Os estudos foram realizados no núcleo no Instituto de celular e biologia organísmica e o núcleo de cryo-EM da Academia Sinica, Taipei, Taiwan. O trabalho foi apoiado pela Academia Sinica e a maioria.

1. seção Drosophila tecidos usando um micrótomo lâmina vibratória
<ol>
	<li>Anestesiar a drosófila no gelo e mergulhe cada única mosca em 1 mL de agarose fusão baixa de 4% em tampão fosfato. Permitir que a agarose solidificar no gelo. Normalmente, 4-6 moscas foram processadas.</li>
	<li>Use um micrótomo lâmina vibratória para seção incorporado drosófila em fatias com 100 µm de espessura de gel de agarose e mergulhe no fixador solução contendo glutaraldeído 2,5% em tampão de fosfato 0,1 M. Nota: Vibratome de seccionamento é preferido porque a arquitetura do tecido intacto mais em comparação com outros métodos. Alternativamente, dissecando a pinça pode ser usado para dissecar IFM na fixador solução contendo glutaraldeído 2,5% em tampão de fosfato 0,1 M.</li>
</ol>
2. preparar espécimes EM pelo congelamento de alta pressão e Freeze método de substituição (HPF/FS)
<ol>
	<li>Lave os cortes histologicos em 3 gotas (~ 150 µ l) de tampão de fosfato, seguido por 2 gotas (~ 100 µ l) de tampão fosfato com 20% de BSA. Em seguida coloca seções em portadores de ouro para HPF repleto de buffer e 20% de BSA.</li>
	<li>Carrega a amostra contendo as transportadoras em um freezer de alta pressão, de acordo com o manual do usuário.</li>
	<li>Após a congelação, liberar as transportadoras do titular sob nitrogênio líquido e transferir para um dispositivo de congelamento-substituição de refrigeração de-140 º C.</li>
	<li>Execute o protocolo de congelamento-substituição conforme mostrado na tabela 1, com o FS cocktail contendo 2% de glutaraldeído, tetróxido de ósmio de 2% e 0,1% de acetato de uranilo em acetona.</li>
	<li>Retire os espécimes das transportadoras com uma agulha cuidadosamente e incorporar amostras em resina à temperatura ambiente. Polimerizar a resina a 65 ° C durante 16 h. Nota: Os protocolos FS devem ser modificados para preparar outros tipos de amostras. HPF/FS é preferido para preservar a ultraestrutura e minimizar a perda do conteúdo celular.<ol>
		<li>Como alternativa, aplica um protocolo de fixação química. Fixar espécimes com glutaraldeído 2,5% durante a noite, lavar com buffers e depois corrigir com tetróxido de ósmio 1% para 2 h. lavagem e desidratam com crescente concentração de etanol e então se infiltrar e incorporar amostras em resina do Spurr antes de polimerização a 65 ° C para 16 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. prepare Serial-seções dos espécimes para tomografia computadorizada de elétron
<ol>
	<li>Apare os blocos da amostra para expor a face do bloco desejado que contém o tecido.</li>
	<li>Pré-tratamento com partículas de ouro (10 nm de diâmetro) com 1% de BSA de 30 min. lavagem e suspender as partículas de ouro em tampão PBS. Sobreposição de partículas de ouro em grades de slot cobre revestidos com película de carbono para criar marcadores fiduciais.</li>
	<li>Verifique sob temperatura ter marcadores fiduciais suficientes (pelo menos 5-10 marcadores) no campo de visão de aquisição de tomografia computadorizada.</li>
	<li>Seções de seriais, 200-250 nm de espessura, usando um ultramicrotome de corte.</li>
	<li>Recolha seções seriais em grades de slot usando um loop perfeito para seções finas.</li>
	<li>Manche as seções com citrato de chumbo de Reynold por 10 min.</li>
	<li>Sobreposição de uma segunda camada de partículas de ouro fiduciais no topo as seções.</li>
</ol>
4. colete dupla inclinação elétron Tomography
<ol>
	<li>Carregar a grade de um suporte de tomografia computadorizada de eixo duplo e inserir o microscópio eletrônico de transmissão operando a 200 kV.</li>
	<li>Alinhe o microscópio no foco eucentric.</li>
	<li>Configure o software de coleta de dados automática. Ajustar e alinhar o feixe de elétrons no ajuste de imagem multi-escala. Consulte o manual do usuário para operação detalhe10 (Figura 2).</li>
	<li>Adquira a câmera escura e brilhante referências em um espaço vazio sem película de carbono sob a configuração de coleção de tomografia computadorizada.</li>
	<li>Colete um atlas e grade baixa ampliação. Selecione as mitocôndrias em seções seriais como alvos para coleção de tomografia computadorizada.</li>
	<li>Adquirir uma série de inclinação de-60 ° a + 60 ° com incrementos de 2 ° no eixo-A para cada destino. Nota: Os ângulos de inclinação vão ser restrita mecanicamente pelo design do porta-amostra. O titular irá bloquear o feixe em ângulos de inclinação elevada.</li>
	<li>Para coletar a segunda série de inclinação, gire o suporte de amostra de 90°. Adquira um novo atlas. Selecione posições correspondentes e adquirir a série de inclinação no eixo-B para cada destino. Nota: Outros pacotes de software, tais como SerialEM e Xplore3D, estão disponíveis para coleta de dados automática.</li>
</ol>
5. reconstruir Tomograms 3D e volumes sub segmento usando Software
<ol>
	<li>Reconstrua tomograms de inclinação de eixo duplo imagens usando IMOD software11.
	<ol>
		<li>Consulte o manual do usuário para detalhes de operação.</li>
		<li>Alinhe a inclinação individual série pelas posições de ouro marcadores fiduciais. Reconstruir tomograms ou pelo método de projeção volta ou pelo método simultâneo iterativo reconstrução técnica (SIRT) para ambos os eixos-A e B-eixo, respectivamente (Figura 3).</li>
		<li>Combine tomograms de eixo-A e B-eixo para gerar uma tomografia de dupla inclinação com reduzida faltando artefato de cunha.</li>
		<li>Unir a dupla inclinação tomograms serial seções para obter reconstruções cobrindo o volume inteiro da mitocôndria. Modele as lacunas entre as seções seriais pelo programa IMOD.</li>
		<li>Apare o tomograms se juntou e bin para um tamanho desejado para segmentação de volume.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analise se juntou tomograms serial usando software 3D.
	<ol>
		<li>Consulte o manual do usuário para detalhes de operação.</li>
		<li>Filtre o tomograms com um filtro gaussiano (ou outro método desejado) para melhorar o contraste dos recursos e reduzir as densidades de fundo.</li>
		<li>Segmente a ultraestrutura mitocondrial manualmente ou automaticamente.</li>
		<li>Exibir modelos de segmentação para permitir a inspecção em 3D.</li>
		<li>Gere filmes usando ferramentas disponíveis em 3D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Neste protocolo, descrevemos um fluxo de trabalho otimizado para a aplicação de tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar 3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto de Drosophila . Preservação da ultraestrutura na amostra é o principal desafio técnico para este tipo de análise. Para melhor preservar a ultraestrutura dois metodológicas passos foram incluídos. Primeiro, o tecido foi sampleado por seccionamento com micrótomo de lâmina de vibração, a fim de manter a arquitetura do tecido tanto quanto possível. Em segundo lugar, um protocolo de HPF/FS foi otimizado para preservar a ultraestrutura organela durante a preparação dos blocos da amostra incorporado. Espécimes foram congelados sob alta pressão, que abaixa o ponto de congelamento da água e reduz a formação de cristais de gelo que danificam a ultraestrutura1. Espécimes tão grossos como 0,1 mm podem ser vitrificados instantaneamente e em seguida submetidos para congelar a substituição para gerar blocos de amostra para análise EM. Melhor preservação da ultraestrutura HPF/FS observou-se, quando comparado aos métodos de fixação química. Preservação das membranas mitocondriais de duplas e membranas de cristas usando esta série de etapas para a preparação da amostra, foi drasticamente melhorada.
Obtenção de secções seriais do espécime é a etapa mais desafiadora do método. Como o feixe de elétrons tem limitado o poder de penetração, a espessura da seção é restrita a qualquer 250 nm ou 500 nm, utilizando uma temperatura de funcionamento em 200 kV ou 300 kV, respectivamente. Porque a espessura de uma mitocôndria pode ser superior a 2 µm, seções seriais são necessários para obter reconstruções de volume completo. No entanto, recuperar um número suficiente de seções seriais para abranger uma organela inteira é um desafio técnico. Aparar a face do bloco para ser tão liso quanto possível entre as bases do trapézio pode permitir que uma grade de slot acomodar mais seções e, assim, cobrir a volumes maiores. Além disso, usando um loop perfeito para seções finas aumenta a taxa de sucesso de transferir as seções seriais para a grade.
Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser realizada com equipamento de núcleo EM padrão. No entanto, o método tem algumas limitações inevitáveis que surgem a partir as limitações técnicas. Uma é que o material é inevitavelmente perdido entre seções seriais, deixando lacunas na reconstrução se juntou. Em segundo lugar está o artefato ausente da Cunha, que surge devido os ângulos de inclinação limitado que são realizáveis. Essa restrição ocorre porque o suporte de amostra não pode ser transformado em uma rotação completa sem bloquear o feixe de elétrons. Apesar dessas limitações, a tomografia computadorizada serial-seção elétron fornece resolução suficiente para revelar a ultraestrutura celular e das organelas em 3D.
Para a imagem latente de escala menor, tomografia computadorizada do cryo-elétron é uma tecnologia emergente que pode ser usada para obter a estrutura macromolecular complexos e montagens em situ em resolução nm ou sub angstrom em combinação com subtomográfica reconstrução3. Nesta aplicação, as células são diluídas por corte ou por feixe de íon focalizado sob nitrogênio líquido de moagem. Os tomograms são coletados sob condições de cryo onde estruturas moleculares são preservadas perto do estado nativo sem fixação química, desidratação ou incorporação. No extremo oposto da escala, para analisar volumes grandes de tecido, em detrimento da resolução, serial bloco-rosto microscopia eletrônica é uma modalidade de atraente mesmo que requer um instrumento específico4.

Microscopia eletrônica é uma ferramenta valiosa para estudar o contexto estrutural de organelas que executam processos celulares e subcelulares assemblies. Métodos têm sido desenvolvidos para preservar a ultraestrutura dos tecidos ou células ou por fixação química com aldeídos ou pela alta pressão frio (HPF) seguido por congelar a substituição (FS)1,2. Os blocos da amostra incorporado podem então ser seccionados, manchados e observados com um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O espécime de HPF também poderia ser processado sob cryo-condição, tais como secionando cryo ou pelo feixe de íon focalizado (FIB) moagem e observado pela cryo-EM3,4.
Embora EM fino-seção fornece introspecções morfológicas informativas, as imagens 2D resultantes só podem revelar a ultraestrutura de uma secção específica. Como a ultraestrutura é organizada em um volume 3D permanece obscurecida. Para visualizar a ultraestrutura celular em três dimensões, um método de tomografia computadorizada do elétron foi desenvolvido onde série de imagens de inclinação foram adquirido e volta projetada para gerar uma reconstrução tomográfica5 (Figura 1). Uma série de dupla inclinação pode ser coletada pela amostra de 90° de giro e aquisição de uma segunda série de inclinação. Isto minimizará faltando-Cunha artefatos que resultam de ângulos de amostragem limitada e melhorar a resolução da tomografia.
Aqui, descrevemos a aplicação da tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar a ultraestrutura mitocondrial de Drosophila voo indirecto muscular (IFM)6,7,8,9 . A fim de obter reconstruções 3D cobrindo toda mitocôndria (aproximadamente 2,5 µm de espessura), seriais seções foram obtidas de blocos de tecido IFM de Drosophila . Tomograms de cada seção foram coletados individualmente usando software de coleta de dados automática. Reconstruções tomográficas foram geradas e seriais tomograms juntaram-se com o pacote IMOD para obter um volume reconstruído de uma mitocôndria inteira. Os tomograms apensos foram analisados pelo software 3D. As densidades de cristas mitocondriais foram segmentadas para gerar um modelo de segmentação que revelou a organização em três dimensões.

<table><tbody><tr><td>vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Tissue sectioning</td></tr><tr><td>high-pressure freezer</td><td>Leica</td><td>EM HPM100</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>freeze-substitution device</td><td>Leica</td><td>EM AFS2</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Ultra-thin sectioning</td></tr><tr><td>dual-axis tomography holder</td><td>Fischione</td><td>Model 2040</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>transmission electron microscope</td><td>FEI</td><td>Tecnai F20</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 1000</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>Leginon</td><td>NRAMM/AMI</td><td>tomography collection</td><td></td></tr><tr><td>IMOD</td><td>Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td><td>Tomography reconstruction&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Avizo 3D</td><td>FEI</td><td></td><td>Tomography analysis</td></tr></tbody></table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

As mitocôndrias são potências celulares que produzem ATP, lipídios e metabólitos, bem como regulam a morte de homeostase e celular de cálcio. A ultraestrutura exclusivos ricos em cristas de membrana dupla desta organela é elegantemente disposta a desempenhar as múltiplas funções de particionamento de biomoléculas. Ultraestrutura mitocondrial está intimamente ligada com várias funções; no entanto, os detalhes dessas relações estrutura-função estão apenas começando a ser descrito. Aqui, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila . Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser adaptada para estudar qualquer estrutura celular em três dimensões.

Nós aplicamos a tomografia computadorizada serial-seção elétron para analisar as características estruturais das cristas mitocondriais que reflete seu estado energético e envelhecimento. Nós mostramos que as mitocôndrias de Drosophila IFM formam um sistema integrado de rede cristas e a matriz em 3D (Figura 4)7. Além disso, moscas mutantes com defeito de replicação de DNA mitocondrial e um fenótipo de envelhecimento acelerado acumularam mitocôndrias que continha subseções da cebola, como roda de núcleo (Figura 5)7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
Figura 1: ilustração da reconstrução de tomografia computadorizada de elétron de uma série de inclinação. No experimento, um feixe de elétrons é passado através de um objeto 3D quando o objeto é inclinado para vários graus. Para cada condição de inclinação, uma projeção 2D é gerada e capturada com uma câmera. As projecções 2D volta então são projetadas para reconstruir o objeto 3D baseado no teorema da fatia central. Na ilustração, o mesmo processo é mostrado para uma imagem 2D original que é projectada em uma única dimensão sob vários ângulos de inclinação. As projeções de 1D são usadas para reconstruir a imagem 2D. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
Figura 2: coleta de dados automática. Uma exibição de visualizador de imagem de software mostrando o atlas de uma grade de slot que contém seções seriais, multi-escala, direcionamento de mitocôndrias e adquiriu inclina imagens. Barra de escala = 500 µm (painel superior esquerdo), 100 µm (painel inferior esquerdo), 1 µm (painel direito). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
Figura 3: Tomografia Serial-seção de elétron de uma única mitocôndria no músculo de voo indirecto de Drosophila . 2D micrografias (A) e (B) tomograms 3D da série seções cobrindo todo o volume de uma mitocôndria. (C), juntou-se a série-seção tomograms são projetados para criar uma secção longitudinal, com o eixo z mostrado verticalmente. Notadamente, tecido corte levou à perda de material, deixando lacunas entre tomograms juntou-se. Barra de escala = 500 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
Figura 4: cristas intramitocôndrias e rede matriz revelada em 3D integrados. (A) fatias de reconstruções tomográficas de elétrons mitocondrial mostrando alterna entre membranas lamelares através do eixo z. (B) ilustrações das cristas observadas padrões de espirais bem destros ou canhotos de comutação. (C) segmentação tomográfica ilustrando uma espiral canhota em 3D (D) cristas comutação padrões foram analisados e processados de cor sobre o modelo de segmentação (E, F). Tomográfica fatia mostrando a matriz lateral confluência (escuras densidades, marcado a vermelho) através de membranas de cristas (densidades brancas). (G) segmentação modelo de tomografia, em (E), mostrando a confluência de matriz lateral (em vermelho) e cristas representante (em cinza). Barra de escala = 50 nm (A), 200 nm (C) e 300 nm (D, E, F, G). A figura foi a reimpressão de Jiang et al . 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
Figura 5: mitocôndrias com cebola-como núcleos roda acumularam em moscas com defeitos de replicação de DNA mitocondriais durante o envelhecimento. Tomográficos representativos e a segmentação correspondente (painéis de direita), mostrando uma visão transversal (topo) e uma vista de corte longitudinal (fundo) de um núcleo roda. Segmentação de volume é indicada pela rendição de cor arbitrária para destacar o núcleo da rodando. Barra de escala: 200 nm. A figura foi a reimpressão de Jiang et al . 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Passo</td>
			<td colspan="2">Temp</td>
			<td colspan="2">Tempo</td>
			<td colspan="2">Solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">-140 ° C e 0-9 ° C</td>
			<td colspan="2">30 min</td>
			<td colspan="2">Nitrogênio líquido</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 h</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 hr</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 ° C a-25 ° C</td>
			<td colspan="2">7 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 hr</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C a 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">hr 1 x 3 vezes</td>
			<td colspan="2">Acetona</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">Temperatura ambiente</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Infiltração de resina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Protocolo de congelamento-substituição.

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3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

Neste protocolo, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila .

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.5K visualizações.  National Taiwan University. Neste protocolo, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila .

Vídeo: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genética

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Biologia do Desenvolvimento

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Biologia

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Neurociência

Visualização de redes de microtúbulos em junções neuromusculares e células musculares de Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor em destaque: Compreendendo a rede de microtúbulos nas junções neuromusculares de Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Estudar mitocondrial estrutura e função em<em&gt; Drosophila</em&gt; ovários

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Estudar mitocondrial estrutura e função em