Die Untersuchungen wurden in der EM-Kern am Institut für Zell- und Organismische Biologie und die Cryo-EM Kern der Academia Sinica, Taipei, Taiwan durchgeführt. Die Arbeit wurde von der Academia Sinica und die meisten unterstützt.

1. Abschnitt Drosophila Gewebe mit einer schwingenden Klinge-Mikrotom
<ol>
	<li>Drosophila auf Eis zu betäuben und jede einzelne Fliege in 1 mL 4 % niedrig schmelzende Agarose in Phosphatpuffer Tauchen. Lassen Sie Agarose, auf Eis erstarren. In der Regel wurden 4-6 fliegen verarbeitet.</li>
	<li>Verwenden Sie eine vibrierende Klinge Mikrotom zu Abschnitt Agarosegel eingebettete Drosophila in mit 100 µm dicke Scheiben und Tauchen in Fixativ Lösung mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Hinweis: Vibratome-Schnitt wird bevorzugt, weil Gewebearchitektur mehr intakt im Vergleich zu anderen Methoden bleibt. Alternativ kann sezieren Pinzette zur IFM in die Fixativ Lösung mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer sezieren.</li>
</ol>
2. bereiten Sie EM Proben vom Hochdruck Einfrieren und Freeze Substitutionsmethode (HPF/FS)
<ol>
	<li>Phosphatpuffer, gefolgt von 2 Tropfen (~ 100 µL) der Phosphatpuffer mit 20 % BSA waschen Sie Gewebeschnitte in 3 Tropfen (~ 150 µL). Dann legen Sie Abschnitte in gold Träger für HPF mit Puffer und 20 % BSA gefüllt.</li>
	<li>Laden Sie die Probe mit Trägern in einem Hochdruck-Gefrierschrank entsprechend der Gebrauchsanweisung.</li>
	<li>Nach dem Einfrieren lassen Träger aus der Halterung unter flüssigem Stickstoff und übertragen auf einen Freeze-Ersatzgerät auf-140 ° c abgekühlt</li>
	<li>Führen Sie das Einfrieren-Substitution-Protokoll wie in Tabelle 1, mit dem FS cocktail mit 2 % Glutaraldehyd, 2 % Osmium ausgefällt und 0,1 % Uranyl Acetat in Aceton dargestellt.</li>
	<li>Vorsichtig entnehmen Sie die Proben aus den Trägern mit einer Nadel und Betten Sie der Proben im Harz bei Raumtemperatur ein. Polymerisieren Sie das Harz bei 65 ° C 16 h. Hinweis: FS Protokolle sollten geändert werden, um andere Arten von Proben vorzubereiten. HPF/FS wird bevorzugt zur Erhaltung der Ultrastruktur und minimiert den Verlust von zellulären Inhalt.<ol>
		<li>Alternativ eine chemische Fixierung Protokoll anwenden. Exemplare über Nacht mit 2,5 % Glutaraldehyd befestigen, waschen mit Puffern und dann fixieren Sie mit 1 % Osmium ausgefällt für 2 h waschen und entwässern mit aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol und dann infiltrieren und einbetten Exemplare in Spurrs Harz vor dadurch bei 65 ° C für 16 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. bereiten Sie Serie Abschnitte der Exemplare für Elektronenstrahl-Tomographie
<ol>
	<li>Schneiden Sie die Probe-Blöcke, um den gewünschten Block Gesicht aussetzen, das Gewebe enthält.</li>
	<li>Vorbehandeln Goldpartikel (10 nm im Durchmesser) mit 1 % BSA für 30 min. Waschen und Aufhängen Goldpartikel in PBS-Puffer. Overlay-Goldpartikel auf Kupfer Slot Gitter beschichtet mit Carbon Folie Kugelmarker erstellen.</li>
	<li>Das Sichtfeld der Tomographie Erwerb unter TEM müssen ausreichend Kugelmarker (mindestens 5-10 Marker) einchecken.</li>
	<li>Geschnitten Sie Serienschnitte, 200-250 nm dicke, mit einem regungsloses.</li>
	<li>Sammeln Sie Serienschnitte auf Slot-Gitter mit einer perfekten Schleife für Dünnschliffe.</li>
	<li>Färben Sie die Abschnitte mit Reynold es Blei Citrat für 10 min.</li>
	<li>Eine zweite Schicht aus treuhändische Goldpartikel auf der Oberseite in den Abschnitten zu überlagern.</li>
</ol>
4. sammeln Sie Doppel-Kipp-Elektron Tomographie
<ol>
	<li>Laden Sie das Raster auf einer Doppel-Mittellinie Tomographie-Halter und stecken Sie in die Transmissions-Elektronenmikroskop in Betrieb bei 200 kV.</li>
	<li>Richten Sie das Mikroskop im Euzentrische Fokus.</li>
	<li>Richten Sie die automatische Datenerfassungs-Software. Einstellen und Ausrichten des Elektronenstrahls bei der Multi-Skalen-imaging-Einstellung. Sie finden Sie im Benutzerhandbuch für Betrieb Detail10 (Abbildung 2).</li>
	<li>Dunklen und hellen Referenzen Kamera in einem leeren Raum ohne Carbon Folie unter der Einstellung "Tomographie-Sammlung" zu erwerben.</li>
	<li>Einen Raster-Atlas bei geringer Vergrößerung zu sammeln. Mitochondrien auf Schnittserien als Ziele für Tomographie Sammlung auswählen.</li>
	<li>Erwerben Sie ein Tilt-Serie von-60 ° bis + 60 ° mit 2 ° c-Schritten auf Achse-A für jedes Ziel. Hinweis: Der Neigungswinkel werden mechanisch durch die Gestaltung der Probenhalter eingeschränkt werden. Der Halter wird den Strahl im hohen Neigungswinkel blockieren.</li>
	<li>Um die zweite Serie der Neigung zu sammeln, drehen Sie die Probenhalter 90°. Erwerben Sie einen neuen Atlas. Wählen Sie entsprechende Positionen und erwerben Sie die Tilt-Serie auf Achse-B für jedes Ziel zu. Hinweis: Andere Softwarepakete, wie SerialEM und Xplore3D, stehen für die automatische Datenerfassung.</li>
</ol>
5. 3D Schichtbilder zu rekonstruieren und Segment Teilvolumina mit Software
<ol>
	<li>Schichtbilder Dual-Achse kippen Bilder mit IMOD Software11zu rekonstruieren.
	<ol>
		<li>Sie finden Sie im Benutzerhandbuch zum Betrieb Detail.</li>
		<li>Richten Sie die individuelle Neigung-Serie durch die Position der gold Kugelmarker. Rekonstruieren Schichtbilder zurück Projektionsmethode oder durch die gleichzeitige Iterative Rekonstruktion Technik (SIRT) Methode für beide Achsen A und B-Achse bzw. (Abbildung 3).</li>
		<li>Kombinieren Sie Schichtbilder der Achse A und Achse-B, ein Doppel-Kipp-Tomogramm mit reduzierten fehlende Keil Artefakt zu generieren.</li>
		<li>Gemeinsam Doppel-Kipp Schichtbilder der Schnittserien Rekonstruktionen für gesamte Mitochondrium Volumen zu erhalten. Die Lücken zwischen den Schnittserien IMOD programmtechnisch zu modellieren.</li>
		<li>Trim verbundenen Schichtbilder und bin auf eine gewünschte Größe für die Volumen-Segmentierung.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analysieren Sie verbundene serielle Schichtbilder mit einer 3D-Software.
	<ol>
		<li>Sie finden Sie im Benutzerhandbuch zum Betrieb Detail.</li>
		<li>Filtern Sie die Schichtbilder mit eine Gaußsche Filter (oder andere gewünschte Methode) verbessert den Kontrast der Funktionen und die Hintergrund dichten.</li>
		<li>Die Ultrastruktur der Mitochondrien zu segmentieren, entweder manuell oder automatisch.</li>
		<li>Anschauungsmodelle Segmentierung zur Inspektion in 3D ermöglichen.</li>
		<li>Filme mit verfügbaren Tools in 3D zu erzeugen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

In diesem Protokoll beschreiben wir einen optimierten Workflow für die Anwendung von seriell-Abschnitt Elektron Tomographie zur 3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel zu studieren. Erhaltung der Ultrastruktur in der Probe ist die größte technische Herausforderung für diese Art der Analyse. Um am besten die Ultrastruktur zwei methodische zu bewahren wurden Schritte enthalten. Erstens wurde Gewebe gesampelt, durch Schneiden mit vibrierender Klinge Mikrotom um die Gewebearchitektur so weit wie möglich zu halten. Zweitens wurde ein HPF/FS-Protokoll optimiert, um Organelle Ultrastruktur während der Vorbereitung des eingebetteten Proben Blöcke zu bewahren. Proben wurden unter hohem Druck, eingefroren, senkt den Gefrierpunkt des Wassers und reduziert die Bildung von Eiskristallen, die Ultrastruktur1beschädigen. Exemplare, die so dick wie 0,1 mm augenblicklich verglast sein kann, und dann einfrieren, Ersatz um Probe Blöcke für EM-Analyse zu generieren unterzogen. Die verbesserte Erhaltung der Ultrastruktur von HPF/FS wurde festgestellt, wenn im Vergleich zu chemischen Fixierung Methoden. Mit dieser Serie von Schritten für die Probenvorbereitung, wurde Erhaltung der mitochondrialen doppelte Membranen und Cristae Membranen erheblich verbessert.
Schnittserien der Probe zu erhalten, ist der schwierigste Schritt des Verfahrens. Da der Elektronenstrahl Durchdringungskraft begrenzt hat, die Dicke des Abschnitts beschränkt sich auf entweder 250 nm oder 500 nm mit einem TEM Betrieb bei 200 kV oder 300 kV, beziehungsweise. Da die Dicke der ein Mitochondrium möglicherweise mehr als 2 µm, Serienschnitte müssen volle Lautstärke Rekonstruktionen zu erhalten. Wiederherstellung einer ausreichenden Zahl von Schnittserien umfassen eine ganze Organelle ist jedoch eine technische Herausforderung. Das Block-Gesicht so flach wie möglich zwischen den Basen des Trapezes zu trimmen können eine Slot-Raster, um Platz für weitere Abschnitte und deckt damit größere Mengen. Darüber hinaus erhöht mit einer perfekten Schleife für Dünnschliffe die Erfolgsquote der Schnittserien an das Stromnetz zu übertragen.
Seriell-Abschnitt Elektron Tomographie kann mit Standardausrüstung EM Kern erreicht werden. Die Methode hat jedoch einige unvermeidlichen Einschränkungen, die durch technische Zwänge entstehen. Einer ist, dass Material unweigerlich verloren zwischen Serienschnitte, so dass Lücken in den verbundenen Wiederaufbau. Zweitens ist das fehlende Keil Artefakt, die aufgrund der begrenzten Neigungswinkel entsteht, die erreichbar sind. Diese Einschränkung tritt auf, weil der Probenhalter in eine volle Umdrehung eingeschaltet werden kann, ohne zu blockieren den Elektronenstrahl. Trotz dieser Einschränkungen bietet Serien-Abschnitt Elektron Tomographie ausreichenden Auflösung, Mobilfunk- und Organelle Ultrastruktur in 3D zu offenbaren.
Für die kleineren Maßstab Bildgebung ist Cryo-Elektron Tomographie eine neue Technologie, die verwendet werden, um die Struktur der makromolekularen komplexe und Baugruppen in Situ in nm oder Sub Ångström Auflösung in Kombination mit Sub-tomographische zu erhalten Umbau3. In dieser Anwendung sind die Zellen durch Schneiden oder Fräsen unter flüssigem Stickstoff fokussierten Ionenstrahl ausgedünnt. Die Schichtbilder werden unter Cryo-Bedingungen gesammelt wo sind molekulare Strukturen in der Nähe der nativen Zustand ohne chemische Fixierung, Austrocknung oder einbetten erhalten. Am anderen Ende der Skala um große Gewebe auf Kosten der Auflösung, analysieren ist Rasterelektronenmikroskopie serielle Block-Gesicht eine ansprechende Modalität, obwohl es ein spezifisches Instrument4erfordert.

Elektronenmikroskopie ist ein wertvolles Instrument zur Untersuchung der strukturellen Kontext der subzellulären Baugruppen und Organellen, die zelluläre Prozesse ausführen. Methoden wurden entwickelt, um die Ultrastruktur von Geweben oder Zellen entweder durch chemische Fixierung mit Aldehyden zu erhalten oder durch hohen Druck Einfrieren (HPF) gefolgt von freeze Substitution (FS)1,2. Die eingebetteten Proben Blöcke können dann geschnitten, gebeizt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) beobachtet. Die HPF-Probe konnte auch unter Cryo-Zustand, z. B. durch Cryo-schneiden oder fokussierten Ionenstrahl (FIB) Fräsen und beobachtet von Cryo-EM3,4verarbeitet werden.
Obwohl dünn-Sektion EM morphologische aufschlussreiche Einblicke bietet, können die resultierenden 2D Bilder nur die Ultrastruktur der einen bestimmten Querschnitt zeigen. Wie die Ultrastruktur in ein 3D Volumen anordnet bleibt verdeckt. Um zellulären Ultrastruktur dreidimensional sichtbar zu machen, wurde eine Elektron Tomographie Methode entwickelt, wo Tilt Bilderserie erworben und zurück projiziert, um eine tomographische Rekonstruktion5 (Abbildung 1) zu generieren. Eine doppelte Tilt-Reihe kann gesammelt werden, durch die Probe 90° drehen und eine zweite Tilt-Serie zu erwerben. Dies minimiert fehlt-Wedge Artefakte, die ergeben sich aus der begrenzten Probenahme Winkel und Auflösung der Tomogramm verbessert.
Hier beschreiben wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie studieren mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel (IFM)6,7,8,9 . Um 3D Rekonstruktionen für gesamte Mitochondrien (ca. 2,5 µm dicken) zu erhalten, wurden Serienschnitte von Drosophila IFM Gewebe Blöcke erhalten. Schichtbilder der einzelnen Abschnitte wurden einzeln mit automatischer Datenerfassungs-Software gesammelt. Tomographische Rekonstruktionen wurden generiert und serielle Schichtbilder schlossen mit dem IMOD Paket, einem rekonstruierten Volumen von eine gesamte Mitochondrium zu erhalten. Die verbundenen Schichtbilder wurden von 3D Software analysiert. Die Dichte der Mitochondrien Cristae wurden segmentiert, um einem Segmentierungsmodell zu generieren, die die Organisation in drei Dimensionen offenbart.

<table width="852">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:252px;height:40px;">vibrating blade microtome</td>
			<td style="width:123px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:267px;">VT1200S</td>
			<td style="width:212px;">Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">high-pressure freezer</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM HPM100</td>
			<td>Specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freeze-substitution device</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM AFS2</td>
			<td>Specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ultramicrotome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>Ultra-thin sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dual-axis tomography holder</td>
			<td>Fischione&#160;</td>
			<td>Model 2040</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">transmission electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td>&#160;Tecnai F20</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD</td>
			<td>Gatan&#160;</td>
			<td>UltraScan 1000</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leginon</td>
			<td colspan="2" style="width:388px;">NRAMM/AMI</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IMOD</td>
			<td colspan="2" style="width:388px;">Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td>Tomography reconstruction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Avizo 3D</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Tomography analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

Mitochondrien sind zelluläre Kraftpakete, die produzieren ATP, Lipide und Metaboliten sowie Kalzium-Homöostase und Zelle Tod zu regulieren. Die einzigartige Cristae-reiche Doppelmembran Ultrastruktur von dieser Organellen ist elegant angeordnet, um mehrere Funktionen durchzuführen, durch die Partitionierung Biomoleküle. Mitochondrialen Ultrastruktur ist eng mit verschiedenen Funktionen; die feinen Details dieser Struktur-Funktions-Beziehungen sind jedoch erst am Anfang beschrieben werden. Hier zeigen wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären. Seriell-Abschnitt Elektron Tomographie kann Zellstruktur in drei Dimensionen zu studieren angepasst.

Wir angewendet seriell-Abschnitt Elektron Tomographie Strukturmerkmale der Mitochondrien Cristae zu analysieren, die den energetischen Zustand und Alterung widerspiegelt. Wir zeigten, dass Mitochondrien von Drosophila IFM ein integriertes bilden Cristae und Matrix-Netzwerk in 3D (Abbildung 4)7. Darüber hinaus angesammelt mutierte fliegen mit mitochondrialen DNA Replikation defekt und eine beschleunigte Alterung Phänotyp Mitochondrien, die Unterabschnitte von Zwiebel-wie wirbelnde Kern (Abbildung 5)7enthalten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Abbildung der Elektron Tomographie Rekonstruktion aus einer Reihe von Tilt. Im Experiment wird ein Elektronenstrahl ein 3D-Objekt durchlaufen, wenn das Objekt in unterschiedlichem Maße geneigt wird. Für jede Bedingung Tilt 2D Projektion erzeugt und mit einer Kamera erfasst. Die 2D Projektionen dürften dann wieder um das 3D-Objekt basierend auf der zentralen Scheibe Theorem zu rekonstruieren. In der Abbildung ist der gleiche Prozess für eine ursprüngliche 2D-Bild dargestellt, die in einer einzigen Dimension unter verschiedenen Neigungswinkel projiziert wird. Die 1D Projektionen werden verwendet, um das 2D-Bild zu rekonstruieren. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
Abbildung 2: automatische Datenerfassung. Eine Bildanzeige Viewer Software zeigt des Atlas eine Slot-Raster mit Schnittserien kippen mehrskaligen Ausrichtung der Mitochondrien und erworbene Bilder. Maßstabsleiste = 500 µm (oben links), 100 µm (linken Bodenplatte), 1 µm (rechte Abbildung). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Serial-Abschnitt Elektron Tomographie von einem einzigen Mitochondrium in Drosophila indirekte Flüge Muskel. 2D Mikrographen (A) und (B) 3D Schichtbilder von Schnittserien deckt das gesamte Volumen der ein Mitochondrium. (C) verbundene seriell-Abschnitt Schichtbilder werden projiziert, erstellen Sie einen Längsschnitt mit der z-Achse vertikal dargestellt. Vor allem führte Gewebe schneiden zu Verlust von Material, so dass Lücken zwischen verknüpften Schichtbilder. Maßstabsleiste = 500 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
Abbildung 4: integrierte Intra-Mitochondrien Cristae und Matrix-Netzwerk in 3D gezeigt. (A) Scheiben der mitochondrialen Elektron tomographische Rekonstruktionen zeigen wechselt zwischen lamellaren Membranen durch die z-Achse. (B) Abbildungen von den beobachteten Cristae Muster direkt übergeben und/oder Linkshänder Spiralen wechseln. (C) tomographische Segmentierung zur Veranschaulichung einer linkshändigen Spirale in 3D (D) Cristae umschalten Muster analysiert und Farbe auf das Segmentierungsmodell (E, F) gerendert wurden. Tomographische Scheibe mit seitlichen Matrix Konfluenz (dunkle Rohdichten, rot markiert) über Cristae Membranen (weiße Dichte). (G) Segmentierung der Tomogramm in (E) mit seitlichen Matrix Konfluenz (in rot) Modell und repräsentative Cristae (in grau). Maßstabsleiste = 50 nm (A), 200 nm (C) und 300 nm (D, E, F, G). Die Figur wurde die Neuauflage von Jiang Et al. 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Mitochondrien mit Zwiebel-wie wirbelnde Kernen angesammelt fliegen mit mitochondrialen DNA Replikation Fehler während des Alterns. Repräsentative tomographische Scheiben und die entsprechenden Segmentierung (richtigen Platten) zeigt eine Querschnittsansicht (oben) und einen Längsschnitt Ansicht (unten) aus einem wirbelnden Kern. Volumen-Segmentierung wird durch willkürliche Farbwiedergabe den wirbelnden Kern hervorheben. Maßstabsleiste: 200 nm. Die Figur wurde die Neuauflage von Jiang Et al. 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schritt</td>
			<td colspan="2">Temp</td>
			<td colspan="2">Zeit</td>
			<td colspan="2">Lösung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">-140 ° C bis-9 0 ° C</td>
			<td colspan="2">30 min</td>
			<td colspan="2">Flüssiger Stickstoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 hr</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C bis-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 h (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 h</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 ° C bis-25 ° C</td>
			<td colspan="2">7 hr (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 h</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C bis 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 h (5 ° C/h)</td>
			<td colspan="2">FS-cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">1 hr x 3 Mal</td>
			<td colspan="2">Aceton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">Raumtemp</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Harz-infiltration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Freeze-Substitution-Protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography at JoVE.com

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären.

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.4K Aufrufe.  National Taiwan University. In diesem Protokoll demonstrieren wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären.

Serie: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visuell vermittelte Odor-Tracking während des Fluges in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Forschung

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight muscles (IFMs) of flies, specifically the dorso-longitudinal muscles (DLM), as the experimental subject to measure the atrophic phenotype brought about by different genetic causes. In this protocol, we describe how to embed fly thorax muscles for semi thin sectioning, how to obtain a good contrast between muscle and the surrounding tissue, and how to process optical microscope images for semiautomatic acquisition of quantifiable data and analysis. We describe three specific applications of the methodological pipeline. First, we show how the method can be applied to quantify muscle degeneration in a myotonic dystrophy fly model; second, measurement of muscle cross-sectional area can help to identify genes that either promote or prevent muscle atrophy and/or muscle degeneration; third, this protocol can be applied to determine whether a candidate compound is able to significantly modify a given atrophic phenotype induced by a disease-causing mutation or by an environmental trigger.

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

We report a method to quantify muscle area, which is an indirect method to determine muscle mass in Drosophila adults. We demonstrate the application of our methodology by analyzing the indirect flight muscles in a Drosophila model of Myotonic Dystrophy disease.

Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...