このプロトコルは、さまざまな酵母種における細胞貯蔵脂質含有量の定量的小規模から大規模な分析を容易にし、公平かつ標準化された方法で行います。この技術は、顕微鏡画像の迅速な処理を可能にし、多様な条件下で成長した様々な変異体および細胞などのサンプルを容易に比較するための詳細な定量的出力を提供する。まず、付属のテキストプロトコルに従って、染色液、培養培地、および細胞を準備します。
実験を実行する前に、細胞が正常で、目的の成長段階にあることを確認します。次に、画像化するサンプルごとに顕微鏡カバースリップを用意します。水平に配置されたピペットチップの長い側を使用して、スライドコーティング溶液の1マイクロリットルをきれいなカバースリップに広げます。
コーティング溶液を完全に乾燥させ、カバーリップをほこりのない環境に保管します。次に、細胞培養物の光学密度を測定し、同じ増殖段階で分析される培養物について、比較可能な実験条件を確保するために、すべての試験培養物の間で同様の値に達するように試みる。次いで、1ミリリットルの細胞培養液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにピペット化する。
S.cerevisiae細胞の場合のみ、スライドコーティング溶液の5マイクロリットルをチューブにも加えます。その後、マイクロ遠心チューブのすべてを短時間渦巻き、5分間振って摂氏30度でインキュベートします。次に、各培養アリコートに1マイクロリットルの脂質染色液を加え、それらを短時間で渦液化する。
次に、細胞境界可視化液の10マイクロリットルを加え、それらを2回目に短く渦を出す。室温で3分間重力1,000倍の遠心で細胞を集めます。紡糸が終了したら、上清から950マイクロリットルを取り出し、ピペットを使用して残りの上清の細胞を再懸濁します。
次に、緻密な細胞懸濁液の2マイクロリットルをレクチンコーティングカバースリップにピペットする。次に、カバースリップをクリーンな顕微鏡スライドに置いて細胞単層を形成し、できるだけ早く顕微鏡観察に進み、イメージングにおけるアーチファクトを最小限に抑えます。顕微鏡を設置するには、サンプルや歪み結果に損傷を与える可能性のある強い光源への長時間の露出が必要です。
そのため、脂質滴定量に更に使用しない専用のサンプルスライドを用いて撮像条件を設定する。専用サンプルを位相コントラストまたは差動干渉のコントラスト顕微鏡の設定のステージに置き、細胞に焦点を当てます。顕微鏡のソフトウェアでは、Zスタックの設定を設定して、セル全体の体積にまたがるようにします。
縦の総距離はセルサイズによって異なり、光学スライスの数は目的の開口数によって異なります。次に、中心焦点面に対して相対的に移動するようにフォーカスを設定します。脂質滴を画像化するには、緑色チャネル内の光強度および露光時間を実験的に設定する。
撮像時には、BODIPYは急速に光漂白され得る非常に明るい蛍光色素である。また、露出時間を最小限に抑えて、過飽和を避けます。ブルーチャンネルに切り替える前に、最初にフルグリーンチャンネルZスタックをキャプチャして、移動式の脂質滴をぼかすのを防ぎます。
セル境界を画像化するには、青色チャネルで光強度と露光時間を実験的に設定する。可能であれば、顕微鏡制御ソフトウェアで自動実験ワークフローを設定して使用し、標準化された条件下で複数のサンプルのイメージングを容易にします。重要なのは、サンプル間で適切な比較を行えるように、すべての画像を同じ設定で取得する必要があります。
イメージング条件が最適化されたら、セルに焦点を当て、緑色と青の両方のチャネルで画像を撮ります。サンプルごとに複数の視野を画像化して、堅牢で代表的なデータを取得します。青と緑のチャンネル Z スタック画像を 16 ビットマルチレイヤー TIFF ファイルとして保存します。
必ず、対応するファイル名に緑または青の単語を含めます。ImageJで顕微鏡画像を開き、取得時に移動した細胞のかなりの数を含む画像スタックを削除します。これらは、個々のZセクションの異なる位置に表示されます。
次に、青色チャネル内の蛍光性の高い非細胞粒子を含む画像スタックを除去する。これは、多くの場合、イメージング表面の汚れや栽培媒体の不純物によって引き起こされ、その近くの細胞の検出を妨げる可能性があります。また、死んだ細胞の大部分を含む画像スタックを削除します。
これらの画像は、生細胞と比較して増加した青色蛍光を有する細胞を表示する。サンプル内のいくつかの死んだ細胞の存在は一般的に問題ではなく、これらの細胞は分析中に自動的に廃棄されますが、死んだ細胞や死んでいる細胞の中には、セグメンテーションアルゴリズムによって生細胞として認識され、報告された結果をゆがめることがあります。MATLAB で分析を開始するには、まずメイン フォルダを作成し、すべての MATLAB スクリプトをこの場所にコピーします。
次に、さまざまな酵母種の名前を持つサブフォルダを作成し、それぞれのTIFF画像をこれらの場所にコピーします。MATLAB を起動し、MAIN スクリプトを開きます。m をクリックし、スクリプトを実行します。
メニューで、分析する酵母種を選択し、画像処理を開始します。スプレッドシート エディタまたは統計パッケージを使用して、必要に応じて出力ファイルを検査および処理します。このワークフローでは、セミコロンで区切られた CSV ファイルと、検出されたセル オブジェクトと脂質の液滴を含むセグメント化された TIFF ファイルが生成されます。
ここに示されているのは、複合YES培地または定義されたEMM培地のいずれかで増殖した野生型のS.pombe細胞である。YES培地で増殖した細胞と比較して、EMM培地では細胞体積当たりの脂質滴が少なく、染色強度が高かった。また、EMM培地で形成された個々の脂質滴は大きく、全染色強度の増加を示した。
これは、EMMで増殖した細胞における保存脂質含量の増加の以前の知見と一致している。次に、これらの画像は、YES培地で増殖した指数および早期定常培養物からのS.japonicus細胞を示す。静止期に入る細胞は、細胞体積の単位当たりの脂質滴の数が著しく減少し、体積正規化された脂質液滴蛍光強度は2つの条件間でわずかに減少した。
初期の静止相脂質滴は、典型的には中程度の大きさであり、指数関数的に増殖する細胞からの液滴と比較して、適度に高い総蛍光強度を有していた。S.cerevisiae細胞は指数対定常相に成長し、静止細胞は指数成長細胞と比較して体積単位当たりの脂質滴がやや少なかった。しかし、その体積正規化された液滴蛍光強度はほぼ倍増した。
この全体的な脂質滴含有量の急激な増加は、静止期における個々の脂質滴の蛍光強度および体積がはるかに高いためであった。この手順に従うと、出力データをRなどの統計パッケージに集約して、要約結果のプロットを作成し、脂質滴含有量の観察された差異に関する統計検定を実行することができます。原則として、画像処理パイプラインは、他の微生物の脂質滴含量の分析や、他のドット状の細胞内構造の解析に使用できます。
