Name: 3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography
Uploaded: 2017-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
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携帯研究所・生体生物で EM コアと中央研究院、台北、台湾の Cryoem コアの研究を行った。仕事は、中央研究院とほとんどによって支持されました。

1. 章ショウジョウバエのティッシュ振動刃ミクロトームを使用して
<ol>
	<li>氷の上のショウジョウバエの麻酔し、4% 低融点アガロース リン酸バッファー内の 1 つの mL で各 1 つのフライを浸します。氷の上を固めるための agarose を許可します。通常、4-6 ハエが処理されます。</li>
	<li>Agarose のゲルに埋め込まれたショウジョウバエを 100 μ m の厚みでスライスをセクションし、0.1 M のリン酸バッファーで 2.5% グルタルアルデヒドを含む固定液に浸して振動刃ミクロトームを使用します。 注: は、組織のアーキテクチャは、他の方法と比べてよりそのまま残るので最寄り Vibratome 断面です。また、0.1 M のリン酸バッファーで 2.5% グルタルアルデヒドを含む固定液に IFM を解剖するには、ピンセットを解剖を使用できます。</li>
</ol>
2. 高圧凍結と凍結置換 (HPF/FS) 法による EM 試料の準備
<ol>
	<li>続いて 2 滴 (~ 100 μ L) 20 %bsa を用いたリン酸バッファーのリン酸バッファーの 3 滴 (~ 150 μ L) の組織切片を洗います。HPF の満ちているバッファーと 20 %bsa のゴールドのキャリア セクションに配置し。</li>
	<li>ユーザー マニュアルによると高圧冷凍庫にキャリアを含んでいるサンプルをロードします。</li>
	<li>フリーズの後液体窒素下でホルダーからのキャリアを解放し、-140 ° C に冷却凍結置換デバイスに転送</li>
	<li>テーブル 12% グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム 2%、0.1% アセトン酢酸ウランを含むカクテルの FS でのように、凍結置換プロトコルを実行します。</li>
	<li>慎重に針をキャリアから標本を取り外します、室温で樹脂に試料を埋め込みます。65 ° C 16 h で樹脂を重合します。 注意: 他のタイプのサンプルを準備する FS のプロトコルを変更ください。HPF/FS は微細構造を保持し、細胞内容の喪失を最小限に抑えるために好まれる。<ol>
		<li>また、化学固定のプロトコルを適用します。一晩 2.5% グルタルアルデヒドで標本を修正、バッファーで洗浄し、1% オスミウム四酸化 2 における洗浄と修正し、昇順エタノールの濃度によって脱水し潜入し、16 65 ° C で重合する前にスパー樹脂標本を埋め込むh。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 電子線トモグラフィーの標本のシリアル セクションを準備します。
<ol>
	<li>組織を含む必要なブロックの顔を公開する試料ブロックをトリミングします。</li>
	<li>金の粒子を前処理 (10 nm の直径の) 30 分洗浄 1 %bsa と PBS バッファー内の金粒子の中断と。マーカを作成する炭素皮膜で被覆された銅スロット グリッド上の金の粒子をオーバーレイします。</li>
	<li>トモグラフィー買収の視野で十分なマーカ (少なくとも 5-10 マーカー) を持っている電子顕微鏡下で確認します。</li>
	<li>200-250 nm、ウルトラミクロトームを用いた膜厚の切片をカットします。</li>
	<li>薄片の完璧なループを使用してスロット グリッドの連続切片を収集します。</li>
	<li>10 分間レイノルドの鉛クエン酸とセクションを染色します。</li>
	<li>セクションの上に基準の金粒子の第 2 層をオーバーレイします。</li>
</ol>
4. 二重傾斜電子線トモグラフィーを収集します。
<ol>
	<li>デュアル軸断層法ホルダーにグリッドに読み込むし、200 で透過型電子顕微鏡に挿入 kV。</li>
	<li>ユーセン トリック フォーカスで顕微鏡を合わせます。</li>
	<li>自動データ収集ソフトウェアを設定します。調整し、マルチ スケールの画像設定で電子ビームを揃えます。操作詳細10 (図 2) は、ユーザー マニュアルを参照してください。</li>
	<li>断層レントゲン写真撮影のコレクションの設定の下で炭素フィルムなしの空の領域でのカメラ暗いと明るい参照を取得します。</li>
	<li>低倍率でグリッド アトラスを収集します。断層レントゲン写真撮影のコレクション対象として連続切片にミトコンドリアを選択します。</li>
	<li>+60 ° と 2 ° 刻みに-60 ° からフルティルト シリーズを取得ターゲットごとに軸 A。 注: のチルト角は、試料ホルダーの設計によって機械的に制限されます。ホルダーは、高角度のビームをブロックします。</li>
	<li>2 番目のフルティルト シリーズを収集するために試料ホルダー 90 ° を回転します。新しいアトラスを取得します。対応する位置を選択し、ターゲットごとに軸 b フルティルト シリーズを取得します。 注: SerialEM、Xplore3D などの他のソフトウェア パッケージの自動データ収集があります。</li>
</ol>
5. 再構築 3 D 断層セグメントのサブボリューム ソフトウェアを使用して、
<ol>
	<li>IMOD ソフトウェア11を使用してデュアル軸の傾き画像の再構築します。
	<ol>
		<li>操作の詳細についてはユーザー マニュアルを参照してください。</li>
		<li>金マーカの位置によって個々 の傾斜シリーズで揃えます。両方の軸のため戻って投影法によってまたは同時反復再構成手法 (SIRT) 法による断層を再構築と軸 B、それぞれ (図 3)。</li>
		<li>結合の軸 A と軸 B 二重傾斜断層削減不足しているウェッジの成果物を生成します。</li>
		<li>カバー全体ミトコンドリア ボリュームの復元を取得する連続切片の二重傾斜断層が一緒に参加します。IMOD プログラムによって連続切片の間のギャップをモデル化します。</li>
		<li>結合された断層と箱ボリューム分割の必要なサイズにトリミングします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 D ソフトウェアを利用した結合されたシリアル断画像を分析します。
	<ol>
		<li>操作の詳細についてはユーザー マニュアルを参照してください。</li>
		<li>機能のコントラストを改善し背景の密度を減らすガウス フィルター (または他の目的のメソッド) で断層をフィルター処理します。</li>
		<li>手動でまたは自動的に、ミトコンドリアの微細構造をセグメント化します。</li>
		<li>3 D で検査できるようにセグメンテーション モデルを表示します。</li>
		<li>3 D で利用可能なツールを使用してムービーを生成します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

このプロトコルではショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3 D を勉強するシリアル セクション電子断層撮影法を適用するために最適化されたワークフローをについて説明します。サンプルの超微細構造の保存は、このタイプの分析の主要な技術的な挑戦です。方法論的微細構造の 2 つが最も維持するためには、手順が含まれていた。まず、組織は組織アーキテクチャを可能な限り維持するために刃ミクロトームを振動を伴うセクショニングによってサンプリングされました。第二に、HPF/FS のプロトコルは、埋め込み試料ブロックの準備の間に細胞小器官の微細構造を維持するために最適化されました。試験片は水の氷点を下げるし、損傷の微細構造1氷結晶の形成を低減、高圧力下で凍結されました。標本としては厚さ 0.1 mm を瞬時にガラス固化体し、電磁界解析のための試料ブロックを生成する置換を凍結を受けることができます。化学固定法と比較した場合、HPF/FS による微細構造の保存性の向上が認められました。この一連の手順を使用すると、サンプルの準備のため、稜膜とミトコンドリアの二重膜の保存が劇的に向上しました。
供試体の連続切片を得ることはメソッドの最も困難なステップです。断面の厚みがいずれかの 250 に制限電子ビームは貫通力を限られた、nm または 500 nm 200 で TEM を使用して kV または 300 kV、それぞれ。以上 2 μ m こと、ミトコンドリアの膜厚があるので連続切片は、フル ・ ボリュームの復元を得る必要があります。ただし、細胞小器官全体にまたがる連続切片の十分な数の回復は技術的な課題です。台形の拠点間できるだけ平らにするブロック面をトリミング スロット グリッドの複数のセクションに対応し、こうしてより大きいボリュームをカバーすることができます。さらに、薄片の完璧なループを使用してグリッドへの連続切片の転送の成功率を増加します。
シリアル セクション電子線トモグラフィーは、標準 EM コア機器で実現できます。ただし、メソッドは、技術的な制約から生じるいくつかの必然的な制限をあります。1 つは材料が必然的に結合された再建のギャップを残して、連続切片の間失われることです。第二に、達成可能である限られた角度により生じた行方不明のくさびアーティファクトです。この制限は、試料ホルダーをフル回転で電子ビームをブロックせずにできないために発生します。これらの制限にもかかわらずシリアル セクション電子線トモグラフィーは、3 D で細胞と細胞小器官の微細構造を明らかにするための十分な解像度を提供します。
低温電子断層撮影法より小さいスケールで画像化、高分子錯体とアセンブリその場でサブ断層との組み合わせで nm または 1 オングストローム未満の解像度での構造体を取得するために使用できる新たな技術再建3。断面、集束イオンビーム加工液体窒素下でこのアプリケーションでは、セルを薄くしています。断層は、化学固定、脱水、または埋め込みすることがなく本来の状態に近い分子構造を保持する、低温条件下で収集されます。スケールのもう一方の端での解像度を犠牲にして大きな組織ボリュームを分析するシリアル ブロック面走査型電子顕微鏡は魅力的なモダリティにもかかわらず4特定の計測器が必要です。

電子顕微鏡は、細胞アセンブリと細胞プロセスを実行する細胞小器官の構造のコンテキストを検討する貴重なツールです。方法は組織や細胞の微細構造とアルデヒド化学固定法のいずれかを維持するために開発されたまたは高圧によって続く (HPF) を凍結置換 (FS)1,2を凍結します。この埋め込み試料ブロック可能性があります断面、ステンド グラス、および透過型電子顕微鏡 (TEM) 観察。用いて電子顕微鏡、集束イオンビーム装置 (FIB) フライス加工, と Cryoem3,4で観察は、HPF 標本をなどの低温条件下で処理でした。
薄いセクション EM 有益な形態学的洞察力を提供しますが、結果の 2 D 画像はのみ特定断面の微細構造を明らかにできます。3 D ボリュームで微細構造を編成する方法の隠されたままです。3 つの次元の細胞の超微細構造を視覚化するために、傾斜画像のシリーズを取得され、戻ってトモグラフィー再構成5 (図 1) を生成すると予想電子断層撮影法が開発されました。二重傾斜シリーズは、サンプルの 90 ° の回転と傾きシリーズ第二弾の取得によって収集できます。これは限られたサンプリング角度に起因し、断層の解像度を向上させる行方不明ウェッジ アーティファクトを最小限に抑えます。
ここでは、シリアル セクション電子線トモグラフィーのショウジョウバエ間接飛翔筋 (IFM)6,7,8,9のミトコンドリアの微細構造の研究への応用について述べる.3 D 再構成全体ミトコンドリア (約 2.5 μ m 厚) のカバーを得るために連続切片はショウジョウバエIFM ティッシュのブロックから得られました。各セクションの自動データ収集ソフトウェアを使用して個別に採取した.トモグラフィー再構成が生成され、シリアル断層全体のミトコンドリアの再生ボリュームを取得する IMOD パッケージに参加していた。結合された断層は、3 D ソフトウェアによって分析されました。ミトコンドリアのクリステの密度は 3 次元で組織を明らかにしたセグメンテーション モデルを生成する分割されました。

<table><tbody><tr><td>vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Tissue sectioning</td></tr><tr><td>high-pressure freezer</td><td>Leica</td><td>EM HPM100</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>freeze-substitution device</td><td>Leica</td><td>EM AFS2</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Ultra-thin sectioning</td></tr><tr><td>dual-axis tomography holder</td><td>Fischione</td><td>Model 2040</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>transmission electron microscope</td><td>FEI</td><td>Tecnai F20</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 1000</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>Leginon</td><td>NRAMM/AMI</td><td>tomography collection</td><td></td></tr><tr><td>IMOD</td><td>Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td><td>Tomography reconstruction&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Avizo 3D</td><td>FEI</td><td></td><td>Tomography analysis</td></tr></tbody></table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

ミトコンドリアは、カルシウム恒常性と細胞死を調節すると同様、代謝、脂質、ATP を生成する細胞の強豪です。このオルガネラのユニークな稜が豊富な二重膜の微細構造は、生体分子を分割することで複数の機能を遂行するエレガントな配置されます。ミトコンドリアの微細構造は、様々 な機能と密接に結び付くただし、これらの構造と機能の関係の細部は記述されている初めだけです。ここでは、シリアル セクション電子線トモグラフィーのショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリアの構造を解明への応用を示す.シリアル セクション電子線トモグラフィーは、3 次元で任意の細胞構造研究に適応させること。

我々 は、そのエネルギッシュな状態や高齢化を反映したミトコンドリアのクリステの構造的特徴を分析するシリアル セクション電子線トモグラフィーを適用されます。ショウジョウバエIFM のミトコンドリア形成可能な統合を示した稜とマトリックス 3 D (図 4)7ネットワークします。さらに、ミトコンドリアの DNA 複製欠陥と老化の表現型変異ハエはタマネギのような旋回中心 (図 5)7のサブセクションに含まれるミトコンドリアを蓄積しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
図 1: フルティルト シリーズから電子トモグラフィー再構成のイラスト。実験では、電子ビームは、オブジェクトをさまざまな程度に傾けると 3 D オブジェクトを通じて渡されます。各傾斜条件の 2D プロジェクションが生成され、カメラで撮影しました。2D プロジェクションに戻って中央のスライスの定理に基づく 3 D オブジェクトを再構築する投影されます。図では、さまざまな角度の下の 1 つのディメンションに投影は元の 2D 画像に同じプロセスが表示されます。1 D のプロジェクションは、2 D イメージを再構築する使用されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
図 2: データの自動収集します。連続切片を含むスロット グリッドのアトラスを示すソフトウェアの画像ビューアーの表示、ミトコンドリアのターゲット設定と取得したマルチ スケール画像を傾けます。スケール バー = (左上パネル) 500 μ m、100 μ m (左下パネル)、1 μ m (右側のパネル)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
ショウジョウバエ間接飛翔筋単一ミトコンドリアの図 3: シリアル セクション電子線トモグラフィー(A) 2次元顕微鏡写真と、ミトコンドリアのボリューム全体を覆う連続切片から (B) 3 D 断層。Z 軸を上下に並べて表示と縦断面図を作成する (C) 結合されたシリアル セクション断層と予想されます。特に、ティッシュは、材料、結合された断層間のギャップを残しての損失をもたらした。スケール バー = 500 nm。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
図 4: 内ミトコンドリア クリステと 3 D で明らかにマトリックス ネットワークを統合されています。(A) z 軸を介してラメラ膜の間のスイッチを示すミトコンドリア電子トモグラフィー再構成のスライス。(B) 右右利きや左利きの螺旋のスイッチング パターン観測稜のイラスト。3 D (D) 稜スイッチング パターンで左利きのスパイラルを示す (C) 断層セグメンテーションを分析し、(E, F) のセグメンテーション モデルにカラー表示。断層スライス稜膜 (白密度) を渡る横のマトリックス密度 (濃い密度、赤マーク) を表示します。(G) セグメンテーション (赤) は横のマトリックス密度を示す (E) で断層のモデルと (グレー) の代表的な稜。スケールバー = 50 nm (A)、200 nm (C) と 300 nm (D、E、F、G)。図は、江らからの転載7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
図 5: 高齢化の中にミトコンドリア DNA 複製欠陥とハエで蓄積されたタマネギのような旋回コアを持つミトコンドリア。代表的な断層スライスと断面図 (上) と旋回のコアの縦断面図 (下) を示す対応するセグメンテーション (右側のパネル)。ボリューム分割は旋回中心を強調する任意の色のレンダリングが表示されます。スケール バー: 200 nm。図は、江らからの転載7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ステップ</td>
			<td colspan="2">Temp</td>
			<td colspan="2">時間</td>
			<td colspan="2">ソリューション</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">-140 ° C-9 0 ° C ~</td>
			<td colspan="2">30 分</td>
			<td colspan="2">液体窒素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 時間</td>
			<td colspan="2">FS カクテル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">--60 ° C に 90 ° C</td>
			<td colspan="2">6 時間 (5 ° C/時間)</td>
			<td colspan="2">FS カクテル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 時間</td>
			<td colspan="2">FS カクテル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">--25 ° c 60 ° C</td>
			<td colspan="2">7 時間 (5 ° C/時間)</td>
			<td colspan="2">FS カクテル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 時間</td>
			<td colspan="2">FS カクテル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C 0 ° C ~</td>
			<td colspan="2">5 時間 (5 ° C/時間)</td>
			<td colspan="2">FS カクテル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">1 時間 × 3 回</td>
			<td colspan="2">アセトン</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">室温</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">樹脂浸透</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 凍結置換プロトコル。

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3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

シリアル セクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

このプロトコルではシリアル セクション電子線トモグラフィーのショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリアの構造を解明への応用を示す.

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.5K ビュー.  National Taiwan University. このプロトコルではシリアル セクション電子線トモグラフィーのショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリアの構造を解明への応用を示す.

ビデオ: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

遺伝学

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

発生生物学

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

生物学

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

神経科学

ショウジョウバエの神経筋接合部および筋細胞における微小管ネットワークの表示

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

著者スポットライト:ショウジョウバエの神経筋接合部における微小管ネットワークの理解 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

ミトコンドリアの構造と機能の研究に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵巣

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

シリアルセクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

要約

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オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

微小断層撮影によるショウジョウバエメラノガスターの動物全体イメージング

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ミトコンドリアの構造と機能の研究に

シリアル セクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

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オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ミトコンドリアの構造と機能の研究に

シリアルセクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

微小断層撮影によるショウジョウバエメラノガスターの動物全体イメージング

電子クライオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化