この技術は、局所化だけでなく、個々の卵母細胞および胚における候補mRNAの定量化を可能にする。PCRを含む他のアッセイと比較して、この技術の完成は、低い変動で再現可能なデータをもたらします。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるケルシー・ティムです。
テキストプロトコルに記載されているように、5〜8週齢で必要な物質および雌マウスの調製からこの手順を開始する。70%エタノールを使用してマウスを洗浄してください。腹腔を露出し、女性の生殖管を可視化します。
鉗子で卵巣を保持し、卵巣の周りから子宮靭帯および過剰脂肪組織を除去する。子宮から卵管を切ります。次に、卵巣オビダクトペアを35ミリメートル皿に温かく保持する媒体に入れます。
卵巣および周囲の脂肪組織を取り除く。半インチ27ゲージ針を使用して、卵管の腫れた腫れを引き裂きます。涙液の部位で卵性を押すと、cumulus細胞卵母細胞複合体が排出されます。
口腔管を用いて排卵卵子をヒアルロニダーゼを含む保持媒体を100マイクロリットルに移した。乳雲細胞を外すために、口ピペットで保持媒体を含むヒアルロニダーゼ中の2つの卵母細胞を上下に代謝してピペットする。それらがcumulus細胞を欠いているら、口のピペットを使用して、各卵母細胞を保持媒体のみを含む洗浄液に移す。
洗い液滴ごとにこれを繰り返します。断片化または透明な卵母細胞を転送しないでください。SM-FISH染色を行うために、最初に500マイクロリットルの固定バッファーを含む6つのウェルプレートの個々のウェルに卵母細胞を固定します。
ウェルに20個以下の卵母細胞を水没する。室温で20分間固定バッファーに卵母細胞をインキュベートします。テキストプロトコルに記載されているように卵母細胞を洗浄した後、室温で30分間パーメレーションバッファーに卵母細胞をインキュベートする。
別の洗浄に続いて、卵母細胞を室温で30分間、あらかじめ希釈したプロテアーゼ3バッファーの80マイクロリットルに移します。ナノグ、Pou5f1、およびDapB用の温め合ったプローブセットをプローブ希釈で1~50に希釈します。転写物特異的プローブの80マイクロリットルで、摂氏40度で2時間培養します。
卵母細胞がプローブ内にあり、AMP バッファが動く傾向にあります。卵母細胞を緩やかにバッファに押し込んで水没させることが不可欠です。卵母細胞を500マイクロリットルの洗浄バッファーに移し、室温で10分間インキュベートします。
さて、卵母細胞を増幅バッファーに順次インキュベートする。まず、80マイクロリットルのAMP1で卵母細胞を摂氏40度で30分間インキュベートする。その後、卵母細胞を室温で10分間洗浄バッファーの500マイクロリットルに移します。
次に、80マイクロリットルのAMP2で卵母細胞を摂氏40度で15分間インキュベートする。前のように卵母細胞を洗浄した後、80マイクロリットルのAMP3で卵母細胞を摂氏40度で30分間培養し、最後の洗浄を行います。最後に、80マイクロリットルのAMP4FLに摂氏40度で15分間卵母細胞を加えます。
試薬に泡を加えることなく、スライドの中央にアンチフェード実装媒体のピペット12マイクロリットル。できるだけ少ない洗浄バッファーで卵母細胞を取り付け媒体に移します。最後に、カバースリップを適用します。
Zステップ共焦点顕微鏡を使用して3次元の卵母細胞を画像化し、テキストプロトコルで説明されているように画像を保存します。ND2ファイルをフィジーにドラッグし、ハイパースタックを選択します。[イメージ]タブをクリックし、[色]を選択して、[チャネルを分割]をクリックして、ND2ファイルの蛍光チャンネルを分離します。
各蛍光チャネルの卵母細胞のZスライスごとに個別のTIFFファイルを生成します。これを行うには、[イメージ] タブをクリックし、[スタック] を選択して、[イメージにスタック] をクリックします。次に、[イメージ] タブをクリックし、[種類] を選択して[RGB カラー]をクリックし、各 Z スライスを個々の RGB カラー イメージに変換します。
変換された各イメージを TIFF ファイルとして保存します。ステッチ中の混乱を避けるために、蛍光チャネルごとに単一の卵母細胞の画像を新しいフォルダに配置します。テキストプロトコルの説明に従ってファイルを正規化した後、「プラグイン」タブをクリックし、「スティッチング」を選択して「グリッドコレクション」をクリックします。
ドロップダウンメニューから[連続画像]を選択し、[はい]をクリックします。ディレクトリを参照し、1 つの波長の個々の卵子のすべての Z スライス イメージを含むフォルダーを選択します。[はい] をクリックします。
ステッチされた画像の下部にあるスライダーを、使用する波長に適したカラーチャンネルに移動します。[画像]をクリックし、[種類]を選択して[RGB カラー]をクリックして、最終的な RGB ステッチ画像を作成します。ステッチされた画像を 32 ビットの最大投影画像に変換します。
これを行うには、[イメージ] をクリックし、[種類] を選択して 、[32 ビット] をクリックします。このイメージを新しい TIFF ファイルとして保存します。スポット検索およびトラッキング プログラムで、32 ビットステッチ画像を開きます。
[ローカライズ] ドロップダウンを選択し、[ローカライズ] をクリックすると、画像内で見つかったスポットの数が計算されます。ここに示されているのは、スポットファインダーとトラッキングを使用した mRNA の定量です。青い矢印は、しきい値を超える正の信号を指します。
白い矢印は、しきい値を下回る蛍光スポットを示し、したがってカウントされません。mRNAカウントは、その後、標準データ分析ツールを使用して分析されました。中央Zシリーズ画像の代表的な画像は、Pouf51とNanog用に示されています。
メタフェーズ上に整列した染色体のDAPI染色は、2本の紡錘が白色で示されている。このプロトコルで収集されたデータは、メタフェーズ2卵母細胞における775 Pouf51転写物および113ナノグ転写物を示した。重要なことに、DapBプローブで標識された卵母細胞では検出されたスポットはなく、負の対照として役立った。
非接着性細胞を使用する場合、SM-FISHキットからプロテアーゼバッファーの最適な希釈を実証的に同定することが重要です。mRNA検出は、1xPBS中の希釈されていないプロテアーゼバッファー濃度およびいくつかの希釈プロテアーゼバッファー濃度の滴定曲線を用いて試験した。このプロトコルで使用されるプロテアーゼ希釈は、2つの卵母細胞の分相中のPouf51 mRNAの平均蛍光発現の最も低い変動を示したため、1〜8であった。
標的タンパク質の免疫蛍光を同時に行い、RNA結合タンパク質と共にmRNAを同局化するために行うことができる。RNA結合タンパク質とのmRNAの共存により、研究者は卵母細胞または胚内のmRNAの貯蔵、翻訳、分解を調節するメカニズムを決定することができます。
