このプロトコルは、遺伝子およびタンパク質発現の変化を評価するために、小児の発達中のさまざまな時点でショウジョウバエからのGFP標識間接飛行筋の解剖を容易にする。これらの技術を使用して、最小限のRNAタンパク質分解を伴う高富化飛行筋試料は、RT-PCR、ウェスタンブロット、またはオミックアプローチに適したものを達成することができます。これらの専門的な解剖は練習とスキルを必要としますが、解剖できる子犬の数とサンプルの品質は経験によって向上します。
この解剖の視覚的なデモンストレーションは、飛行筋肉と非筋肉組織を区別する方法を決定し、プパル標本からの飛行筋肉の迅速な分離を促進するために重要である。子犬をステージングするには、濡れたペイントブラシを使用して、プレパエを収集して60ミリメートルのペトリ皿に移し、双眼鏡顕微鏡で子犬をセックスします。オスは精巣の存在によって識別され、そうでなければ不透明な子犬の上に半透明の地球儀として現れる。
ハエの時間、日付、および遺伝子型で皿にラベルを付けた後、適切な段階まで25〜27度の摂氏インキュベーターで子犬を老化させる。48 H APF の前に IFM 解剖の場合は、湿潤した絵筆を使用して、適切にステージングされた子犬を、冷たいPBSで満たされた約 2/3 の黒い解剖皿に移します。蛍光解剖顕微鏡の下で、5鉗子を使用して、1つの子犬を黒い解剖皿の底に押し出します。
子犬が明確に視覚化できるまで、顕微鏡のズームとフォーカスを調整します。1組の鉗子を使って子犬の前部をつかみ、胸郭のすぐ後ろにある腹部のわずかに中心から離れた2番目の鉗子の1つの先端で子犬を突く。最初の鉗子を使用して、プパルケースの前半分を取り除き、露出した子犬を胸郭のすぐ後ろにつまんで腹部を胸郭から分離します。
次に、胸郭の前部を軽く絞り、蛍光標識されたIFMを露出させる。次に、残りのカーカスを皿の反対側に捨てる鉗子を使用し、同様にしてその後の子犬を解剖する。すべての子犬が解剖されたら、鉗子を使用してIFM繊維を収集し、黒い解剖皿の底にある杭に繊維を整理します。
鉗子を使用して、残骸を視野から押し出し、IFM以外の筋肉、脂肪、キューティクル、または他の不要な組織をサンプルから取り除きます。次に、切り取ったピペットチップを使用して、IFMの杭を250マイクロリットルの冷蔵PBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。48 H APF後のIFM解剖の場合は、軽く濡れた絵筆を使用して、ステージされた子犬を顕微鏡スライドに取り付けられた両面付き粘着テープのストリップに移します。
子犬の向きをラインに、腹側を下に、前部をスライドの下部に向けます。すべての子犬が配置されたら、鉗子を使用して前尖塔の上の最初のプパルケースを離して開き、後部に向かってゆっくりと一対の鉗子を下にスライドさせ、鉗子が動くにつれてパパルケースを切断します。開いたケースから子犬を解放し、すぐに2番目の顕微鏡スライド上のPBSの滴に子犬を移します。
すべての子犬が解放されたら、細かいはさみを使用して胸郭から離れて子犬の腹部を切断し、腹部を別の山に押し込む。すべてのソア軸が取り除かれたら、組織紙を使ってPBSの大部分と腹部の山を取り除きます。残りの胸郭に新鮮な冷たいPBSの滴を追加し、ハサミを使用して縦方向の体軸に沿って頭から切り取り、胸郭を半分に分割します。
すべての子犬が解剖されたら、5つの鉗子を使用してヘミセクションの1つを選択し、IFMの中央部の上下に1つの鉗子の先端を静かに挿入します。鉗子の最初のペアを保持し、キューティクルと腱から離れてIFMの一方の端をカットするために細かいはさみを使用して、子犬を180度回転させる前に、IFMのもう一方の端をキューティクルと腱から自由に切断できるようにします。鉗子を使用して、IFMバンドルを胸郭からPBSバブルの端に移し、水張力を使用してバンドルを所定の位置に保持します。
次に、スライドの反対側にカーカスを押し、同様にIFMの残りの部分を解剖します。すべてのIFMが収集されたら、5鉗子を使用して、サンプルに入った可能性のあるジャンプ筋肉またはキューティクルの断片を取り除きます。その後、水張力を使用して、一対の鉗子の間で解剖されたIFMを穏やかに捕獲し、250マイクロリットルの冷たいPBSを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にIFMを入れます。
BRUNO1 IR IFMからのmRNAシーケンシングデータは、野生型シーケンシングデータと比較して、遺伝子単位レベルでの発現の変化を示しています。解剖されたIFMに対する全体のプロテオーム質量分析を用いて、タンパク質およびタンパク質アイソフォームレベルでも同様の調節が観察される。Mhcの最終イントロンにタンパク質トラップラインを挿入した後、GFP標識タンパク質の組み込みは、90H APFのM線の両側の2つのドットとしてIFMで観察され、脚筋組織ではサルコマーM線を横切ってGFP信号を均一に観察することができる。
解剖されたIFMに対してRT-PCRを使用する場合、MhcアイソフォームスイッチをGFP標識エキソン34~37イベントからラベルなしエキソン34~35イベントに切り替え、摂氏27度でのpuparium形成後30~48時間の間で検出することができる。mRNAシーケンシングデータから、脚およびジャンプ筋組織は3つのMhcアイソフォームすべてを発現し、成熟した筋肉におけるGFP標識アイソフォームの発現を維持する。スピルト主突然変異体およびBRUNO1 IR-IFMの両方が、GFP標識Mhcアイソフォームの発現を発達するにつれてオフにすることができず、脚およびジャンプ筋組織に似たアイソフォーム発現プロファイルをもたらした。
RNA分解を防ぐために、30分以内に分法を行う必要があることを覚えておいてください。そして、他の細胞タイプによる汚染を制限するよう注意する。この方法は、RT-PCR、またはウェスタンブロッティングなどの生化学的アプローチに適したIFM濃縮サンプルを生成し、質量分析、ハイスループットシーケンシング、クロマチン立体構造キャプチャ、およびメタボロミクスのようなオミックスタイルのアプローチを生成します。
これらの切片は、ショウジョウバエの強力な遺伝的アプローチを、開発および遺伝子調節の基本的なメカニズムを調査するためのシステムレベルのデータと共に補完することができる。
