Os estudos foram realizados no núcleo no Instituto de celular e biologia organísmica e o núcleo de cryo-EM da Academia Sinica, Taipei, Taiwan. O trabalho foi apoiado pela Academia Sinica e a maioria.

1. seção Drosophila tecidos usando um micrótomo lâmina vibratória
<ol>
	<li>Anestesiar a drosófila no gelo e mergulhe cada única mosca em 1 mL de agarose fusão baixa de 4% em tampão fosfato. Permitir que a agarose solidificar no gelo. Normalmente, 4-6 moscas foram processadas.</li>
	<li>Use um micrótomo lâmina vibratória para seção incorporado drosófila em fatias com 100 µm de espessura de gel de agarose e mergulhe no fixador solução contendo glutaraldeído 2,5% em tampão de fosfato 0,1 M. Nota: Vibratome de seccionamento é preferido porque a arquitetura do tecido intacto mais em comparação com outros métodos. Alternativamente, dissecando a pinça pode ser usado para dissecar IFM na fixador solução contendo glutaraldeído 2,5% em tampão de fosfato 0,1 M.</li>
</ol>
2. preparar espécimes EM pelo congelamento de alta pressão e Freeze método de substituição (HPF/FS)
<ol>
	<li>Lave os cortes histologicos em 3 gotas (~ 150 µ l) de tampão de fosfato, seguido por 2 gotas (~ 100 µ l) de tampão fosfato com 20% de BSA. Em seguida coloca seções em portadores de ouro para HPF repleto de buffer e 20% de BSA.</li>
	<li>Carrega a amostra contendo as transportadoras em um freezer de alta pressão, de acordo com o manual do usuário.</li>
	<li>Após a congelação, liberar as transportadoras do titular sob nitrogênio líquido e transferir para um dispositivo de congelamento-substituição de refrigeração de-140 º C.</li>
	<li>Execute o protocolo de congelamento-substituição conforme mostrado na tabela 1, com o FS cocktail contendo 2% de glutaraldeído, tetróxido de ósmio de 2% e 0,1% de acetato de uranilo em acetona.</li>
	<li>Retire os espécimes das transportadoras com uma agulha cuidadosamente e incorporar amostras em resina à temperatura ambiente. Polimerizar a resina a 65 ° C durante 16 h. Nota: Os protocolos FS devem ser modificados para preparar outros tipos de amostras. HPF/FS é preferido para preservar a ultraestrutura e minimizar a perda do conteúdo celular.<ol>
		<li>Como alternativa, aplica um protocolo de fixação química. Fixar espécimes com glutaraldeído 2,5% durante a noite, lavar com buffers e depois corrigir com tetróxido de ósmio 1% para 2 h. lavagem e desidratam com crescente concentração de etanol e então se infiltrar e incorporar amostras em resina do Spurr antes de polimerização a 65 ° C para 16 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. prepare Serial-seções dos espécimes para tomografia computadorizada de elétron
<ol>
	<li>Apare os blocos da amostra para expor a face do bloco desejado que contém o tecido.</li>
	<li>Pré-tratamento com partículas de ouro (10 nm de diâmetro) com 1% de BSA de 30 min. lavagem e suspender as partículas de ouro em tampão PBS. Sobreposição de partículas de ouro em grades de slot cobre revestidos com película de carbono para criar marcadores fiduciais.</li>
	<li>Verifique sob temperatura ter marcadores fiduciais suficientes (pelo menos 5-10 marcadores) no campo de visão de aquisição de tomografia computadorizada.</li>
	<li>Seções de seriais, 200-250 nm de espessura, usando um ultramicrotome de corte.</li>
	<li>Recolha seções seriais em grades de slot usando um loop perfeito para seções finas.</li>
	<li>Manche as seções com citrato de chumbo de Reynold por 10 min.</li>
	<li>Sobreposição de uma segunda camada de partículas de ouro fiduciais no topo as seções.</li>
</ol>
4. colete dupla inclinação elétron Tomography
<ol>
	<li>Carregar a grade de um suporte de tomografia computadorizada de eixo duplo e inserir o microscópio eletrônico de transmissão operando a 200 kV.</li>
	<li>Alinhe o microscópio no foco eucentric.</li>
	<li>Configure o software de coleta de dados automática. Ajustar e alinhar o feixe de elétrons no ajuste de imagem multi-escala. Consulte o manual do usuário para operação detalhe10 (Figura 2).</li>
	<li>Adquira a câmera escura e brilhante referências em um espaço vazio sem película de carbono sob a configuração de coleção de tomografia computadorizada.</li>
	<li>Colete um atlas e grade baixa ampliação. Selecione as mitocôndrias em seções seriais como alvos para coleção de tomografia computadorizada.</li>
	<li>Adquirir uma série de inclinação de-60 ° a + 60 ° com incrementos de 2 ° no eixo-A para cada destino. Nota: Os ângulos de inclinação vão ser restrita mecanicamente pelo design do porta-amostra. O titular irá bloquear o feixe em ângulos de inclinação elevada.</li>
	<li>Para coletar a segunda série de inclinação, gire o suporte de amostra de 90°. Adquira um novo atlas. Selecione posições correspondentes e adquirir a série de inclinação no eixo-B para cada destino. Nota: Outros pacotes de software, tais como SerialEM e Xplore3D, estão disponíveis para coleta de dados automática.</li>
</ol>
5. reconstruir Tomograms 3D e volumes sub segmento usando Software
<ol>
	<li>Reconstrua tomograms de inclinação de eixo duplo imagens usando IMOD software11.
	<ol>
		<li>Consulte o manual do usuário para detalhes de operação.</li>
		<li>Alinhe a inclinação individual série pelas posições de ouro marcadores fiduciais. Reconstruir tomograms ou pelo método de projeção volta ou pelo método simultâneo iterativo reconstrução técnica (SIRT) para ambos os eixos-A e B-eixo, respectivamente (Figura 3).</li>
		<li>Combine tomograms de eixo-A e B-eixo para gerar uma tomografia de dupla inclinação com reduzida faltando artefato de cunha.</li>
		<li>Unir a dupla inclinação tomograms serial seções para obter reconstruções cobrindo o volume inteiro da mitocôndria. Modele as lacunas entre as seções seriais pelo programa IMOD.</li>
		<li>Apare o tomograms se juntou e bin para um tamanho desejado para segmentação de volume.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analise se juntou tomograms serial usando software 3D.
	<ol>
		<li>Consulte o manual do usuário para detalhes de operação.</li>
		<li>Filtre o tomograms com um filtro gaussiano (ou outro método desejado) para melhorar o contraste dos recursos e reduzir as densidades de fundo.</li>
		<li>Segmente a ultraestrutura mitocondrial manualmente ou automaticamente.</li>
		<li>Exibir modelos de segmentação para permitir a inspecção em 3D.</li>
		<li>Gere filmes usando ferramentas disponíveis em 3D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Neste protocolo, descrevemos um fluxo de trabalho otimizado para a aplicação de tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar 3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto de Drosophila . Preservação da ultraestrutura na amostra é o principal desafio técnico para este tipo de análise. Para melhor preservar a ultraestrutura dois metodológicas passos foram incluídos. Primeiro, o tecido foi sampleado por seccionamento com micrótomo de lâmina de vibração, a fim de manter a arquitetura do tecido tanto quanto possível. Em segundo lugar, um protocolo de HPF/FS foi otimizado para preservar a ultraestrutura organela durante a preparação dos blocos da amostra incorporado. Espécimes foram congelados sob alta pressão, que abaixa o ponto de congelamento da água e reduz a formação de cristais de gelo que danificam a ultraestrutura1. Espécimes tão grossos como 0,1 mm podem ser vitrificados instantaneamente e em seguida submetidos para congelar a substituição para gerar blocos de amostra para análise EM. Melhor preservação da ultraestrutura HPF/FS observou-se, quando comparado aos métodos de fixação química. Preservação das membranas mitocondriais de duplas e membranas de cristas usando esta série de etapas para a preparação da amostra, foi drasticamente melhorada.
Obtenção de secções seriais do espécime é a etapa mais desafiadora do método. Como o feixe de elétrons tem limitado o poder de penetração, a espessura da seção é restrita a qualquer 250 nm ou 500 nm, utilizando uma temperatura de funcionamento em 200 kV ou 300 kV, respectivamente. Porque a espessura de uma mitocôndria pode ser superior a 2 µm, seções seriais são necessários para obter reconstruções de volume completo. No entanto, recuperar um número suficiente de seções seriais para abranger uma organela inteira é um desafio técnico. Aparar a face do bloco para ser tão liso quanto possível entre as bases do trapézio pode permitir que uma grade de slot acomodar mais seções e, assim, cobrir a volumes maiores. Além disso, usando um loop perfeito para seções finas aumenta a taxa de sucesso de transferir as seções seriais para a grade.
Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser realizada com equipamento de núcleo EM padrão. No entanto, o método tem algumas limitações inevitáveis que surgem a partir as limitações técnicas. Uma é que o material é inevitavelmente perdido entre seções seriais, deixando lacunas na reconstrução se juntou. Em segundo lugar está o artefato ausente da Cunha, que surge devido os ângulos de inclinação limitado que são realizáveis. Essa restrição ocorre porque o suporte de amostra não pode ser transformado em uma rotação completa sem bloquear o feixe de elétrons. Apesar dessas limitações, a tomografia computadorizada serial-seção elétron fornece resolução suficiente para revelar a ultraestrutura celular e das organelas em 3D.
Para a imagem latente de escala menor, tomografia computadorizada do cryo-elétron é uma tecnologia emergente que pode ser usada para obter a estrutura macromolecular complexos e montagens em situ em resolução nm ou sub angstrom em combinação com subtomográfica reconstrução3. Nesta aplicação, as células são diluídas por corte ou por feixe de íon focalizado sob nitrogênio líquido de moagem. Os tomograms são coletados sob condições de cryo onde estruturas moleculares são preservadas perto do estado nativo sem fixação química, desidratação ou incorporação. No extremo oposto da escala, para analisar volumes grandes de tecido, em detrimento da resolução, serial bloco-rosto microscopia eletrônica é uma modalidade de atraente mesmo que requer um instrumento específico4.

Microscopia eletrônica é uma ferramenta valiosa para estudar o contexto estrutural de organelas que executam processos celulares e subcelulares assemblies. Métodos têm sido desenvolvidos para preservar a ultraestrutura dos tecidos ou células ou por fixação química com aldeídos ou pela alta pressão frio (HPF) seguido por congelar a substituição (FS)1,2. Os blocos da amostra incorporado podem então ser seccionados, manchados e observados com um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O espécime de HPF também poderia ser processado sob cryo-condição, tais como secionando cryo ou pelo feixe de íon focalizado (FIB) moagem e observado pela cryo-EM3,4.
Embora EM fino-seção fornece introspecções morfológicas informativas, as imagens 2D resultantes só podem revelar a ultraestrutura de uma secção específica. Como a ultraestrutura é organizada em um volume 3D permanece obscurecida. Para visualizar a ultraestrutura celular em três dimensões, um método de tomografia computadorizada do elétron foi desenvolvido onde série de imagens de inclinação foram adquirido e volta projetada para gerar uma reconstrução tomográfica5 (Figura 1). Uma série de dupla inclinação pode ser coletada pela amostra de 90° de giro e aquisição de uma segunda série de inclinação. Isto minimizará faltando-Cunha artefatos que resultam de ângulos de amostragem limitada e melhorar a resolução da tomografia.
Aqui, descrevemos a aplicação da tomografia computadorizada serial-seção elétron para estudar a ultraestrutura mitocondrial de Drosophila voo indirecto muscular (IFM)6,7,8,9 . A fim de obter reconstruções 3D cobrindo toda mitocôndria (aproximadamente 2,5 µm de espessura), seriais seções foram obtidas de blocos de tecido IFM de Drosophila . Tomograms de cada seção foram coletados individualmente usando software de coleta de dados automática. Reconstruções tomográficas foram geradas e seriais tomograms juntaram-se com o pacote IMOD para obter um volume reconstruído de uma mitocôndria inteira. Os tomograms apensos foram analisados pelo software 3D. As densidades de cristas mitocondriais foram segmentadas para gerar um modelo de segmentação que revelou a organização em três dimensões.

<table width="852">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:252px;height:40px;">vibrating blade microtome</td>
			<td style="width:123px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:267px;">VT1200S</td>
			<td style="width:212px;">Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">high-pressure freezer</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM HPM100</td>
			<td>Specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freeze-substitution device</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM AFS2</td>
			<td>Specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ultramicrotome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>Ultra-thin sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dual-axis tomography holder</td>
			<td>Fischione&#160;</td>
			<td>Model 2040</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">transmission electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td>&#160;Tecnai F20</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD</td>
			<td>Gatan&#160;</td>
			<td>UltraScan 1000</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leginon</td>
			<td colspan="2" style="width:388px;">NRAMM/AMI</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IMOD</td>
			<td colspan="2" style="width:388px;">Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td>Tomography reconstruction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Avizo 3D</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Tomography analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

As mitocôndrias são potências celulares que produzem ATP, lipídios e metabólitos, bem como regulam a morte de homeostase e celular de cálcio. A ultraestrutura exclusivos ricos em cristas de membrana dupla desta organela é elegantemente disposta a desempenhar as múltiplas funções de particionamento de biomoléculas. Ultraestrutura mitocondrial está intimamente ligada com várias funções; no entanto, os detalhes dessas relações estrutura-função estão apenas começando a ser descrito. Aqui, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila . Tomografia computadorizada serial-seção elétron pode ser adaptada para estudar qualquer estrutura celular em três dimensões.

Nós aplicamos a tomografia computadorizada serial-seção elétron para analisar as características estruturais das cristas mitocondriais que reflete seu estado energético e envelhecimento. Nós mostramos que as mitocôndrias de Drosophila IFM formam um sistema integrado de rede cristas e a matriz em 3D (Figura 4)7. Além disso, moscas mutantes com defeito de replicação de DNA mitocondrial e um fenótipo de envelhecimento acelerado acumularam mitocôndrias que continha subseções da cebola, como roda de núcleo (Figura 5)7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
Figura 1: ilustração da reconstrução de tomografia computadorizada de elétron de uma série de inclinação. No experimento, um feixe de elétrons é passado através de um objeto 3D quando o objeto é inclinado para vários graus. Para cada condição de inclinação, uma projeção 2D é gerada e capturada com uma câmera. As projecções 2D volta então são projetadas para reconstruir o objeto 3D baseado no teorema da fatia central. Na ilustração, o mesmo processo é mostrado para uma imagem 2D original que é projectada em uma única dimensão sob vários ângulos de inclinação. As projeções de 1D são usadas para reconstruir a imagem 2D. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
Figura 2: coleta de dados automática. Uma exibição de visualizador de imagem de software mostrando o atlas de uma grade de slot que contém seções seriais, multi-escala, direcionamento de mitocôndrias e adquiriu inclina imagens. Barra de escala = 500 µm (painel superior esquerdo), 100 µm (painel inferior esquerdo), 1 µm (painel direito). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
Figura 3: Tomografia Serial-seção de elétron de uma única mitocôndria no músculo de voo indirecto de Drosophila . 2D micrografias (A) e (B) tomograms 3D da série seções cobrindo todo o volume de uma mitocôndria. (C), juntou-se a série-seção tomograms são projetados para criar uma secção longitudinal, com o eixo z mostrado verticalmente. Notadamente, tecido corte levou à perda de material, deixando lacunas entre tomograms juntou-se. Barra de escala = 500 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
Figura 4: cristas intramitocôndrias e rede matriz revelada em 3D integrados. (A) fatias de reconstruções tomográficas de elétrons mitocondrial mostrando alterna entre membranas lamelares através do eixo z. (B) ilustrações das cristas observadas padrões de espirais bem destros ou canhotos de comutação. (C) segmentação tomográfica ilustrando uma espiral canhota em 3D (D) cristas comutação padrões foram analisados e processados de cor sobre o modelo de segmentação (E, F). Tomográfica fatia mostrando a matriz lateral confluência (escuras densidades, marcado a vermelho) através de membranas de cristas (densidades brancas). (G) segmentação modelo de tomografia, em (E), mostrando a confluência de matriz lateral (em vermelho) e cristas representante (em cinza). Barra de escala = 50 nm (A), 200 nm (C) e 300 nm (D, E, F, G). A figura foi a reimpressão de Jiang et al . 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
Figura 5: mitocôndrias com cebola-como núcleos roda acumularam em moscas com defeitos de replicação de DNA mitocondriais durante o envelhecimento. Tomográficos representativos e a segmentação correspondente (painéis de direita), mostrando uma visão transversal (topo) e uma vista de corte longitudinal (fundo) de um núcleo roda. Segmentação de volume é indicada pela rendição de cor arbitrária para destacar o núcleo da rodando. Barra de escala: 200 nm. A figura foi a reimpressão de Jiang et al . 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Passo</td>
			<td colspan="2">Temp</td>
			<td colspan="2">Tempo</td>
			<td colspan="2">Solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">-140 ° C e 0-9 ° C</td>
			<td colspan="2">30 min</td>
			<td colspan="2">Nitrogênio líquido</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 h</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 hr</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 ° C a-25 ° C</td>
			<td colspan="2">7 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 hr</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C a 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">Cocktail de FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">hr 1 x 3 vezes</td>
			<td colspan="2">Acetona</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">Temperatura ambiente</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Infiltração de resina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Protocolo de congelamento-substituição.

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3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

Neste protocolo, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila .

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.4K visualizações.  National Taiwan University. Neste protocolo, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila .

Vídeo: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visualmente Rastreamento Odor Mediated Durante o Voo em Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight muscles (IFMs) of flies, specifically the dorso-longitudinal muscles (DLM), as the experimental subject to measure the atrophic phenotype brought about by different genetic causes. In this protocol, we describe how to embed fly thorax muscles for semi thin sectioning, how to obtain a good contrast between muscle and the surrounding tissue, and how to process optical microscope images for semiautomatic acquisition of quantifiable data and analysis. We describe three specific applications of the methodological pipeline. First, we show how the method can be applied to quantify muscle degeneration in a myotonic dystrophy fly model; second, measurement of muscle cross-sectional area can help to identify genes that either promote or prevent muscle atrophy and/or muscle degeneration; third, this protocol can be applied to determine whether a candidate compound is able to significantly modify a given atrophic phenotype induced by a disease-causing mutation or by an environmental trigger.

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

We report a method to quantify muscle area, which is an indirect method to determine muscle mass in Drosophila adults. We demonstrate the application of our methodology by analyzing the indirect flight muscles in a Drosophila model of Myotonic Dystrophy disease.

Determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de Drosophila Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Uma descrição cartográfica 3D da célula por crioma tomografia de raios-X suave

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...