Name: methodology for sputum induction and laboratory processing
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing at JoVE.com

この作品は、リエージュ大学病院 (チュー リエージュ) によって支えられました。我々 はビデオ生産のための「瞬間プロダクション」を認めます。我々 はまた、セドリック フランソワ、映画に登場した患者を認めます。

このセクションで説明するすべてのメソッドは、リエージュ大学病院の倫理委員会によって承認されているし、すべての健常者が参加の書面によるインフォームド コンセントを与えた。
1. 喀痰誘発
<ol>
	<li>前と後の気管支拡張剤のスパイロメトリー
	<ol>
		<li>スパイロメトリーを実行 (1 秒 [fev 社1] の強制 expiratory ボリュームと肺活量 [FVC] 操縦) アメリカ胸部学会 (ATS) によると/欧州呼吸器学会 (ERS) 標準条件12。</li>
		<li>スペーサー デバイスを介してメーター用量吸入器 (MDI) から 400 μ g 吸入サルブタ モールを管理します。 注: 大人、吸入サルブタ モールの有害事象は振戦、頻脈の13を含みます。</li>
		<li>スパイロメトリー (fev 社1と FVC 操縦) 15 分後で繰り返す、ATS/ERS 基準12によると。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超音波ネブライザーの準備 注意: ネブライザーする必要があります徹底的に洗浄・消毒製造元の指示に従い、各使用する前に。<ol>
		<li>推奨レベルまで蒸留水でネブライザー室を埋めます。</li>
		<li>ネブライザー室にクリーン カップを置きます。</li>
		<li>適切なふた付きカップをカバーします。</li>
		<li>後気管支拡張剤 fev 社1患者の高張生理食塩水 (5%) のいずれかの 50 mL のカップを埋める &#62; 65% 予測または 50 mL の等張生理食塩水 (0.9%) 後気管支拡張剤 fev 社1≤65% 予測患者の。</li>
		<li>カップにサルブタ モール硫酸塩溶液 (5 mg/mL) の 1.75 mL を追加します。</li>
		<li>チューブとバルブ製造元の指示に従って接続します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ネブライザーと喀痰のコレクション 注: は、医療監督の下で技術を実行します。<ol>
		<li>患者への手順を説明します。</li>
		<li>鼻クリップを使用する患者をお願いします。</li>
		<li>噴霧器をオンし、エアロゾルとファンの設定の最下位のレベルを選択します。</li>
		<li>5 分の呼吸法とマウスピースを介してエアロゾルを吸入する患者をお願いします。 注: 患者の耐性に応じてエアロゾルとファンの設定を増加可能性があります。<ol>
			<li>耐え難い咳や吐き気、場合の手順を中止し、1.3.5 の手順に進みます。</li>
			<li>胸の圧迫感や呼吸苦、1.3.8 のステップに移動します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>噴霧器をオフにします。</li>
		<li>鼻クリップを削除し、水で口をすすぎ、シンクにそれを破棄する前に 2 回うがい患者をお願いします。 注: 唾液細胞が痰のサンプルを汚染して使用できなくなるサンプルに 。</li>
		<li>プラスチックの容器に痰を咳をする患者をお願いします。</li>
		<li>Fev 社1を測定するスパイロメトリー (強制呼出) を実行します。</li>
		<li>Fev 社1秋を次のように評価: (fev 社1は 3.8 [mL] のステップで測定される) - (1.3 [mL] のステップで測定後気管支拡張剤 fev 社1 )/(1.3 [mL] のステップで測定後気管支拡張剤 fev 社1 ) * 100。<ol>
			<li>Fev 社1後気管支拡張剤値から 20% 以上該当する場合は、手順を中止します。Fev 社1再び 10 分後を測定します。Fev 社1には、20% 以上が該当する場合は、噴霧イプラトロピウム臭化物 (0.25 mg/2 mL) を管理し、医療観察下の患者に医師を求めます。1.3.10 手順に進みます。</li>
			<li>Fev 社1が後の気管支拡張剤の値から 20% 以上でない場合、手順 3.2 〜 3.9 1 ~ 3 回 10 〜 20 分の合計ネブライザー時間に到達します。 注: 合計ネブライザー時間は痰のサンプルの量と質 (プラグまたは粘性部品の存在) になります。サンプルの質や量が悪い場合ネブライザーの 10 分後、手順を拡張して、15 〜 20 分の合計ネブライザー時間に到達する必要があります。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>冷蔵処理まで痰のサンプルを保ちます。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 喀痰処理
注: 最適な細胞生存率のサンプリングの 3 時間以内、喀痰を処理します。
注意: は、白衣、防護手袋、ゴーグルを着用します。
<ol>
	<li>予備の準備
	<ol>
		<li>滅菌蒸留水 10 mL を製造元の指示に従って、6.5 ミリメートルのソリューションを取得する集中ジチオトレイトール ソリューション (粘液溶解剤) の 10 倍希釈を行います。 注: 集中ジチオトレイトール ソリューション周囲の空気との混合を防ぐために、ソリューションから撤退バイアル滅菌注射器と針で。開いたら、濃縮液バイアルを室温で保管し、5 日以内に使用する必要があります。希釈した溶液を毎日用意しています。 注意: 目や皮膚の炎症の危険性のため保護具 (衣類、手袋とゴーグル) を着用します。</li>
		<li>ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水 (DPBS) 0.08% 解を得るためトリパン ブルー溶液 (0.4%) の割増希釈を行います。この希釈液を室温で維持し、2 週間以内に使用します。 注意: 発癌性の危険のため保護具 (衣類、手袋、ゴーグル) を着用します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>喀痰培養上清のコレクション
	<ol>
		<li>50 mL コニカル下部のプラスチック製のチューブで全体の喀痰を転送し、サンプルの重量を量る。</li>
		<li>DPBS ソリューションの 3 倍の重量を追加します。</li>
		<li>ゆっくりと渦 30 サンプル s。</li>
		<li>遠心 800 x g、4 ° C で 10 分間します。</li>
		<li>滅菌ガーゼの 2 層を通して試料をフィルター処理し、50 mL コニカル下部のプラスチック製のチューブに上清を収集します。</li>
		<li>分注 2 mL プラスチックの上澄みチューブ、-80 ° C で保存 注: 清サンプル、喀痰流体相コンポーネントを試金するために役立ちます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>喀痰孟
	<ol>
		<li>必要に応じて、細胞懸濁液 5 mL の容量に到達する細胞ペレットに DPBS を追加します。</li>
		<li>6.5 mM ジチオトレイトールが 1 つのボリュームに細胞懸濁液を希釈します。ベンチ ロッカーを使用して、室温で 20 分間細胞懸濁液をロックします。<ol>
			<li>DPBS と少なくとも 3 回を繰り返します。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>550 x g と 10 分のための 4 ° C で希釈した細胞懸濁液を遠心します。</li></ol></li></ol>上清を捨てます。
		<li>DPBS 約 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	
	
	<li>検定数によって痰のサンプル (細胞濃度、扁平上皮細胞の汚染、トリパン ブルー排除法による生存率) の質的特性の評価
	<ol>
		<li>評価し、細胞懸濁液の正確な量を記録します。</li>
		<li>0.08% トリパン ブルー溶液を 50 μ l 添加に細胞懸濁液 50 μ L を追加し、均質化します。</li>
		<li>検定 (トーマ部屋) の coverslip の下でサンプルを入れて光学顕微鏡 (400 倍) の下に置きます。</li>
		<li>扁平上皮細胞、非扁平上皮細胞 (未塗装細胞) と死んで非扁平上皮細胞を数える (青色塗装のセル)。 注: 場合低すぎるか高すぎる細胞密度、集中し、または細胞懸濁液を希釈、手順 2.4.1-2.4.3 を繰り返します。</li>
		<li>細胞濃度懸濁液、扁平上皮細胞の割合、非扁平上皮癌細胞の割合を評価します。 注: 計算結果喀痰の総非扁平上皮細胞数/g: 細胞懸濁液 (ステップ 5.4) の濃度 * 細胞懸濁液 (ステップ 4.8) のボリューム * % 非扁平上皮細胞の/重量の痰のサンプル (ステップ 2.2.1)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ステンド グラス cytospin の準備が必要な場合細胞懸濁液の残留細胞のストレージとスライドします。 注: 細胞懸濁液に扁平上皮癌の 80% 以上が含まれている場合サンプルのセルと見なされます貧しい品質と cytospin スライド14には不向き。その場合は、処理を中断し、失敗したこのサンプルを検討します。<ol>
		<li>細胞懸濁液 500,000 セル/mL の細胞懸濁液の少なくとも 350 μ L を取得する DPBS の因数を希釈します。</li>
		<li>製造元の指示に従って、セルのコンセントレーターを組み立てます。</li>
		<li>この細胞懸濁液を 100 μ l 添加でセル コンセントレーターの 3 コンパートメントの各を入力します。</li>
		<li>収集で 150 x g と常温で 2 分間スピンします。培養上清を捨てます。</li>
		<li>製造元の指示に従って、セルのコンセントレーターを逆アセンブルします。</li>
		<li>乾燥空気にスライドを許可します。 注: この段階で残留セル格納できます十分なバッファー内のさらなる実験に必要な場合。</li>
		<li>商業染色スライド キット (材料の表を参照)、製造元の指示に従って汚れ。</li>
		<li>メディアを適切なマウントとカバー スリップ、スライドをマウントします。</li>
		<li>オイルの液浸と光学顕微鏡 (600 X) の下でスライドを配置します。</li>
		<li>少なくとも 500 の非扁平上皮細胞をカウント: 好中球、好酸球、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞。 注: 差動細胞数は通常 1 つだけが実行または 2 つは専用判定不一致を制限するオブザーバーを訓練を受けた。</li>
		<li>レコードの絶対値と各セルのパーセンテージを入力します。</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
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V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects.">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li><li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum:+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination.">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

誘発喀痰法は、気道のコンパートメントを勉強する役に立つツールです。この手法のいくつかの用途があります。最初に、それは免疫細胞と様々 な呼吸器疾患に関与するメカニズムについての知識が向上します。たとえば、この方法は、患者の大規模コホートで気道炎症の調査を許可している、喘息患者の約半分が、気道の異常好酸球性炎症15,によって特徴付けられることが示されています。16,17, COPD 患者は通常発生した喀痰中の好中球を展示中は、18 をカウントします。この手法は、特発性肺線維症患者における気道炎症のより良い評価してこの病19に貢献するかもしれない証拠調停にも貢献しています。第二に、誘発喀痰法は治療への反応を予測する役に立つかもしれません。たとえば、喀痰中好酸球の割合が異常の存在はステロイド反応性11,18の予測マーカーに示されています。喘息や COPD、11 現在臨床ガイドラインに従って治療を調整するよりも増悪の減少に効果的であることが示された喀痰中好酸球の割合を正規化するコルチコステロイドの投与量を調整 ,20,21。第三に、喀痰分析はターゲットを絞った治療法の開発に役立つことがあります。たとえば、COPD と気管支喘息患者の喀痰中好中球の異常な数の存在は、antineutrophilic 治療11の開発につながっています。第四に、技術は、診断で役割を果たす可能性があります。たとえば、喀痰中好酸球の存在は非喘息好酸球性気管支炎11の診断をする必要です。
差動細胞数を取得するには、ほか喀痰を誘導する手法は、喀痰培養上清または喀痰細胞を研究することによって多くの追加解析のパフォーマンスもことができます。喀痰培養上清中のメディエーター8,19,22の分析と好酸球22サンプルの遊走活性の評価があります。喀痰細胞から RNA を抽出してマイクロ Rna を使用できるまたは遺伝子発現解析19,23 。喀痰細胞は、とりわけ、診療とセルを並べ替えできる流れ cytometry9,23で分析できます。さらに、喀痰細胞培養10日をすることができ、その伝達物質産生体外測定24をすることができます。それはここでは注目に値する、調停内容がわかること喀痰の培養上清から異なります。確かに、居住者の気道からの分泌物、喀痰細胞培養モデル24に反して、プラズマ滲出喀痰培養上清中メディエーターを影響可能性があります。最後に、免疫細胞化学およびその場で交配も行える喀痰細胞7を使用します。
誘発喀痰法には、いくつかの制限があります。誘導は、医療監督の下で行う必要があります。また、患者に徹底した指示を与えるオペレーターのために不可欠です。他の制限には呼吸努力が必要な協力と患者の健康状態が含まれます。子供でこの技術の可能性について成功と256 歳以上のお子様に安全なだったいくつかの研究を報告しています。上の子のデータ &#60;25, 6 歳に欠けているが、それは喀痰誘発がそれらの子供14で行うことは困難である可能性。技術は、それが技術的に困難な時間のかかる、それは訓練を受けたスタッフ1を必要とするので、サービス、専門センターを研究に制限されています。別の制限は、喀痰誘発と分析の手法は、常に成功すると、読みやすい cytospin26常に得られないことを意味ないです。ただし、成功率は約 80% 患者4,26,27,28,29の異なるコホートでは通常。喀痰細胞数30,31に影響を与えるようだった時代のマッチングについての患者の別のコホートを比較するとき最後に、注意が必要です。同様に、ジェンダーとタバコの習慣などの他のパラメーターは、彼らはまた、喀痰細胞数29,32妨げる可能性があるに一致しなければなりません。患者照合が不可能な年齢、性別、喫煙の有無を考慮する別の方法これらの特性の統計的分析を調整することです。
誘発喀痰法気道生検、気管支肺胞洗浄などから細胞を集めることができる他の技術と比較して単純な安定、安全、再現性、費用効率、および非侵襲的であることの利点があります。これらの利点は大規模で、時間をかけて、繰り返し実行する誘発喀痰法の許可し、気道サンプリングに最適な代替は。Bronchosorption は、気道メディエーター33を査定するために粘膜内層流体のコレクションを許可する別の手法です。このテクニック (必要とする気管支鏡検査) は誘発喀痰検査法よりも、唾液で汚染を回避し、気管支肺胞洗浄33より仲介人の高い濃度を得ることの利点があります。
重要なステップには、プロトコルでは注意が必要。最初に、これらの 2 つのパラメーターが結果に影響を与える標準化された34,35になっているために、生理食塩水の濃度および、誘導時間をに関する注意を取られなければなりません。第二に、DTT の孟は処理の重要なステップです。PBS と比較してより喀痰細胞7スライド、cytopsin、品質が向上し、再現可能なセルの数2を持つことが不可欠ですを分散させる DTT を示した。ただし、粘液溶解剤は、生化学成分の測定を妨げる可能性があります。実験をスパイクは、新しい生化学的化合物36を測定するときに、実行する必要があります。最後に、プロシージャのもう一つの重要なステップは信頼性と解釈できる結果を確保するための訓練を受けた技術者が行う必要があるステップを数えるセルです。
全体の痰ではなく喀痰プラグ (粘性や密度の高いパーツ) を使用して別の方法は文献7に説明されています。両方の技術の長所と短所があります。全体喀痰手法によりより迅速な処理7が、頻繁にサンプルを希釈し、cytospins2,7の質を減らすことができます唾液で汚染されています。プラグ選択手法でサンプルが cytospin スライド7流体相のメディエーターの投与のためのより良い品質の多いことを意味する唾液の汚染は低減されます。処理はしかし長く7と選択したプラグは、サンプル全体の37の代表できない場合があります。またすべてのサンプルを含むプラグ、制限することができますは注目に値するです。両方のメソッドは、検証と再現と両方これらのメソッドから取得した差分のセル数が異なる14,38だという証拠がないです。
将来は、誘発喀痰検査法を臨床ツールとして使用して、調査、診断、および炎症性呼吸器疾患のすべての種類の管理のためのバイオ マーカーを提供する可能性があります。

気道炎症を調べるにいくつかの方法を使用: 直接測定 (気管支生検、気管支肺胞洗浄など) と間接法 (症状評価のような血液サンプルの分析および肺機能検査)1。直接テクニック確実に気道炎症を評価するという利点がありますが、侵襲と不可能で大規模な患者の不快感のため、リスク発生1。間接法としては不十分な気道炎症1の直接の評価と相関する彼ら。
喀痰コレクション気道からサンプル細胞に別の方法、気道炎症の直接の評価を可能です。それにもかかわらず、自発的に痰の生産質の悪いサンプルにつながる可能性があります、すべて患者2は不可能します。この問題は、喀痰生産2を誘発する超音波噴霧高張生理食塩水を使用してによって克服されています。このメソッドは、ニューモシスチス ・ カリニ肺炎3の診断用ひと免疫不全ウイルス (HIV) に感染した患者に使われた当初、健常者と喘息患者 1992年4に適応されました。喀痰誘発は等張生理食塩水5を使用してもより深刻な患者で可能であります。一般的に忍容されている生理食塩水の吸入は hyperresponsive 航空5患者の気管支けいれんを引き起こす可能性があります。したがって、手順1の前に短時間作用の β 作動薬を管理することをお勧めします。さらに、我々 は以前超音波ネブライザーで食塩にサルブタ モールを追加することでこのリスク6さらに減少したことを示しています。喀痰誘発の利点は、それは非侵襲的な2 、5のとき適切な安全予防措置です。
喀痰サンプルの処理の 2 つの方法は文献で現在使用されて: 全体痰法とプラグの選択7。当研究室全体痰法が行われます。喀痰処理の主な目的は、炎症気道内腔に存在の種類を研究する差分セル数を取得することです。ただし、多くの追加解析は喀痰培養上清中8で仲介人を研究することによって、または喀痰細胞の詳細な調査を実行することによってさらに炎症性プロセスおよび免疫のメカニズムを調査することも (など、流れ cytometry9セル文化10、ゲノム10、プロテオミクス10、免疫細胞化学7の in situハイブリダイゼーション7、等)
喀痰誘発と分析の手法は、現在は技術的に困難な時間のかかる、1訓練を受けたスタッフが必要ですのでサービス、臨床専門センターを研究に限定されます。気道の炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、慢性の咳、または特発性肺線維症11のような様々 な呼吸器疾患のためこの方法で調査されるかもしれない。

<table><tbody><tr><td>Spirometer - Spirobank</td><td>MIR France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>See drug available in the country</td></tr><tr><td>Nebulizer UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb Disposable Cups &amp;amp; Lids</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>One-way Valves</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>One-way Valves</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol T-connector&amp;nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>Ventilation circuit monobranch corrugated</td><td>Int&#039;Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&amp;nbsp;</td><td>/</td><td>/</td><td>Produced by our hospital pharmacy</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0.9%</td><td>B.Braun Medical&amp;nbsp; Diegem Belgium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>See drug available in the country</td></tr><tr><td>Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Germany</td><td>CNK: 1543-305</td><td>See drug available in the country</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>LONZA Belgium</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Sputolysin reagent</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4% solution 100 mL</td><td>LONZA Bio Whittaker Belgium</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer - Thoma chamber</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor Stainig set</td><td>Merck Belgium</td><td>1116610001</td><td>Alternative product&amp;nbsp; : Diff Quik Staining Set&lt;br/&gt; &amp;nbsp;Medion Diagnostic&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mounting medium - Entellan</td><td>Merck Belgium</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Belgium</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

methodology for sputum induction and laboratory processing

喀痰誘発と処理の手法はコレクション、喘息、慢性閉塞性肺疾患 (COPD) のような様々 な呼吸器疾患における興味深いである気道からの細胞の分析を許可する認められた非侵襲的な方法慢性の咳、または特発性肺線維症。この手法はよく容認、安全かつ非侵襲的、技術的に困難、時間のかかるは、訓練を受けたスタッフが必要ですので、臨床研究サービスおよび専門センターに現在限定は。喀痰誘発の解析成功率は約 80% です。
ここでは、喀痰の誘導および実験室の処理について述べる.サルブタ モールと高張または等張生理食塩水の吸入による喀痰。処理全体痰テクニックを使用します。ジチオトレイトール (DTT) は、喀痰の孟を許可する使用されます。喀痰処理の主な目的は、気道の内腔内にあるセル型を研究する差分セル数を取得することです。追加の分析は、喀痰培養上清中の炎症性プロセスや免疫機構に調査を進めることがありますの喀痰細胞も実行可能性があります。喀痰培養上清中メディエーターを勉強し、フローサイトメトリー、ゲノミクス、プロテオミクスなどの喀痰細胞の解析の大きいスペクトルを実行するがあります。
最後に、健常者、喘息、COPD 患者の喀痰分析の代表の結果が掲載されています。

検定 典型的なイメージは、検定を用いた顕微鏡で可視化した図 1に示すように。扁平上皮細胞は識別簡単に彼らが非扁平上皮細胞よりもはるかに大きい。これらの扁平上皮細胞、上皮細胞、口の中から来る。両方の種類の細胞はトリパン青死んだとき汚れます。酵母、細菌、およびスクラップをカウントを避けるために注意する必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
図 1: 死んで非扁平上皮細胞と、(C)、扁平上皮細胞 (A) 生活非扁平上皮細胞、(B) を示す検定画像。スケールバー = 50 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
Cytospin スライド: 喀痰処理後に得られる cytospin スライドの代表イメージを図 2に示します。形態と色によって、異なる種類の細胞 (好中球、好酸球、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞) を区別できます。いくつかのケースで扁平上皮細胞による汚染は重要な可能性があり、扁平上皮細胞の割合が 80% を超える場合、サンプルは失敗した (図 3)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
図 2:好中球、マクロファージ、好酸球、(C) (D)、リンパ球 (B) (A) を示す Cytospin スライド画像と上皮細胞 (E)。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
図 3:質の悪い cytospin スライドの例 &#62; 扁平上皮細胞の 80%。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
成功率 当科で (成功した誘導と読める cytospin を組み合わせた) プロシージャの成功率 1,129 患者 (健常者、喘息または COPD 患者) のサンプルに基づく、82% (924/1,129) です。患者のタイプによるとサブ解析で成功率は 75% (57/76) 健常者で、82% (827/1,004) 喘息、COPD 患者の 82% (40/49)。
健常者の結果 当科の中央 (四分位範囲) から 289 健常者のシリーズのレトロスペクティブ分析で 3.72 g (四分位幅 2.46 g-5.54 g) であり、喀痰の中央値の合計非扁平上皮細胞数/g が x 106 (0.59 喀痰重量0.37 x 10 の四分位範囲6 - 1.29 × 106)。
、それらの健常者に扁平上皮細胞の比率は 19% (10%-34%) と低水準と生存率は 66% (54 78%) に高い。異なった細胞のタイプの割合に関する結果は、図 4 aにまとめたものです。マクロファージ (49% [31-68%]) の比率中リンパ球 (2% [1-3]) の割合 (34% [14%-60%])、好中球の割合よりも高くなって、好酸球 (0% [0% 0%]) と上皮細胞 (4% [2 11%]) が低いことがわかります。これらの結果は、データを絶対値 (図 4 b) で表現した場合に似ています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
図 4:健常者にみられる差動細胞数の代表の結果は絶対値をパーセンテージ (A) または (B) で表されます。結果は、中央 (四分位幅) として表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
また、患者の年齢を考慮することが重要です。確かに、強い相関が痰のサンプル (図 5) 患者さんの年齢と好中球の割合の間に存在。同様に、10 年間の年齢別グループ (図 6) によると患者を分類するとき増加する年齢と好中球の割合が大幅に増加を見ました。したがって、別のコホート研究の結果を比較するときにこの変数を考慮する必要があり、主題の一致に注意する必要があります。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
図 5:年齢および喀痰中の好中球の割合の相関。相関関係を求めたスピアマン テスト。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
図 6:年齢カテゴリによると好中球比率の進化します。分散分析の p 値は &#60; 0.0001 好中球の割合年齢クラス間の比較のため。複数の比較は、ダンの多重比較検定で作られました。P 値は次のように表されます: * p &#60; 0.05 * * p &#60; 0.01 と * * * p &#60; 0.001。結果は、中央 (四分位幅) として表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
呼吸器疾患を患っている患者の結果 誘発喀痰検査法のテクニックは、気管支喘息患者における炎症細胞プロファイルを評価するために使用されます。この手法は、別の炎症性呼吸器疾患、COPD を患っている患者にも適用可能性があります。健常者、喘息、COPD 患者 (年齢、性別、およびタバコの習慣の一致する 3 つのグループ) を比較すると、炎症性細胞プロファイルは全然違うこれらのコホート (図 7) を観測しました。確かに、気管支喘息患者通常によって特徴付けられる上げられた喀痰中好酸球、喀痰中好中球の割合は、健常者に比べて COPD 患者で通常より高い疾患重症度に結びついています。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
図 7:健常者の喀痰炎症細胞プロファイル (n = 45)、気管支喘息患者 (n = 108)、および COPD 患者 (n = 54).3 つのグループは、性別、年齢、タバコの習慣に一致しました。ANOVA の p 値が &#60; 0.05、&#60;、0.0001 と &#60; 0.0001 好中球、好酸球、マクロファージ、グループ間の比較のためそれぞれ。複数の比較は、ダンの多重比較検定で作られました。P 値は次のように表されます: * p &#60; 0.05 と * * * p &#60; 0.001。結果は、中央 (四分位幅) として表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

ここで喀痰誘発の手法について述べる。このプロトコルは、喀痰処理差分セル数を数えるために、喀痰培養上清を収集するために、さらなる分析のための細胞にも説明します。

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

27.4K ビュー.  University of Liege. ここで喀痰誘発の手法について述べる。このプロトコルは、喀痰処理差分セル数を数えるために、喀痰培養上清を収集するために、さらなる分析のための細胞にも説明します。

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<meta charset="utf8"></head><body>誘発喀痰分析による肺マクロファージ中の炭素の定量化

Measuring Carbon Content in Airway Macrophages Exposed to Carbon-Containing Particulate Matters

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with sputum, rendering macrophages and particles visible and quantifiable under light microscopy. Notably, elemental carbon within the mammalian body originates exclusively from external contaminants. Consequently, the carbon content in airway macrophages (CCAM) serves as a valid exposure biomarker, accurately estimating individual exposure to carbon-containing particulate matter (PM). This article delineates a protocol involving sputum collection, preservation, processing, slide preparation, and staining, as well as macrophage photo acquisition and analysis. After removing the macrophage nuclei, the proportion of cytoplasm area occupied by carbon particles (PCOC) was calculated to quantify carbon content in each macrophage. The results indicate an elevation in CCAM levels after exposure to carbon-containing PM. In summary, this non-invasive, precise, reliable, and standardized method enables the direct measurement of carbon particles within target cells and is utilized for large-scale quantification of individual CCAM through induced sputum.

<meta charset="utf8"></head><body>炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

This article describes a detailed experimental protocol for measuring the carbon content of airway macrophages with the aim of assessing the internal exposure dose at the level of individual particulate matter exposure.

炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

Pulmonary macrophages exhibit a dose-dependent pattern in phagocytizing particles. Following engulfment, these macrophages are subsequently excreted with ...

環境学

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the host&#39;s microbial community. To disentangle the origin of microbial VOCs, volatile headspace analysis of bacterial mono- and co-cultures of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Acinetobacter baumannii, and stable isotope probing in biological samples of feces, saliva, sewage, and sputum were performed. Mono- and co-cultures were used to identify volatile production from individual bacterial species or in combination with stable isotope probing to identify the active metabolism of microbes from the biological samples.
Vacuum-assisted sorbent extraction (VASE) was employed to extract the VOCs. VASE is an easy-to-use, commercialized, solvent-free headspace extraction method for semi-volatile and volatile compounds. The lack of solvents and the near-vacuum conditions used during extraction make developing a method relatively easy and fast when compared to other extraction options such as tert-butylation and solid phase microextraction. The workflow described here was used to identify specific volatile signatures from mono- and co-cultures. Furthermore, analysis of the stable isotope probing of human associated biological samples identified VOCs that were either commonly or uniquely produced. This paper presents the general workflow and experimental considerations of VASE in conjunction with stable isotope probing of live microbial cultures.

This protocol describes the extraction of volatile organic compounds from a biological sample with the vacuum-assisted sorbent extraction method, gas chromatography coupled with mass spectrometry using the Entech Sample Preparation Rail, and data analysis. It also describes culture of biological samples and stable isotope probing.

真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

生化学

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

免疫・感染学

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

等温増幅法を用いたヒト呼吸器細菌感染症診断

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

著者スポットライト:マイクロ流体チップを使用した呼吸器病原体の迅速な検出の進歩 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

要約

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炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

嚢胞性線維症患者の喀痰中の緑膿菌の可視化

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

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炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

嚢胞性線維症患者の喀痰中の緑膿菌の可視化