개별 치찰음 바퀴벌레의 섹스를 확인 합니다. 남성과 여성에 그 부족에 뿔의 굴지에 의해 섹스를 확인 합니다.</li>
	<li>개별 치찰음 바퀴벌레 무게. 촉진 하기 위해 균형에 치찰음 바퀴벌레의 무게, tared 된 두 무게 보트 내에서 묶습니다. 참고: 실험 간의 일관성을 위해 4-8 g의 무게로 치찰음의 바퀴벌레를 사용 합니다. 그러나, 감염 후 생존에 차이가 작은 (1.5 ~ 2 g), 대형 (6-8 g) 치찰음 바퀴벌레 사이 발견 되었습니다. 약물 연구를 사용 하 여 치찰음 바퀴벌레 ~ 5 g의 무게와 몸 당 보다 일관성 있는 약물 농도 대량.</li>
	<li>물 접시 대신 높은 물 콘텐츠 과일 또는 야채, 사과 또는 감자의 조각 등을 포함 합니다. 썩은 음식을 삭제 합니다. 컨테이너를 건조 유지에 추가 물을 제공 하지 않습니다.</li>
	<li>주사까지 37 ° C에 치찰음의 바퀴벌레를 반환 합니다.</li>
</ol>4. 세균성 문화 및 준비
참고: 세균성 종이이 프로토콜에 사용 되는 B. mallei, B. pseudomallei, 및 B. thailandensis. B. mallei 와 B. pseudomallei 모든 조작 클래스 II에서 수행 해야 합니다 또는 클래스 III 생물 안전 캐비닛 biosafety 수준 (BSL)에 3 실험실. 조작을 수행 B. thailandensis 비슷한 생물 안전 캐비닛 BSL2 또는 BSL3 실험실에 위치. BSL3 작업에 대 한 기관 표준 운영 절차를 따릅니다. 박테리아를 처리할 때 개인 보호 장비의 사용에 대 한 제도적 지침을 따릅니다.
<ol><li>최소 3 일 전에 감염 Burkholderia 의 마스터 플레이트를 준비 합니다. Luria Bertani (레 녹 스) (파운드)를 사용 하 여 B. pseudomallei 또는 B. thailandensis agar 및 사용 파운드 agar 4% 글리세롤 B. mallei에 대 한 보충. 저장-80 ° c.에 25% 글리세롤 재고에서 행진 박테리아 참고: 항상 냉동된 글리세롤 주식;에서 직접 마스터 플레이트를 행진 직렬 통과 하는 박테리아의 피할 에서 플레이트에 플레이트가 감소 된 독성을 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>10 ~ 20 mL 파운드 국물 마스터 플레이트에서 B. pseudomallei 또는 B. thailandensis 의 여러 식민지와 예방 마찬가지로 파운드 국물 B. mallei에 대 한 4% 글리세롤과 보충 접종.</li>
	<li>~ 18 h 37 ° C에서 175 ~ 250 rpm 국물 문화를 흔들어.</li>
	<li>10 분 동안 5000 x g에서 문화 2 ~ 3 mL 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2포4, 1.8 m m KH2포4, pH 7.4)에 세균 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>0.5, 600에서 흡 광도 측정에의 한 광학 밀도 (OD)를 달성 하기 위해 PBS 가진 박테리아를 희석 한 분 광 광도 계에 nm.</li>
	<li>순차적으로 희석 박테리아 0.5의 시작 마약에서 ten-fold에 PBS. 이러한 정지를 사용 하 여 감염에 대 한.</li>
	<li>식민지는 inoculum 단위의 (CFU) 직렬 희석에 의해 형성 하 고 agar 미디어에 100 µ L aliquots의 도금을 결정 합니다. 24 ~ 48 h에 대 한 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
</ol>5. 약 준비
<ol><li>체 당 주어진 약물의 적절 한 금액을 결정 질량. 쉿 하는 바퀴벌레에 게 주어진 CLQ 복용량은 50 mg/kg, 포유류에 대 한 표준 복용량에 근거 했다/일.</li>
	<li>Resuspend 또는 차량에 대 한 관심의 약물을 희석. 예를 들어 12 mg/mL의 농도에서 CLQ PBS에 희석. 이 농도의 치찰음의 바퀴벌레 25 µ L에서 주입 볼륨 ~ 6 g을 약 300 µ g를 제공 합니다.</li>
	<li>필요한 경우, 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여 약물 솔루션을 소독.</li>
	<li>사용 될 때까지 4 ° C에서 약 솔루션을 저장 합니다. 적어도 21 ° c (실내 온도) 주사 전에 약물 솔루션 따뜻한.</li>
</ol>6입니다. 인젝터의 조립
<ol><li>반복적인 피 펫에 조정 나사를 회전 하 여 원하는 볼륨 (25 µ L)에 대 한 포인터를 설정 합니다.</li>
	<li>푸 셔를 바깥쪽으로 당겨 하 고 반복적인 피 펫의 릴리스 바를 안쪽으로 밀어. 반복적인 피 펫 이제 로드 주사기를 수용할 준비가 되어 있습니다. 참고: 보정 볼륨 균형에 배출 하는 물의 양을 측정 하 여 반복적인 피 펫으로 나옵니다.</li>
	<li>박테리아 또는 약물을 포함 하는 서 스 펜 션에 1 mL 주사기를 채우십시오.</li>
	<li>살 균 26에 주사기를 연결 또는 27 G x ½ 인치 (또는 더 짧은) 바늘.</li>
	<li>상단에 기포를 플 로트 하 여 10% 표 백제로 채워진 콘테이너로 거품 및 일부 정지 추방 주사기를 누릅니다.</li>
	<li>향하도록 바늘 경사와 반복적인 피 펫의 주사기 클립에 주사기를 스냅 합니다.</li>
	<li>릴리스 바 바깥쪽으로 당겨 고 빈 주사 주사기 플런저는 미는 사람에 대 한 때까지 10% 표 백제로 채워진 콘테이너로 수행을 단단히 디스펜서 버튼을 눌러</li>
	<li>액체 주사기에서 배출 되는 보장 하기 위해 추가 빈 주사 1 또는 2 수행 합니다. 반복적인 피 펫은 주사에 대 한 준비.</li>
</ol>7. 바퀴벌레 주사
<ol><li>클래스 II 또는 클래스 III 생물 안전 캐비닛에 BSL2에서에서 모든 바퀴벌레 주사를 수행 하거나 권장 BSL3 설정을 사용 하 여 기관 개인 보호 장비.</li>
	<li>깨끗 한 작업 표면은 안전 캐비닛에 쉿 하는 바퀴벌레와 접촉 하 여 올 수 있습니다. 뒤에 70% 에탄올 10% 표 백제를 사용 하 여 잔여 표 백제를 제거. 건조 공기를 표면을 수 있습니다.</li>
	<li>한 손으로, 그것의 측면에 의해 치찰음의 바퀴벌레를 잡습니다. 되도록 주입 중 반동 수 치찰음 바퀴벌레를 고정 하 고 구부려 치찰음 바퀴벌레 약간 그래서 복 부 terga 사이 피부 막 노출 됩니다.</li>
	<li>다른 한편으로는, 되도록 바늘 0 °에 30 ° 각도로 쉿 하는 바퀴벌레의 dorso 복 부 중간에서 반복적인 피 펫 붙. 찔린 피부 막 후부 끝에서 3rd, 4번째또는 5번째 tergum에 인접 한 합니다. 참고: 항목 표시 각도에서 치찰음 바퀴벌레에 바늘의 바늘 않습니다 하지 통과 하 고 쉿 하는 바퀴벌레를 종료할 보장 합니다. 사출 사이트 꺼낸된 소재 hemolymph 채워진 복 부 구멍 안에 포함 된 보장 합니다. 쉿 하는 바퀴벌레를 들고 사업 라이브 박테리아 또는 약물 주입 하기 전에 물으로 주입 연습.</li>
	<li>디스 펜스 버튼 볼륨을 주입을 단단히 밀어. 부드럽게 항목에 대 한 사용으로 같은 각도로 바늘을 철회 한다.</li>
	<li>주입 하지 아직 치찰음 바퀴벌레에서 그것을 구별 하는 별도 용기에 주입된 치찰음 바퀴벌레를 놓습니다. 주사 사이트에서 분출 할 수 있습니다 어떤 hemolymph를 닦아내십시오.</li>
	<li>계속 같은 주사기와 바늘을 사용 하 여 그룹 내에서 다른 치찰음 바퀴벌레를 주입 합니다. 주입 주사기 플런저 마지막 주입에 불완전 한 주입을 방지 하기 위해 배럴의 바닥에 도달 하기 전에 중지 합니다.</li>
	<li>여러 주사 약, 박테리아와 같은 단일 치찰음 바퀴벌레에 대 한 쉿 하는 바퀴벌레의 등 쪽 측에 tergum의 다른 측면에서 주사. 또는, 다른 terga (3 5일을rd )에 주입 하 여 여러 주사를 수행 합니다.</li>
	<li>컨테이너의 뚜껑은 단단히 고정 되어 있는지 확인 합니다. 필요한 경우 테이프, 뚜껑을 강화.</li>
	<li>치찰음의 바퀴벌레 습도 37 ° C 배양 기에서 품 어.</li>
</ol>8입니다. 녹화 치찰음의 바퀴벌레 병 적 상태와 사망률
<ol><li>개인 보호 장비를 권장 클래스 III 또는 클래스 II 생물 안전 캐비닛 기관에서 모든 치찰음 바퀴벌레 검사를 수행 합니다. 뒤에 70% 에탄올 10% 표 백제와 함께 안전 캐비닛에 표면 청소. 작업 영역 공기를 건조 하실 수 있습니다.</li>
	<li>점수 표 (표 1) 사망률을 사용 하 여 1 ~ 2 주 동안 매일 치찰음 바퀴벌레 번 점수.</li>
	<li>컨테이너에서 죽은 쉿 하는 바퀴벌레를 제거 하 고 생존자의 수를 기록.</li>
	<li>컨테이너의 하단에 과도 일 분 축적 하는 경우 깨끗 한 컨테이너에 바퀴벌레 치찰음 라이브 남은 전송. 또는, 일회용 종이 수건을 사용 하 여 과도 일 분을 닦아.</li>
	<li>썩은 음식 매일 반환 치찰음의 바퀴벌레 습도 37 ° C 배양 기를 교체 합니다.</li>
	<li>연구의 끝에, 나머지 생존자 biohazard 가방에 놓고 안락사에-80 ℃에서 동결 합니다.</li>
	<li>통계적으로 분석 데이터14 l D50 를 결정 하 고 생존을 위한 카 플 란-마이어와 로그-순위 분석. 모든 곤충 실험과 마찬가지로 일부 사망자의 제어 그룹에서 발생할 수 있습니다. 이 죽음은 곤충 15의 자연 사망률 때문 이라고. 컨트롤 그룹에서 죽음에 대 한 계정 하는 방법에 더 자세한 내용은, 참조15참조.</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orange+spotted+cockroach+(Blaptica+dubia,+Serville+1839)+is+a+permissive+experimental+host+for+Francisella+tularensis.">The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis.</a> PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

최적의 실험 조건 일관 된 시간 약속 하지만 최소한의 요구 하는 건강 한 치찰음 바퀴벌레 식민지로 시작 합니다. 치찰음의 바퀴벌레 시간의 비교적 긴 기간에 대 한 갈 수 있지만 (~ 주) 음식과 물 없이 매주 또는 격주 케이지 유지 보수를 제공 해야 합니다. 음식과 물 공급을 확인 하 고 보장 그는 케이지 건조 포함 됩니다. 건조 생활 상태를 유지 하는 특히 중요 한 새 환경 순응 및 높은 온도;에서 ...

세균 병 인 타고 난 호스트 방어를 공부 하 고 대체 비 포유류 동물 모델으로 곤충의 사용 최근 몇 년 동안에 추진력을 얻고 있다. 물류, 이것은 그들의 상대적으로 저렴 한 비용 및 획득, 처리, 및 포유류에 비해 곤충에 대 한 배려에 용이성 때문. 또한 연구에 있는 곤충의 사용 규제 정책이 있다 그것은 범위에 따라 또는 제한이 어떤 동물에 의해 규정 된 설정 위원회 또는 정부 기관에 사용. 대리 동물 모델으로 곤충 특히 독성 요인, 호스트 병원 체 상호 작용 및 항균 약물 효능 평가 대 한 종합 심사 연구 의무가 있습니다. 그들의 사용은 그로 인하여 일부 동물 실험 1,2의 행위에 내재 된 윤리적 딜레마를 극복 하는 연구에 사용 하는 포유류의 수를 줄일 수 있습니다.
곤충 곤충과 포유류 1,3의 타고 난 면역 체계 사이 공용성의 높은 학위 때문에 대리 호스트 될 수 있습니다. Plasmatocytes 곤충 및 포유류 세포 phagocytose 미생물 4. neutrophil에 곤충 대응 hemocyte 5,6입니다. 곤충과 포유류 세포에서 세포내 산화 파열 경로 비슷합니다; 둘 다에서 반응성 산소 종 orthologous p47phox 와 p67phox 단백질 5에 의해 생산 됩니다. 곤충 및 수용 체 통행세 같이 수용 체 통행세와 포유류에서 Interleukin-1 신호 계곡 하류는 또한 비슷해; 둘 다 defensins 7등 항균 성 펩 티 드의 생산 귀 착될. 따라서, 곤충 연구 metazoans에 의해 공유 되는 일반적인 타고 난 면역 메커니즘을 활용할 수 있습니다.
치찰음의 바퀴벌레 속 Gromphadorhina 에서 마다가스카르 라는 곤충 존재, 일반적으로 만기에 5 ~ 8 cm를 도달 하는 가장 큰 바퀴벌레 종 중 하나입니다. 마다가스카르의 섬에만 기본 이며 그것은-쉿 소리 쉿 하는 바퀴벌레 spiracles 8라는 호흡 구멍을 통해 공기를 추방 하는 때 생산 되는 소리가 특징 이다. 독특한 엘리베이터 치찰음의 바퀴벌레 구애와 침략 9 간의 사회적 커뮤니케이션의 한 형태로 제공 하 고 남성은 그것의 서식 지에서 방해 하는 때 들릴 수 있다. 마다가스카르 쉿 하는 바퀴벌레는 미국 바퀴벌레 및 다른 도시 해충 종에 비해 느린 이동입니다. 그것은 쉽게에 대 한 관심과 사육; 임신 치찰음의 바퀴벌레는 한 번에 20 ~ 30 자손을 생산할 수 있다. 치찰음의 바퀴벌레, 요정, 라는 도달 성적인 성숙에 5 개월 아기 후 6 molts를 진행 하 고 야생에서와 포로 8에서 5 년까지 살 수.
우리 Burkholderia mallei, B. pseudomallei, 세포내 병원 체 감염 및 B. thailandensis 10,11. 에 대 한 대리 호스트 치찰음의 바퀴벌레는 마다가스카르 활용 치찰음의 바퀴벌레에이 균의 독성은 Burkholderia, 시리아 햄스터에 대 한 벤치 마크 동물 모델에서 그들의 독성에 비교 되었다. 우리는 50% 치 사 량 (LD50) B. pseudomallei 의 B. mallei 두 모델 11에서 유사 했다 발견. 흥미롭게도, B. thailandensis, 설치류 모델에서 avirulent는 치찰음 바퀴벌레 11치명적인입니다. B. thailandensis 감염에 관하여이 차이 밑줄, 치찰음 바퀴벌레 모델의 유틸리티 B. thailandensis 돌연변이 약하게 설치류 모델에서 보다 치찰음 바퀴벌레에 더 쉽게 해결할 수 있습니다. 또한, B. thailandensis 로 자주 사용으로 B. pseudomallei 와 B. mallei 10,12,13, 그것에 약하게 돌연변이 식별에 대 한 모델 유기 체 수 있습니다. 악성의 친척에 비슷한 대상으로 이어질.
시리아 햄스터에 비해 치찰음 바퀴벌레에 B. thailandensis 의 독성에 차이, 돌연변이 유형 6 분 비 시스템-1 (T6SS-1), 그와 같은 중요 한 독성 요인에도 불구 하 고는 B. mallei 에 약하게 되 고 B. pseudomallei, 있다 마찬가지로 B. thailandensis 11약하게. 쉿 하는 바퀴벌레 모델 개별 T6SS 돌연변이 (T6SS-T6SS-6 2) B. pseudomallei에 시리아 햄스터에 독성에 아무런 베어링을가지고, 치찰음 바퀴벌레 11악성 유지에 더 유효성이 검사 됩니다. 따라서, 쉿 하는 바퀴벌레 세 Burkholderia 종에 대 한 실행 가능한 대리 동물 모델 이다. 우리는 최근 Burkholderia 감염 10 과 그 독성에 대 한 안티 말라리아 약물 클로로퀸 (CLQ)의 효능을 검사 하는 서로게이트 동물 모델으로 쉿 하는 바퀴벌레를 활용.
여기, 우리가 설명 양육 그리고 배려는 마다가스카르의 치찰음의 바퀴벌레와 3 Burkholderia 종 가진이 곤충을 감염 하는 방법에 정보를 제공. 또한, 우리는 쉿 하는 바퀴벌레는 공부 독성 및 약물 효능 Burkholderia 감염에는 그것은 가능성이 될 수 있습니다 또한 비슷한 연구에서 다른 세균성 병원 체에 대 한 대리 호스트 실행 가능한 대리 모델을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Madagascar hissing cockroach&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC&amp;nbsp;</td><td>143668</td><td></td></tr><tr><td>Kibbles n Bits, any flavor</td><td>Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA</td><td>UPC #079100519378</td><td></td></tr><tr><td>Snap on disposable plastic containers or equivalent</td><td>Rubbermaid, Huntersville, NC</td><td>UPC #FG7F71RETCHIL</td><td></td></tr><tr><td>Screw on disposable plastic containers or equivalent</td><td>Rubbermaid, Huntersville, NC</td><td>UPC #FG7J0000TCHIL</td><td></td></tr><tr><td>Tridak STEPPER series repetitive pipette</td><td>Dymax Corporation&lt;br/&gt; www.dymax.com</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Needle (26 or 27G x 1/2)</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109, 305111</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Difco Luria- Bertani (Lennox)</td><td>Becton Dickinson, Sparks, MD</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G6279</td><td></td></tr></tbody></table>

the madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to investigate virulence, pathogenesis, and drug efficacy

타고 난 면제의 여러 측면은 포유류와 곤충 사이 보존 됩니다. 곤충, 치찰음의 바퀴벌레 속 Gromphadorhina 에서 마다가스카르의 독성, 호스트 병원 체 상호 작용, 타고 난 면역 반응 및 약물 효능 연구에 대 한 대체 동물 모델로 활용할 수 있습니다. 양육에 대 한 세부 정보, 관리 및 쉿 하는 바퀴벌레의 번 식 제공 됩니다. 우리는 또한 그것 Burkholderia mallei, B. pseudomallei, 및 B. thailandensis세포내 병원 체과 같은 박테리아로 감염 될 수 있는 어떻게 보여 줍니다. 쉿 하는 바퀴벌레의 사용은 저렴 하 고 포유류 연구를 사용 하 여 처리 하는 규제 문제를 극복. 또한, 쉿 하는 바퀴벌레 모델을 사용 하 여 찾은 결과 재현할 수 있으며 포유류 모델을 사용 하 여 얻은 비슷합니다. 따라서, 마다가스카르 쉿 바퀴벌레 동물 연구를 할 때 탐구 해야 하는 매력적인 대리 호스트를 나타냅니다.

이 섹션에서는 마다가스카르 쉿 바퀴벌레 했다 또는 감염 된 B. mallei, B. pseudomallei B. thailandensis; 때 가져온 결과 결과이 곤충 독성, 약물 독성, 그리고 세균 감염에 대 한 약물 효능을 공부에서 Burkholderia 의 다른 종족에 대 한 온순한 동물 모델 임을 보여준다. 더 쉿 바퀴벌레 감쇠 돌연변이 (Δhcp1) 보다 그룹 wildtype B. pseudomallei K96243, 부모의 <e...

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The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

우리는 세균 독성, 병 인, 약물 독성, 약물 효능, 그리고 타고 난 면역 반응 연구를 수행 하는 대체 비 포유류 동물 모델으로 치찰음의 바퀴벌레는 마다가스카르를 활용 하는 프로토콜 제시.

마다 가스 카 르 독성, 병 인, 및 약물 효능을 조사 하기 위해 대체 비 포유류 동물 모델로 서 치찰음의 바퀴벌레

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

the-madagascar-hissing-cockroach-as-an-alternative-non-mammalian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K 조회수.  United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. 우리는 세균 독성, 병 인, 약물 독성, 약물 효능, 그리고 타고 난 면역 반응 연구를 수행 하는 대체 비 포유류 동물 모델으로 치찰음의 바퀴벌레는 마다가스카르를 활용 하는 프로토콜 제시.

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

곤충<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

면역학 및 감염병학

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans를 사용하여 C. albicans의 치명적이지 않은 독성 표현형을 연구하기 위한 두 가지 감염 분석

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

C. elegans를 사용하여 C. albicans의 치명적이지 않은 독성 표현형을 연구하기 위한 두 가지 감염 분석

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous characteristics. Altogether with well-annotated genome sequences, these advantages have made American cockroach, Periplaneta americana, an important hemimetabolous insect model. Limited by the shortage of knockout strategy, effective RNA interference (RNAi)-based gene knockdown becomes an indispensable technique in functional gene research of P. americana. The present protocol describes the RNAi operation techniques in P. americana. The protocol includes (1) selection of the P. americana at proper developmental stages, (2) preparation for the injection setting, (3) dsRNA injection, and (4) gene knockdown efficiency detection. RNAi is a powerful reverse genetic tool in P. americana. The majority of P. americana tissues are sensitive to extracellular dsRNA. Its simplicity allows researchers to quickly obtain dysfunctional phenotypes under one or multiple targeting dsRNA injections, enabling researchers to better use the P. americana for developmental and metamorphic studies.

The present protocol describes step-by-step guidelines for the RNAi operation techniques in P. americana.

미국 바퀴벌레에 있는 RNA 간섭의 신청

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

발생학

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

마다 가스 카 르 독성, 병 인, 및 약물 효능을 조사 하기 위해 대체 비 포유류 동물 모델로 서 치찰음의 바퀴벌레

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양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

곤충

C. elegans를 사용하여 C. albicans의 치명적이지 않은 독성 표현형을 연구하기 위한 두 가지 감염 분석

C. elegans를 사용하여 C. albicans의 치명적이지 않은 독성 표현형을 연구하기 위한 두 가지 감염 분석

미국 바퀴벌레에 있는 RNA 간섭의 신청

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기

결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용

초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜

무척 추 동물 모델 시스템으로 독성 테스트 실험실에서 초파리 를 사용 하 여 실험 프로토콜