Name: method for labeling transcripts in individual escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments
Uploaded: 2017-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments at JoVE.com

この作品は、(バッハ) にイスラエル科学技術振興財団助成金 514415 と (バッハ) に BSF NSF (MCB) グラント 2016707 によって支えられました。ジークフリートとイルマ ウルマン (バッハ) 教授の椅子はまた認めたからサポートします。

1. プローブの設計
注: このプロトコルは、すでに fluorophores が付いているタグ付き市販オリゴヌクレオチド プローブを使用します。プローブは、ターゲットに相補的な特定のシーケンスのセットで構成されます mRNA、各プローブの単一蛍光分子に活用されています。また、5,16を他の場所で説明されているようにプローブ、蛍光マーカーを付けることが可能です。
<ol>
	<li>アルジュン ラージュ (Oudenaarden 研究所、マサチューセッツ工科大学・ ヴァン); によって開発されたプローブ デザイナー16アルゴリズムを用いた設計 smFISH プローブこの原稿で使用される smFISH プローブのシーケンスは、材料の表に記載されています。 注: 最小検出可能なシグナルのセットでプローブ数は 30 ~ です。正確な数は、非常に短い転写産物を測定した場合に特に興味の遺伝子によると異なる場合があります。</li>
	<li>光セットアップに合った染料を選択 (材料の表を参照)。 注: Cy3 染料または写真漂白剤に感受性の低い光学同等の色素強くお勧めします。デュアル ラベルの候補は cy5 の組合せまたは光学同等 (材料の表を参照) を染めます。ラベル付けされた mRNA の嵐イメージングのための適切な染料は蛍光性の放出の複数のサイクルのための能力によって特徴付けられます。いくつかの smFISH の染料を使用することができます嵐画像 (材料の表を参照)。同じセルに異なる遺伝子に対応する 2 つ (以上) の議事録をイメージするには、染料のほとんど、あるいは全く重複しているスペクトルに共役オリゴヌクレオチド プローブを選択するべきです。</li>
</ol>
2. 試薬の準備
注: フィルター処理されたピペット チップ、チューブなどの消耗品の RNase フリーによる RNAse フリー サンプルを保つために、あらゆる作業環境を清潔に保つことが重要です。ヌクレアーゼ フリー ターゲット コピーの劣化を避けるためには、次のセル固定使用すべての試薬がある必要があります (材料の表参照) またはジエチルピロカーボネート (DEPC)-扱われ、滅菌します。
<ol>
	<li>SmFISH 用のバッファー
	<ol>
		<li>RNase フリー 1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水, 0.01 M のリン酸バッファー濃度 (pH 7.4) 0.154 M の塩化ナトリウム濃度とソリューション) を準備します。RNase フリー 10 x PBS を希釈 (材料の表参照) ヌクレアーゼ フリー水 (材料の表を参照)、1:10 で v/v の比。<ol>
			<li>また準備 DEPC 処理 1 × PBS。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RNase フリーの準備 2 x SSC (生理食塩水ナトリウム クエン酸バッファー (pH 7.0) クエン酸ナトリウム 0.03 M で 0.3 M の NaCl)。RNase フリー希釈 20 x SSC (材料の表を参照)、1:10 でヌクレアーゼ フリー水で v/v の比。<ol>
			<li>また、DEPC 処理 2 を準備 x SSC。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>オリゴヌクレオチド プローブ原液。
	<ol>
		<li>25 μ M のプローブ株式を作成する TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 200 μ L の乾燥したオリゴヌクレオチド プローブ ブレンドを再溶解で上下にピペッティングし渦と遠心分離機を簡単に混ぜる。</li>
		<li>凍結しを貯蔵液チューブの固定の解除を避けるためには、単一の実験的実行で使用する予定の残高に対応する原液のいくつかの因数を作る。原液-20 ° C で以下を保存し、光から保護します。 注: 5 nmol のプローブ セットは、最大 250 のハイブリダイゼーション反応を提供できます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(スキナーら次の交配バッファー7 ):
	<ol>
		<li>ヌクレアーゼ フリー水を 5 mL を 50 mL ポリプロピレン円錐底部チューブに追加します。デキストラン硫酸の 1 g を水に加えるし、積極的なボルテックスによって解散。(30 分程度) に泡が消えるまでは、軌道のシェーカーの内容をミックスします。</li>
		<li>ソリューション 3,530 μ L の脱イオン ホルムアミド、エシェリヒア属大腸菌の tRNA の 10 mg の 20 x SSC 1 mL、200 mM リボヌクレオシド バナジル錯体の 100 μ L、50 Mg/ml BSA の 40 μ L に追加します。DEPC 処理水やヌクレアーゼ フリー水の添加により 10 mL に最終巻を持参し、渦までソリューションが均質。 メモ: ソリューションの雪解けから凍結を避けるために、単一の実験的実行で使用する予定の残高に対応する原液のいくつかの因数をください。-20 ° C で原液を保存します。必ずボトルを開封前に暖かい室温のホルムアミドをしましょう。背景を減らすためは、最適なホルムアミド濃度 (10-40 %v/v 比) を調整することをお勧めします。 
		注意:警告!ホルムアミド、毒性や催奇形物質知られています。目や皮膚、吸入または摂取との接触を避けてください。実験用の上着と手袋を着用しながらヒューム フードの下でそれを処理します。</li>
		<li>ソリューションを滅菌するには、0.22 μ m フィルターを通過します。因数で維持し、1 年間に-20 ° C で保管します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 × PBS に 37% ホルムアルデヒド (v/v) を追加することによって固定バッファー (1 × PBS で 4.6% ホルムアルデヒド) を準備 (2.1.1 参照) 1:8 v/v 比と渦で。 注意: 警告!ホルムアルデヒドは非常に有毒な既知の発癌物質。実験用の上着と手袋を着用しながらヒューム フードの下でそれを処理します。</li>
	<li>SmFISH の洗浄バッファーを準備 (2 の 20% ホルムアミド x SSC) 脱ホルムアミドを 2 に追加することによって x SSC (2.1.2 参照) 1:4 v/v 比と渦。</li>
	<li>5 mM システアミンと酸素スカベン ジャー (グルコース 10% (w/v)、56 nM カタラーゼ、7 μ M グルコースオキシダーゼ) バッファーを洗浄するを追加することによって smFISH の画像バッファーを準備 (20% ホルムアミド 2 x SSC)</li>
	<li>嵐のためのバッファー
	<ol>
		<li>ヌクレアーゼ フリー水にトリス塩酸 50 mM と 10 mM の NaCl を追加する A のバッファーを準備します。 注: 店は年のための RT。</li>
		<li>ヌクレアーゼ フリー水にブドウ糖 50 mM 10%、10 mM の NaCl、トリス-HCl w/v を追加することによってバッファー B を準備します。 前年まで 4 ° c 注: ストア。</li>
		<li>MEA バッファーを準備するには、1 mL のバッファー A (1 M 溶液になります) で 77 mg システアミンを溶解します。 注意: それが 1 ヶ月 4 ° C で保存することができます。</li>
		<li>8,440 AU (任意の単位) ブドウ糖酸化酵素を追加することによって Gloxy バッファーを準備し、1 ml 70,200 AU カタラーゼ バッファー a. 注: 50 x 貯蔵液は、1 ヶ月の 4 ° C で格納できます。</li>
		<li>MEA バッファーと Gloxy バッファー B. x 1 の 50 ミリメートルを追加することによって嵐の画像バッファーを準備します。 注: 嵐の画像バッファーは 5 mM システアミン、酸素スカベン ジャー (7 μ M グルコースオキシダーゼと 56 nM カタラーゼ) で 50 mM の 10 mm NaCl、トリスと ph 8.0 10% ブドウ糖で構成します。イメージングの直前準備、格納および常温約 2 時間使用できます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. サンプル固定
<ol>
	<li>(例えば、大腸菌の細菌のセルを成長します。</li></ol>大腸菌 MG1655) 260 rpm および 37 ° C で一晩伊南軌道シェーカーを選択 (例えばLB 培地) の成長媒体で 注: プローブの非特異的結合によるバック グラウンドを決定するには、興味の遺伝子が削除されたひずみの測定を実行する (で図 1と Δ のsodBの Δ のgalkを参照してください同様の手順図 2)。
	<li>新鮮な培地で一晩培養 1: 100 を希釈し、分光光度計の値が 0.2 - までのすべての ~ 1 h 単位の光学濃度 (OD600) 0.4;4 mL 文化は十分なはずです。 注: 選択した顕微鏡に位相差、微分干渉コントラスト機能を持たない場合大腸菌外膜がでラベル付けできます 2 μ M の親油性蛍光マーカー (材料の表を参照) に追加する必要があります、細菌懸濁液固定17前に 20 分。固定し、さらに治療には、以下のよう実行されます。ラベル プローブ セットとスペクトルの重複を最小限に抑えるための異なる発光スペクトルを有する蛍光マーカーを選択するには、注意が必要です。</li>
	<li>4 ° C で 4,500 g で 5 分間遠心分離によるペレット細胞すべてのチューブから上澄みを削除します。</li>
	<li>各管に 1 mL の 1x PBS を追加し、セルに集計を最小限に抑えるためにペレットを再懸濁します。優しく固定バッファーおよび渦の 4 mL を加えます。</li>
	<li>24 の ° C で 30 分間 260 rpm で軌道シェーカーのサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>10 分、1,000 g、4 ° C の遠心分離によって細胞をペレット上清を除去します。1 mL の 1x PBS を追加します。</li>
	<li>(材料の表参照) 1.8 μ L 円錐形底マイクロ遠心チューブに懸濁液を転送し、手順 3.6 回。</li>

4. サンプル透過
<ol>
	<li>非常に慎重に上清を除去します。必要に応じて、ペレットの外のすべての液体を除去する少量のピペットを使用します。</li>
	<li>300 μ L の DEPC 処理水やヌクレアーゼ フリー水で再懸濁します。350 μ L 高品位無水エタノール (99%) を追加、チューブを反転して軽く混ぜます。エタノールとミックス再び、最終的なエタノール濃度 70% (v/v 比) に到達するための別の 350 μ L を追加します。 注意: 警告!エタノールは可燃性です。</li>
	<li>室温 (RT) で 1 時間 20 rpm でチューブの回転子とサンプルを回転または、4 ° C で一晩します。サンプルは、1 週間 4 ° C で保存されるかもしれない。</li>
</ol>
5. 交配
<ol>
	<li>7 分, 750 x g, 4 ° C の遠心分離によって細胞をペレットします。上清を除去します。</li>
	<li>1 mL 20% 洗浄バッファーのサンプルへと休暇が数分、またはペレットを完全に溶解するピペットの立っている追加します。</li>
	<li>750 x g、4 ° C での 7 分間の遠心分離によって細胞をペレット</li>
	<li>非常に軽くピペッティングによる上清を削除します。ペレットの外のすべての液体を削除する必要がある場合は、少量ピペットを使用します。</li>
	<li>オリゴヌクレオチド プローブ セットに原液交配バッファー因数にして最終的なオリゴヌクレオチド濃度が 250 を追加 nM。渦精力的に。 注: 同一のセルに一度に 2 つ以上の異なるターゲット Mrna のラベルを 1 つできます。交配バッファーに両方のターゲットのプローブ セットを追加します。(例えば、Cy3 および cy5 の組合せ) のスペクトル重複を最小限に抑える別の発光スペクトルを有する染料を選択するには、注意が必要です。嵐イメージング用サンプルが嵐 (例えば材料のテーブルで) 適切な染付共役設定オリゴヌクレオチド プローブとハイブリダイズがいることを確認します。</li>
	<li>(ソリューションはかなり粘性) の泡の生成を回避しながらのオリゴヌクレオチド プローブを含む 50 μ L 交配バッファーのサンプル (ステップ 5.4 を参照してください) を中断します。</li>
	<li>暗闇の中で 30 ° C でホット ブロックのサンプルを一晩残します。 注: 次に、サンプルが格納される 4 ° C で最大 6 ヶ月間</li>
</ol>
6. 洗濯
<ol>
	<li>各サンプル画像を 1 つの新しい遠心管を使用します。1 mL 洗浄バッファーを追加します。</li>
	<li>洗浄バッファーとミックス/渦を含む新しいチューブにハイブリダイズしたサンプルから 10-15 μ L を追加します。</li>
	<li>7 分間の遠心分離、4 ° C で 750 x g 細胞をペレットします。上清を除去します。 注: を背景を減らすためには、30 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>洗って 2 回以上 (1 mL 洗浄バッファーで再懸濁します、遠心分離機およびペレットを削除) します。</li>
	<li>25 μ L の洗浄バッファーの再懸濁します。 注: 1 つの光退色を低減するために追加できます洗浄バッファー清掃システム (2.6) 単一分子蛍光実験6で色素の安定性を改善するために酸素。</li>
</ol>
7. イメージング用試料の調製
注: セルは蛍光・位相差顕微鏡の下で適切なイメージングを可能にするために固定する必要があります。次のメソッドは、ビューの別のフィールドを別の焦点面で視覚化されるサンプルを準備する使用できます。
<ol>
	<li>Agarose のゲルの準備
	<ol>
		<li>150 mg アガロースを 10 mL 2 x SSC バッファーに追加します。2 を追加しないでくださいそれか、アガロース、x SSC は正しく分解しません。</li>
		<li>電子レンジ 10-15 s たびに大きな気泡が形成し始めるまで。脇を設定すると、数分間冷却します。</li>
		<li>スライドの中央のまま公開されているので、スライドに分けるシリコン フレームを配置します。</li>
		<li>スライドの中央に 10 mm 幅 (1-2 mm 厚) 剛体円環を置き、封止するのため、ゲルの少量を入金します。強化するために数分を待ちます。</li>
		<li>高いドーム形状を形成するまでより多くのゲルを追加します。(高級ピンセットまたはその他のメソッドを使用して) リングを削除して、セキュリティを強化する 10 分を待ちます。</li>
		<li>ゲルとシール #0 coverslip スライドの上の洗浄の細菌セル (6.5 参照) の ~ 10 μ L を入金します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SmFISH の商工会議所のサンプル準備
	<ol>
		<li>別の方法として (手順 7.1) にポリ D リジン コーティング ガラス下部使い捨てプラスチック シャーレに洗った細菌細胞 (6.5 参照) を固定化したイメージ用サンプルを準備します。</li>
		<li>常温で一晩表面に対する細胞の接着できるように可視化する前に、暗闇の中でサンプルをインキュベートします。可視化の前に洗浄バッファーで 1 回洗浄 (. 5);smFISH (2.6) の洗浄 buffer(2.5) またはイメージング バッファーと濡れているサンプルを保ちます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>嵐のため商工会議所サンプル準備
	<ol>
		<li>ポリ D リジン コーティング ガラス下部使い捨てプラスチック シャーレにイメージングのための嵐のためのサンプルを準備します。</li>
		<li>常温では、暗闇の中のサンプルを一晩インキュベートします。SmFISH (2.5); の洗浄バッファーで可視化洗浄を一度前に嵐 (2.7.5) の画像バッファーを追加します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8。トラン スクリプトの可視化
<ol>
	<li>電動ステージを搭載した広視野蛍光顕微鏡で細胞をイメージ (材料の表を参照)。 注: 嵐変更、染料の蛍光性の放出の複数のサイクルのことができるラベルの付いたセルを使用します。3 D 超解像イメージング システムを使用してサンプルの画像 (例えば材料の表を参照してください)。</li>
	<li>使用 (推奨)、60-100 N.A x &#62;; メタルハライド ランプや水銀などの強い光源との 1.3 油浸漬位相コントラスト対物レンズLED ベースの光のソースがおすすめ。</li>
	<li>使用標準的な冷却 CCD カメラ、理想的な速度よりは低光レベルのイメージング (16 μ m ピクセル サイズでカメラを使用) ために最適化 (材料の表を参照)。 注: 使用冷却 EMCCD (電子電荷結合素子を乗算) のカメラ CCD カメラ特に単一分子の検出を防ぐ熱ノイズを低減する必要があります。</li>
	<li>選ばれた fluorophores の適切なフィルターを使用するを設定します。</li>
	<li>セルの境界を確認正しく、段階の対照の光学、または外側の細胞膜の蛍光ラベル化による各サンプルの別の視野の画像を取得します。すべてのチャネルのための異なる焦点面 (z) で画像を取得 (通常 13 スライスで区切って 250 nm が取られる)。 注: 顕微鏡とフィルター セットのモーターを備えられた段階は商業によって制御されるべき (材料の表参照) またはシーケンス内の画像のスタックをキャプチャすることが社内のソフトウェア。</li>
</ol>
9. データの分析
<ol>
	<li>画像のスタックをデータ解析に適した形式に変換します。</li>
	<li>ターゲットのコピー数を見積もる mRNA 他の現在利用可能なプロトコルのように離散 'スポット' をカウントではなく細胞内蛍光巣の合計強度から。</li>
	<li>オープン ソース ・ ソフトウェア18またはカスタム プログラムで画像解析を実行します。データ画像や分析の詳細は、スキナーらを参照してください。7</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

当研究室で smFISH メソッド2を使用してE. 大腸菌細胞の異なる遺伝子のコピー数で測定しました。簡単に言えば、この手順は次の手順で構成されています: セル固定、プローブの浸透を可能に膜の透過プローブの交配、そして標準的な蛍光顕微鏡を用いたイメージングのサンプルします。この手順は、いくつかの変更6,7,</s...

確率は遺伝子発現の基礎的、やむを得ない面であり、細胞多様性1、両方の成績証明書および蛋白質の2,の3レベルに上昇を与えます。明確に定義された条件の下でセル間変動の定量化は、遺伝子の発現とその制御の根底にある基本的なプロセスに、ユニークなウィンドウを提供しています。細菌における細胞多様性の 1 つの重要な源は、転写レベルで行われます。成績証明書番号は、転写、転写プロセス調節などにも確率のためだけではなくを小さな Rna と RNAases2によって異なります。定量的な方法で多様性に直接アクセスする方法の 1 つは、蛍光 smFISH のある特定の遺伝子の個々 の成績証明書を付けることです。この方法では、検出と特定の RNA の分子の細胞内局在性固定、個々 の細菌細胞4をことができます。利息5,6のトラン スクリプトに選択的に結合するように設計、蛍光標識 〜 20 拠点長のオリゴヌクレオチドのセットを持つ Mrna を交配します。複数のラベル付けにより、上記のバック グラウンド蛍光検出と個々 の mRNA 分子は、回折限界のスポットが蛍光顕微鏡7 (参照してください図 1) として表示されます。相補的なオリゴマー プローブが二次蛍光標識した記者のテクニック8を使用して検出されます共役の皮膚 (例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン) を運ぶ mRNA 分子の分類のための他のアプローチがあります。
SmFISH に加えて成績証明書についての定量的な情報を提供する他の方法があります。北など、いくつかのしみまたは量的な PCR の大部分をプローブし従って mRNA のコピーの数も個々 の細胞内での位置を測定できます。これらのメソッドは細胞間変動の定量化に適していません。呼ばれる、細胞内の場所と同様、両方の細胞内 Rna のコピー数の定量誤差に頑健な蛍光の in situハイブリダイゼーション (MERFISH) を多重化できる最近イメージ ベースの技術を開発しました。MERFISH は、蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブの固定数から定義された組み合わせから成る一意のバーコードの割り当てに基づいています。これらのバーコードで読み取られ、smFISH 測定の連続ラウンド、退色と各次の交配、それにより 2 桁の9,10によってスループットの向上のラウンドします。このテクニックは、自動液体処理システムおよびプローブ セットの適切な設計を必要とします。
確率光再建顕微鏡 (嵐)11など小説の超解像技術と個々 のトラン スクリプトの複数蛍光標識の組み合わせにより、十倍の解像度で、転写産物の細胞内局在。嵐、蛍光プローブとイメージングのバッファーの適切な組み合わせは、(点滅) プローブ分子あたりの蛍光性の放出の複数のサイクルをできます。嵐は、大腸菌トランスクリプトームのイメージし、関心12の同時にすべての転写産物の分類によって rna のゲノム広い空間組織を観察にも使えます。
上記のレビューすべての単一細胞方法は固定細胞の転写物をイメージングに基づいています。それ故に、彼らは細胞内での転写産物の動力学的性質に関する情報を提供しません。生きているセル13成績証明書に従う、Mrna を結合部位の配列への興味の遺伝子の融合によるラベルことができます。これらの後者は、バクテリオファージ MS2 のコート蛋白質、緑色蛍光タンパク質 (GFP)10,14,15などの蛍光タンパク質を融合したなどの RNA 結合蛋白質によって認識されます。
ここで大腸菌で特に蛍光標識 DNA プローブ、smFISH 実験で使用するためのセットを個々 の mRNAs をラベリングの手法について述べる。さらに、マイナーな修正と嵐測定用同じラベル付けスキームが紹介します。

<table><tbody><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute</td><td>Mallinckrodt Baker - Avantor</td><td>8025.25</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 20X SSC</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 10X PBS</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>nuclease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide, nuclease free</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753-500UN</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM</td><td>New England Biolab</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Cysteamine and oxygen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-fucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8150</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td><td>Life Technologies</td><td>V2286</td><td></td></tr><tr><td>Agarose,low melting reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A2-2.0&lt;span&gt; &lt;/span&gt;666208</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Super life nitrile powder free examination gloves</td><td>Supermax</td><td>TC-N-9889</td><td></td></tr><tr><td>Brand sterilization incubator tape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR61750</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.8 ml)</td><td>Axygen - Corning Life Sciences</td><td>MCT-175C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 5 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 10 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 25 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer cuvettes</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 0.2 - 20 &amp;mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT20</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 10 - 200 &amp;mu;l</td><td>Axigene/corning</td><td>TF-200</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 100 - 1000 &amp;mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 100 - 1000 &amp;mu;l</td><td>Sorenson</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Syringe disposile 10 mL needle G-21</td><td>Becton Dickinson, Biosciences</td><td>BD-309643</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.2 um Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534 K</td><td></td></tr><tr><td>Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc</td><td>Nikon</td><td>MXA20233</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides 76 x26, 3&quot;x1&quot;x1mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>421-004ET</td><td></td></tr><tr><td>#0 coverslip slide 24x60</td><td>Thermo Fisher Scientific/Menzel</td><td>BNBB024060A0</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>M.R.C</td><td>TOU-50</td><td></td></tr><tr><td>Hot block</td><td>M.R.C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fried Electric Company</td><td>G-560-E</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-501-I</td><td></td></tr><tr><td>OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer</td><td>Midsci</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td> </td></tr><tr><td>Eclipse Ti microscope</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td> </td></tr><tr><td>CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13</td><td>Nikon</td><td>MRD31905</td><td> </td></tr><tr><td>Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP</td><td>Nikon</td><td>49005</td><td> </td></tr><tr><td>Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P</td><td>Nikon</td><td>49009</td><td> </td></tr><tr><td>Nis-elements AR auto reaserch software</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td> </td></tr><tr><td>STORM microscope</td><td>Vutara</td><td>SR-200</td><td> </td></tr><tr><td>NA 1.2 water immersion objective&lt;span&gt; &lt;/span&gt;</td><td>Olympus</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>SRX image acquisition and analysis software</td><td>Vutara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 EMCCD camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&amp;reg; FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor&amp;reg; Red 590 Dye</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Probe Sequence for galK mRNA:&lt;/strong&gt;</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&amp;reg; FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor&amp;reg; Red 670 Dye</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Probe Sequence for sodB mRNA:&lt;/strong&gt;</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr></tbody></table>

method for labeling transcripts in individual escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments

固定細菌エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光の使用のための個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書をラベル付けアルゴリズムを述べる。smFISH では、興味の遺伝子の mRNA のコピーの数の細胞間の可変性の測定として、転写産物の細胞内局在をことができます。主な手順は、細菌の細胞培養の固定、細胞膜の透過および市販の短い蛍光標識したオリゴヌクレオチド プローブのセットとターゲットの転写産物の交配です。smFISH は、異なる蛍光マーカー間スペクトルの重なりによって課された制限と同じ細胞の複数の遺伝子の転写産物のイメージングを許可できます。下図のプロトコルが完了した後、低輝度蛍光に適したカメラと組み合わせて顕微鏡を用いた細胞が容易にイメージ化します。位相コントラスト フレームの分割細胞膜が染色から得られたセルの輪郭と共に、これらのイメージは、オープン ソースまたはカスタム作成されたソフトウェアを使用して細胞のサンプルの mRNA のコピー数の分布の計算を許可します。ここで説明したラベリング法を確率論的光再建顕微鏡 (嵐) イメージを成績証明書に適用もできます。

SmFISH大腸菌の細胞の galK と sodB の転写物の測定を行った。成績証明書は、単一蛍光分子に共役されて各プローブ ターゲット シーケンスに補足特定のシーケンスのセットで交配させられた (資料の表を参照)。蛍光・位相コントラスト画像 MG1655 野生型の大腸菌の菌株 (WT) または JW0740 (慶應義塾コレクション)19 galK 削除ひずみ (ΔgalK)...

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Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA 分子の定量化を可能にする可視化手法です。

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

8.2K ビュー.  Weizmann Institute of Science. 本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA 分子の定量化を可能にする可視化手法です。

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

遺伝学

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

生化学

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

<meta charset="utf8"></head><body>smFRET-TIRF研究のためのRNAのデュアルカラー末端標識と小胞カプセル化

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their conformational changes over time. To monitor RNA dynamics with smFRET, we developed a method to covalently label RNAs at their termini with a FRET pair of fluorophores. This direct end-labeling strategy targets the 5&#39;-phosphate by carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) activation and the 3&#39;-ribose by periodate oxidation, which can be adapted to other RNAs regardless of their size and sequence to study them independently of artificial modifications. Furthermore, the 5&#39;-EDC/NHS activation is of general interest to all nucleic acids with a 5&#39;-phosphate. The use of commercially available chemicals eliminates the need to synthesize RNA-specific probes.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy requires the surface-immobilized molecules of interest to be within the evanescent field to be illuminated. A sophisticated way of keeping the RNA molecules within the evanescent field is to encapsulate them in phospholipid vesicles. Encapsulation benefits from the best of both worlds, tethering the molecule to the surface while enabling free diffusion of the molecule. We ensure that each vesicle contains only a single RNA molecule, enabling single-molecule imaging. Upon dual-end labeling and encapsulation of the RNA of interest, smFRET measurements offer a dynamic and detailed view of RNA behavior.

<meta charset="utf8"></head><body>単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

This article describes the dual-color labeling of long RNAs at termini positions and their surface immobilization via encapsulation in phospholipid vesicles for single-molecule FRET TIRF microscopy applications. Combining these techniques enables precise visualization and analysis of RNA dynamics at the single-molecule level.

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

生物学

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

要約

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単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

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単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

単一分子FRET-TIRF顕微鏡法のための長鎖RNAの蛍光末端標識とカプセル化

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法