Name: dna staining method based on formazan precipitation induced by blue light exposure
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
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この作品は、フォンド ナシオナル デ開発 Científico y Tecnológico (Fondecyt)、チリ、(CW) にプロジェクト 11130263、プロジェクト チリ + NERC エイトによって支えられた (CW) に Colaboración インターナショナル PCI PII20150073 と U-inicia Vicerrectoría デから危惧デチリ (CW) します。
芸術 Químicas y 博士ホルヘ バーブルと参考については、原稿やリオイバニェス デ extensión デ ラ Facultad デ改正ロバート ・ レッシュ サンディエゴ キロガ ロジャー、このプロジェクトの初期の段階で助けタチアナ ナランホ パルマ行きのおかげでください。チリ大学から Farmacéuticas。ビデオを編集するためのマルセロ ・ ペレスとニール · スティーブンスのナレーションを提供するテキストとエロール ・ ワトソンを修正するためにあまりにも感謝します。

1. 準備とゲルの実行
<ol><li>Sambrook とラッセルの14が、SDS の代わりに水を用いたナトリウム Dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) レシピを使用して 12% のポリアクリルアミドゲルの非変性ゲルを準備します。<ol>
<li>解決のゲルの 5 mL の準備、TEMED 0.002 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.05 mL の 1.5 M トリス pH 8.8 1.3 mL アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 2 mL 1.7 mL の蒸留水を使用します。</li>
		<li>準備スタッキングのゲルの 2 mL は 1.5 mL の水、アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 0.33 mL、1 M トリス pH 6.8 の 0.25 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.02 mL、TEMED 0.002 mL を使用します。ゲルのサイズは 7.3 cm × 8.2 cm 0.075 × cm (w x d x l)。 注:感度を最高厚さ 0.75 mm の 15 も櫛を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>読み込みバッファーと DNA サンプルを 1.5 mL 遠心チューブ (例えば5 μ L の DNA のサンプルを 6 x の読み込みバッファーの使用 1 μ) x 6 の適切な量を追加します。</li>
	<li>垂直電気泳動室にゲルを配置します。<ol>
<li>2 ゲルを実行する 1 x TAE バッファーの 750 mL で部屋を満たします。50 の 1 L を準備する x TAE、トリス基地の 442 g、氷酢酸、57.1 mL と 0.5 M EDTA pH 8 の 100 mL を使用します。1 L の最終巻に蒸留水を追加します。</li>
		<li>ゲルのサンプルをロードします。2 h の 100 V でゲルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>また、Sambrook14のレシピを使用して 1 x TAE agarose のゲルを準備します。<ol>
<li>1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 V で 45 分のためのゲルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NBT SG (図 1) を汚す私。
<ol><li>
アクリルアミドゲル染色します。
	<ol>
<li>ソリューションの準備: 0.1 w/v NBT と 1.2 SG x 私。 注:エチジウム ブロマイド、GelRed、SG ではなくサイバー ゴールドを使用することが可能だけど、SG の最高のパフォーマンスをしていた。</li>
		<li>1.2 16.75 mL を注ぐ x SYBR 緑のソリューションに適切なサイズの容器。 注:我々 は、コンテナーとしてピペット チップ ボックスの蓋を使用し、これらのボリュームは、このコンテナーを使用してゲルをカバーする計算されます。その寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。</li>
		<li>ソリューションをジェルします。3.25 mL 0.1 %w/v NBT 液 0.2 mM NBT を与えるための追加と 1 x (2.0 μ M に相当) SG 私最終濃度。</li>
		<li>プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。 注:プラスチック フィルムは、飛散防止のため、染色液にアルミ箔の反応を避けるために使用されます。</li>
		<li>25 分 60 rpm で軌道シェーカーを振る。</li>
		<li>アルミとプラスチック製のカバーを取り外します。最大 90 分のための日光にさらします。興味のバンドが表示されるまでは、5 分ごとに確認してください。</li>
		<li>青色光を使用するには、3 光発光ダイオード (LED) と併せて使用を準備し、ゲルの表面 (LED 光源の強度に依存します必要な時間として、継続的に染色チェック) から約 5 mm の Led を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agarose のゲル染色します。
	<ol>
<li>準備と 1% の agarose を実行するゲルの 1.4 節で説明した後 (サイズが 1 cm × 6.2 cm × 7 cm; l x 幅 x 奥行)、2.1 は、これらの変更と同じ手順に従ってください。</li>
		<li>1.2 41.9 mL を注ぐ SG x 私ピペット チップ ボックスのふたにソリューションその寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。8.1 mL 0.1 %nbt ソリューションを追加します。</li>
		<li>プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。</li>
		<li>1 h 60 rpm で軌道シェーカーを振る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. データ分析。
<ol><li>
NBT SG 私検。
	<ol>
<li>1200 dpi でスキャンすることによって、ゲルの画像を取得します。</li>
		<li>画像解析ソフトウェアをオープン。イメージ エディターを使用してイメージをまっすぐにします。画像密度測定を実行します。</li>
		<li>曲線の下の領域を計算します。DNA 濃度対最大のグラフを準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DNA の回復。
<ol><li>1 に 1% の agarose のゲルの準備のレシピを使用して x TAE が見つかりました Sambrook14。</li>
	<li>1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 ng/μ L pDJ10015プラスミッドおよび DNA ラダー図 2に与えられる方式を次の 4 μ L をロードします。100 V で 1 時間のためのゲルを実行します。</li>
	<li>マークし、2 つの 2 mL 遠心チューブの重量を量る。</li>
	<li>真ん中 2 つの同じ部分を持つためにゲルをカットします。それぞれには、はしごと異なる染色法を比較するサンプル プラスミドを含める必要があります。概略図は、図 2にあります。</li>
	<li>ステイン 1 つ NBT SG と半分ステップ 2 のように。<ol>
<li>きれいなメスを使用してプラスミッド バンドをカットします。1 つの管でゲルの部分を保存し、重量を量る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SG とゲルの他の部分を染色私 1 の 50 mL の SG x 私ソリューションと暗闇の中で (60 rpm) 1 h のためのゲルをゆっくりと振る。<ol>
<li>ジェルを transilluminator ときれいなメスを使用してプラスミッド バンドを 2 分カットを公開します。</li>
		<li>他のチューブにゲルの部分を保存し、重量を量る。 注:プロトコルは-20 ° C でチューブを維持しながらここで一時停止できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>商業ゲル抽出キットを使用してプラスミッドの抽出を行います。</li>
</ol>5. プラスミド正規化されます。
<ol><li>1.5 mL 遠心チューブに抽出されたプラスミドの 10 μ L と 60 μ L の水の種類を追加します。ミックス 60 μ 石英キュベットに譲渡または直接、Nanodrop で 2 μ L を使用します。</li>
	<li>230 に 320 の吸収スペクトルを測定 nm。次の数式を使用してサンプルのプラスミド濃度を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq1v3.jpg"> Dは適用される希釈率 (この場合は 70/10) x nm の吸収であり、50 は、dsDNA の μ g/mL への換算係数Ax 。</li>
	<li>9.1 ng/μ L のサンプルを希釈します。</li>
	<li>エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 有能なセル (例えばXL10 ゴールド) を変換次の希釈サンプルの 5 μ L を使用して井上変換手順16 。</li>
	<li>ペトリ皿のコロニーの数をカウントして、希釈します。次の数式17:とコロニー形成単位 (CFU) を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq2v2.jpg"> Dは初期の文化から適用される希釈係数です。</li>
	<li>対になっていない t 検定を実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids:+physical-chemical+characterization.">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li><li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella/mammalian+microsome+reverse+mutation+assay+(Ames+test).">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).</li><li>Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SYBR+Green-I:+a+new+fluorescent+dye+optimized+for+detection+picogram+amounts+of+DNA+in+gels.">SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels.</a> Biophys. J. 66 (A150), (1994).</li><li>Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+agarose+gels+stained+with+methylene+blue.">Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue.</a> Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).</li><li>Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterion-dye+staining+method+for+DNA+in+agarose+gels+using+crystal+violet+and+methyl+orange.">Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange.</a> Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).</li><li>Yang, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+using+a+visible+dye,+Nile+blue,+in+electrophoresed+gels.">Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels.</a> Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).</li><li>Santill&#225;n-Torres, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+stain+for+DNA+in+agarose+gels.">A novel stain for DNA in agarose gels.</a> Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).</li><li>Adkins, S., Burmeister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+in+agarose+gels+as+migrating+colored+bands:+applications+for+preparative+gels+and+educational+demonstrations.">Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations.</a> Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).</li><li>Cong, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visible+dye-based+staining+method+for+DNA+in+polyacrylamide+gels+by+ethyl+violet.">A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet.</a> Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).</li><li>Altman, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+salts+and+formazans.">Tetrazolium salts and formazans.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).</li><li>Nineham, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+formazans+and+tetrazolium+salts.">The chemistry of formazans and tetrazolium salts.</a> Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).</li><li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+imidazole-,+imidazolium,+and+tetrazolium-containing+compounds+with+DNA.">The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).</li><li>Paredes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+visible+and+selective+DNA+staining+method+in+gels+with+tetrazolium+salts.">New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts.</a> Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+protein+translocation+across+the+yeast+endoplasmic+reticulum:+ATP-dependent+post-translational+translocation+of+the+prepro-&#945;-factor.">In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-&#945;-factor.</a> Cell. 45 (3), 397-406 (1986).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brock biology of microorganisms. , (2003).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

感受性と小説 DNA 染色法は NBT が減少し、私はこの記事で紹介した SG の使用に基づいています。このプロトコルの重要なステップは、NBT SG でゲルのインキュベーション時間私ソリューションおよび NBT の濃度。Agarose のゲルのより大きい厚さのために agarose のゲルの染色時間はアクリルアミドゲルよりも長くなります。このメソッド、NBT が接触して析出物も SDS 存在下で働きません。ゲルは、紫色の背景を取得した場合別のゲルを準備することをお勧めし、露光時間を短縮します。Agarose のゲルを染色、十分な感度がない場合は、露光時間を長くことをお勧めします。感受性の欠如があり、乳白色の沈殿はゲル中に存在する場合、これは SDS 汚染の結果かもしれない。その場合は、新しいゲルを準備し、染色試薬を追加する前にそれをすすいでください。
青色 LED や太陽の下で当然のことながら青い光現在の光によって提供されるかどうか、青い光による沈殿物が発生します。このため、手法の限界は、光源です。ある光源、青の光源を使用する必要はありません、光源が均一ではない場合は、比較を行うことは不可能し、同じ理由で、それは定量化を行うことが可能ではないです。ただし、得られる結果は使用する光源によって多少異なりますなります。光源に整合性がない場合制服 (例えば日中または非均質な青色光源の光強度の変化により)、直接比較を行うことが難しくなりますまたは別で異なるサンプルの定量化回。
このメソッドでは、フィールドでの使用に最適、DNA を可視化する特殊な計測を必要はありません。量的な結果の 1 つは高解像度カメラや本研究で示したとおりオフィス スキャナーを使用できます。
おそらく 2 種類の染色技術を使用して他の生体染色を組み合わせることにより、将来的にこの技術を展開したい (例えばNBT SG Coomassie の) 同じゲルで。

生物化学および分子生物学の発展に伴い、DNA を含む研究は DNA を分析する優れたテクニックが必要。DNA 染色する最初の方法は銀染色、非常に敏感であるが、欠けている選択性および回収はできません。その後、DNA を蛍光染色の開発許可サンプル回復の可能性のある DNA の選択的定量です。DNA の定量化に使用される最初の蛍光染料の一つは、変異2エチジウム ブロマイド1、だった。しかし、今は、安全 GelRed、SYBR グリーンなどの機密性の高い蛍光染料類の改善私 (SG 私)3;しかし、すべてこれらの蛍光染料の紫外線 (UV) transilluminator または蛍光を使用する必要があります。
4メチレン ブルーとクリスタル バイオレット5,6,7,8,9, など目に見えて、DNA を染色する方法がありますが、これらのすべてに苦しむに対する感度を下げると選択性。テトラゾリウム塩有機化合物減少に影響を受け、この場合彼らは不溶性を形成し、色塩沈殿10,11。最近では、DNA の正テトラゾリウム リング12のためにバインドするいくつかの二価テトラゾリウム塩を示されています。
最近文書13を汚し、ポリアクリルアミドゲルの DNA の定量化手法を表示する方法を提案、ニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) と GelRed、臭化エチジウムなど蛍光色素と呼ばれる二価テトラゾリウム塩の還元SYBR グリーン私とサイバー金。青色のライトや日光の存在下で勤務し、品質向上と回収を許可この反応と比較して SG の使用に私 UV transilluminator。本稿の目的は、テトラゾリウムを用いた染色技術の詳細なプロトコルを提供する塩です。

<table><tbody><tr><td>Nitro blue tetrazolium</td><td>Gold Biotechnology</td><td>298-83-9</td><td>reagent used in the staining</td></tr><tr><td>SYBR Green I 10000X</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S7563</td><td>reagent used in the staining</td></tr><tr><td>Gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>used to extract plasmid from the gel in integrity assay</td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM 1331</td><td>used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay</td></tr><tr><td>Agar Agar</td><td>Merck</td><td></td><td>used to make LB-ampicillin culture plates&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1064045000</td><td>used to make LB-ampicillin culture plates&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>yeast extract</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>used to make LB-ampicillin culture plates&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>peptone</td><td>Merck</td><td>72161000</td><td>used to make LB-ampicillin culture plates&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>761</td><td>used to make polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>ammonium persulfate</td><td>Calbiochem</td><td>2310</td><td>used to make polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>invitrogen</td><td>15512-023</td><td>used to make polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>bisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>146072</td><td>used to make polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Merck</td><td>1083821000</td><td>used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td>used to make TAE buffer</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Merck</td><td>1,000,632,500</td><td>used to make TAE buffer</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Merck</td><td>16802</td><td>used to make TAE buffer</td></tr><tr><td>spectrophotometer</td><td>Tecan</td><td>infinite 200 pro</td><td>used to quantify DNA plasmid</td></tr><tr><td>water purificatiom unit</td><td>Merck</td><td>Elix 100</td><td>use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\</td></tr><tr><td>distilled water</td><td></td><td>-</td><td>used in gels, culture medium, stainings and general solutions</td></tr><tr><td>HCl</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-03</td><td>used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer</td></tr><tr><td>6X DNA loading dye</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R0610</td><td></td></tr><tr><td>5 mm Blue LED</td><td>Jinyuan electronics</td><td>SP-021</td><td>light source used in integrity assay</td></tr><tr><td>protoboard</td><td>KANDH</td><td>KH102</td><td>light source support and circuit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>9 V battery</td><td>Duracell</td><td>-</td><td>used to power the LED&#039;s</td></tr><tr><td>horizontal electrophoresis chamber</td><td>Biorad</td><td>1704486EDU</td><td>used to make and run agarose gel in integrity assay</td></tr><tr><td>vertical electrophoresis kit</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>used to run polyacrylamide gels in calibration curves</td></tr><tr><td>power supply</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td>used to power the electrophoresis</td></tr></tbody></table>

dna staining method based on formazan precipitation induced by blue light exposure

DNA 染色法、生物医学研究のため非常に重要です。色の沈殿物の形成によって肉眼に目に DNA の可視化を可能にする簡単な方法を考案しました。それは、アクリルアミドを浸漬、または agarose DNA ゲル 1 x (2.0 μ M に相当) の溶液に SYBR グリーン私 (SG 私) と紫色を作り出す 0.20 mM ニトロ ブルー テトラゾリウム塩日光に露出されたときの沈殿または具体的に青色のライト。また、提案手法を用いた染色 agarose のゲルにアンピシリン耐性プラスミドを用いた DNA 回復試験を行った。コロニーの大きい数はより伝統的な手法で得られた SG を使用して染色私は紫外光照射。説明メソッドは高速、特定、および、transilluminator なし「肉眼で見える」生体分子の可視化をできるように DNA 検出のための非毒性を安価でフィールドでの使用に適した。これらの理由から、私たちの新しい DNA 染色法の研究と業界の両方に潜在的な利点があります。

紫塩沈殿物 (質量13によって確認される) DNA があるが表示されます。実験では, DNA の梯子は較正曲線 (図 3) に読み込まれました。アクリルアミドと agarose のゲルのプロトコルが動作しますが、低強度があり agarose の長い時間がかかります。しかし、agarose のゲルの使用により、市販のキットを使用してサンプルの回復、それは抽出と干渉しません。青色 Led でこのメソッドを使用して回復したサンプルに SG に比べると質の向上がある私は transilluminator (図 4) を使用しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56528/56528fig1.jpg"> 図 1。回路図の NBT SG I DNA 染色と定量解析します。手順: A. 追加 SG 私とゲルに NBT ソリューション。B. は、太陽光や青い光にゲルを公開します。C. は、1200 dpi でゲルをスキャンします。D. 分析ゲル画像を画像処理バンド強度を取得するソフトウェアです。E. 印刷濃度印刷対強度のデータ。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56528/56528fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56528/56528fig2.jpg"> 図 2.DNA の回復と整合性の比較試金のスケマティック。A. DNA 電気泳動。B. 切削ゲル 2 個に。C. 2 つの異なる染色法で染色 (SG 私と NBT SG 私)。D. は、プラスミド DNA バンドを切断します。大腸菌 DNA 抽出キットを用いたゲル抽出手法。F. 吸光光度法測定による DNA の定量化。G. DNA 濃度の正常化 2 つの方法を比較します。H. I. コロニー カウントとデータ分析の正規化後サンプル細菌変換。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56528/56528fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56528/56528fig3.jpg"> 図 3.NBT SG i: を使用して 1500 bp の DNA の較正曲線12.5% ポリアクリルアミドゲルを DNA の梯子の異なる濃度のロードします。ゲルは 1 2 時間 100 V で実行された x TAE。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56528/56528fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56528/56528fig4.jpg"> 図 4.私と transilluminator と NBT SG i: sg の DNA 変換効率比較が可視化pDJ100 プラスミドが 1% アガロースゲルでロードされ、100 V 1 で 1 h の実行 x TAE。その後、ゲルは、2 つの半分に切られました。1 私は、NBT SG とゲルの他の半分に SG で染まっていた私。プラスミド バンド ゲル抽出キットを使用してゲルから抽出し。最後に、抽出されたプラスミドは正規化され、エシェリヒア属大腸菌の有能なセルを変換するために使用されました。変換を行った n = 3。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56528/56528fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

このメソッドにより、選択的染色とゲルの DNA の定量化 SYBR グリーンでゲルを浸す私/ニトロ ブルー テトラゾリウム ソリューションと、日光や青い光源にそれを公開します。これは表示の沈殿物を生成する、フィールドでの使用に最適の機器はほぼ不要します。

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K ビュー.  Universidad de Chile. このメソッドにより、選択的染色とゲルの DNA の定量化 SYBR グリーンでゲルを浸す私/ニトロ ブルー テトラゾリウム ソリューションと、日光や青い光源にそれを公開します。これは表示の沈殿物を生成する、フィールドでの使用に最適の機器はほぼ不要します。

ビデオ: DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

生化学

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

免疫・感染学

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper tissue penetration. However, the existing instrumentation on the market is not readily compatible with upconversion application. Therefore, modifying the commercially available instrument is essential for this research. In this paper, we first illustrate the modifications of a conventional fluorimeter and fluorescence microscope to make them compatible for photon upconversion experiments. We then describe the synthesis of a near-infrared (NIR)-triggered caged protein kinase A catalytic subunit (PKA) immobilized on a UCNP complex. Parameters for microinjection and NIR photoactivation procedures are also reported. After the caged PKA-UCNP is microinjected into REF52 fibroblast cells, the NIR irradiation, which is significantly superior to conventional UV irradiation, efficiently triggers the PKA signal transduction pathway in living cells. In addition, positive and negative control experiments confirm that the PKA-induced pathway leading to the disintegration of stress fibers is specifically triggered by NIR irradiation. Thus, the use of protein-modified UCNP provides an innovative approach to remotely control light-modulated cellular experiments, in which direct exposure to UV light must be avoided.

In this protocol, caged protein kinase A (PKA), a cellular signal transduction bioeffector, was immobilized on a nanoparticle surface, microinjected into the cytosol, and activated by the upconverted UV light from near-infrared (NIR) irradiation, inducing downstream stress fiber disintegration in the cytosol.

キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

生物工学

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

天然化合物ライブラリーの探査に適した抗バイオフィルムアッセイのプラットフォーム

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

生物学

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

要約

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エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

キナーゼのアップコンバージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

天然化合物ライブラリーの探査に適した抗バイオフィルムアッセイのプラットフォーム

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解による病原体の不活化

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

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哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

天然化合物ライブラリーの探査に適した抗バイオフィルムアッセイのプラットフォーム

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動

キナーゼのアップコンバージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解による病原体の不活化