Questo lavoro è stato supportato dall'ospedale università di Liegi (Liege CHU). Riconosciamo "Produzioni di istanti" per la produzione video. Riconosciamo anche Cedric François, il paziente che è apparso nel film.

Tutti i metodi descritti in questa sezione sono stati approvati dal comitato etico dell'ospedale università di Liegi e tutti i soggetti sani ha dato il consenso informato per la partecipazione.
1. espettorato indotto
<ol>
	<li>Spirometria pre- e post-broncodilatatore
	<ol>
		<li>Eseguire una spirometria (volume espiratorio forzato in 1 secondo [FEV1] e manovra di capacità vitale forzata [FVC]) secondo l'American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) criteri standard12.</li>
		<li>Amministrare 400 µ g di salbutamolo inalato da un inalatore di dosi controllate (MDI) attraverso un dispositivo distanziatore. Nota: Negli adulti, gli eventi avversi di salbutamolo per via inalatoria includono tremore e tachicardia13.</li>
		<li>Ripetere spirometria (FEV1 e manovra di FVC) 15 minuti più tardi, secondo i criteri standard ATS/ERS12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione del nebulizzatore ad ultrasuoni Nota: Il nebulizzatore deve essere accuratamente pulito e disinfettato prima di ogni utilizzo, in conformità con le istruzioni del produttore.<ol>
		<li>Riempire la camera di nebulizzazione con acqua distillata fino al livello consigliato.</li>
		<li>Collocare una tazza pulita nella camera di nebulizzazione.</li>
		<li>Coprire la tazza con il coperchio adatto.</li>
		<li>Riempire la tazza con entrambi 50 mL di soluzione salina ipertonica (5%) per un paziente con post-broncodilatatore FEV1 &#62; 65% preveduto o 50 mL di soluzione fisiologica (0,9%) per un paziente con post-broncodilatatore FEV1≤ 65% preveduto.</li>
		<li>Aggiungere 1,75 mL di soluzione di solfato di salbutamolo (5 mg/mL) per la tazza.</li>
		<li>Collegare i tubi e le valvole secondo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccolta dell'espettorato e nebulizzazione Nota: Eseguire la tecnica sotto controllo medico.<ol>
		<li>Spiegare la procedura al paziente.</li>
		<li>Chiedere al paziente di utilizzare un clip del naso.</li>
		<li>Accendere il nebulizzatore e selezionare il livello più basso delle impostazioni di aerosol e ventilatore.</li>
		<li>Chiedere al paziente di inalare l'aerosol attraverso il boccaglio con respirazione di marea per 5 min. Nota: Le impostazioni di Aerosol e ventilatore possono essere aumentate a seconda della tolleranza del paziente.<ol>
			<li>In caso di tosse insopportabile o nausea, interrompere la procedura e passare al punto 1.3.5.</li>
			<li>In caso di senso di costrizione toracica o disagio respiratorio, andare al punto 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Spegnere il nebulizzatore.</li>
		<li>Chiedere al paziente di rimuovere la clip da naso, sciacquare la bocca con acqua e fare dei gargarismi due volte prima di scartarlo nel lavandino. Nota: Le cellule di Saliva possono contaminare il campione di espettorato e portare a un campione inutilizzabile.</li>
		<li>Chiedere al paziente di tosse con espettorato in un contenitore di plastica.</li>
		<li>Eseguire una spirometria (una manovra espiratoria forzata) per misurare il FEV1.</li>
		<li>Valutare la caduta FEV1 come segue: (FEV1 misurata al punto 3.8 [mL]) - (post-broncodilatatore FEV1 misurata al punto 1.3 [mL]) / (post-broncodilatatore FEV1 misurata al punto 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>Se il FEV1 cade da 20% o più dal valore post-broncodilatatore, interrompere la procedura. Misurare il FEV1 nuovo 10 min più tardi. Se il FEV1 cade 20% o più, chiedere al medico di amministrare il bromuro di ipratropium nebulized (0,25 mg/2 mL) e tenere il paziente sotto osservazione medica. Andare al passaggio 1.3.10.</li>
			<li>Se il FEV1 non rientra del 20% o più dal valore post-broncodilatatore, ripetere i passaggi da 3.2 a 3,9 una a tre volte per raggiungere un tempo di nebulizzazione totale di 10-20 min. Nota: Il tempo di nebulizzazione totale dipenderà dalla qualità (presenza di spine o parti viscosi) e la quantità del campione dell'espettorato. Se la qualità del campione e/o la quantità è scarsa dopo 10 min di nebulizzazione, la procedura dovrebbe essere estesa per raggiungere un tempo di nebulizzazione totale di 15-20 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mantenere il campione di espettorato refrigerato fino al trattamento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. espettorato elaborazione
Nota: Processo di espettorato entro 3 ore dal campionamento per la vitalità cellulare ottimale.
Attenzione: Indossare un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali di protezione.
<ol>
	<li>Preparazioni preliminari
	<ol>
		<li>Preparare una diluizione di 10 volte della soluzione concentrata dithiothreitol (agente mucolitico) con acqua distillata sterile per ottenere 10 mL di una soluzione di 6,5 mM, in conformità con le istruzioni del produttore. Nota: Al fine di prevenire dithiothreitol concentrato soluzione di miscelazione con l'aria ambiente, aspirare la soluzione dal flaconcino con una siringa sterile ed ago. Una volta aperto, il flacone di soluzione concentrata deve essere conservato a temperatura ambiente e utilizzato entro 5 giorni. Al mattino vi attende la soluzione diluita. Attenzione: A causa del pericolo di irritazione di occhi e pelle, indossare indumenti protettivi (abbigliamento, guanti e occhiali di protezione).</li>
		<li>Fare una 5 volte la diluizione del blu di trypan (0,4%) con di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) per ottenere una soluzione di 0,08%. Tenere questa soluzione diluita a temperatura ambiente ed utilizzare entro 2 settimane. Attenzione: A causa di rischi cancerogeni, indossare indumenti protettivi (abbigliamento, guanti e occhiali di protezione).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccolta di espettorato surnatante
	<ol>
		<li>Trasferire l'intero espettorato in un tubo di plastica fondo conico da 50 mL e pesare il campione.</li>
		<li>Aggiungere un peso 3 volte di soluzione DPBS.</li>
		<li>Lentamente Vortexare il campione per 30 s.</li>
		<li>Centrifuga a 800 x g e a 4 ° C per 10 min.</li>
		<li>Filtrare il campione attraverso 2 singoli strati di garza sterile e raccogliere il surnatante in un tubo di plastica fondo conico da 50 mL.</li>
		<li>Aliquota del surnatante in 2 mL in plastica tubi e conservarli a-80 ° C. Nota: Surnatante campioni sono utili per analisi componenti fase fluida dell'espettorato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mucolysis espettorato
	<ol>
		<li>Se necessario, Aggiungi DPBS il pellet cellulare per raggiungere un volume totale della sospensione di cellule di 5 mL.</li>
		<li>Diluire la sospensione cellulare con 1 volume di 6,5 mM dithiothreitol. Utilizzare un bilanciere panca al rock la sospensione cellulare per 20 min a temperatura ambiente.<ol>
			<li>Ripetere almeno 3 volte con DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare diluito a 550 x g e a 4 ° C per 10 min.</li></ol></li></ol>Scartare il surnatante.
		<li>Risospendere il pellet cellulare in circa 1 mL di DPBS.</li>
	
	
	<li>Valutazione delle proprietà qualitative del campione dell'espettorato (concentrazione delle cellule, cellule squamose contaminazione e attuabilità di metodo di esclusione del Trypan Blue) dal conte emocitometro
	<ol>
		<li>Valutare e registrare l'esatto volume della sospensione cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di sospensione cellulare a 50 µ l della soluzione di blu di trypan 0,08% e omogeneizzare.</li>
		<li>Mettere il campione sotto il vetrino coprioggetto di un emocitometro (camera di Thoma) e posizionarlo sotto il microscopio ottico (400 X).</li>
		<li>Contare le cellule squamose, il vivente non squamocellulare cellule (incolore) e le cellule morte non squamocellulare (celle colorate di blu). Nota: In caso di densità cellulare troppo bassa o troppo alta, concentrare o diluire la sospensione cellulare e ripetere i passi 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Valutare la concentrazione cellulare di sospensione, la percentuale delle cellule squamous e la percentuale di vitalità delle cellule non squamocellulare. Nota: Calcolare il conteggio totale delle cellule non squamocellulare/g di espettorato: cella concentrazione della sospensione (punto 5.4) * volume della sospensione cellulare (passo 4.8) * % di cellule non squamocellulare / peso del campione dell'espettorato (punto 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione di un macchiato cytospin scivolare con la sospensione cellulare e lo stoccaggio di cellule residue, se necessario Nota: Se la sospensione cellulare contiene più di 80% squamose cellule, il campione è considerato poveri qualità e inadatto per una diapositiva di cytospin14. In tal caso, interrompere il trattamento e considera questo esempio infruttuoso.<ol>
		<li>Diluire una parte aliquota della sospensione delle cellule con DPBS per ottenere almeno 350 µ l di sospensione cellulare a 500.000 cellule/mL.</li>
		<li>Assemblare il concentratore di cella in conformità con le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Riempire ciascuna delle 3 scomparti del concentratore delle cellule con 100 µ l di sospensione cellulare.</li>
		<li>In una citocentrifuga, spin per 2 min a 150 x g e a temperatura ambiente. Eliminare i sovranatante.</li>
		<li>Smontare il concentratore di cella in conformità con le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Lasciare asciugare all'aria. Nota: In questa fase, le cellule residue possono essere memorizzate in un buffer adeguato se necessario per ulteriori esperimenti.</li>
		<li>Macchia il vetrino con una colorazione commerciale kit (vedere la Tabella materiali), in conformità con le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Montare il vetrino con un mezzo di montaggio adatto e un vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Porre il vetrino al microscopio ottico (600 X) con immersione in olio.</li>
		<li>Contare le celle non squamocellulare almeno 500: neutrofili, eosinofili, macrofagi, linfociti e cellule epiteliali. Nota: Conteggio differenziale delle cellule è di solito eseguita da una sola o due dedicato e addestrato osservatori per limitare le discrepanze del interobserver.</li>
		<li>Registrare i valori assoluti e percentuali di ogni tipo di cellula.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+sputum+cell+counts:+their+usefulness+in+clinical+practice.">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li><li>Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+induced+sputum+to+investigate+airway+inflammation.">The use of induced sputum to investigate airway inflammation.</a> Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).</li><li>Leigh, T. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Evaluation+of+Nasal+and+Bronchial+Cytokines+and+Chemokines+Following+Experimental+Rhinovirus+Infection+in+Allergic+Asthma:+Increased+Interferons+(IFN-&#947;+and+IFN-&#955;)+and+Type+2+Inflammation+(IL-5+and+IL-13).">A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-&#947; and IFN-&#955;) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13).</a> EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).</li><li>Popov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis).">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis).</a> European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).</li><li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days.">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li><li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum.">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li><li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects.">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li><li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum:+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination.">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo di espettorato indotto è uno strumento utile per studiare il vano delle vie respiratorie. Ci sono diverse possibili applicazioni di questa tecnica. In primo luogo, può migliorare la conoscenza circa le cellule immuni e meccanismi implicati in varie malattie respiratorie. Ad esempio, questa tecnica ha permesso l'inchiesta di infiammazione delle vie aeree in larghe coorti di pazienti, ed è stato dimostrato che circa la metà dei pazienti asmatici sono caratterizzata da un anormale delle vie aeree l'infiammazione eosinofila15, 16 , 17, mentre i pazienti BPCO esibiscono solitamente un neutrofilo rialzato espettorato contare18. Questa tecnica ha contribuito anche alla migliore caratterizzazione di infiammazione delle vie aeree nei pazienti con fibrosi polmonare idiopatica e ai mediatori di prove che possono contribuire a questa malattia19. In secondo luogo, la tecnica di espettorato indotto può essere utile per predire la risposta al trattamento. Ad esempio, la presenza di una percentuale anormale degli eosinofilo di espettorato ha dimostrata di essere un indicatore premonitore di corticosteroide reattività11,18. Nell'asma e nella BPCO, sartoria la dose dei corticosteroidi per normalizzare la percentuale degli eosinofilo di espettorato è stato indicato per essere più efficace nel ridurre il numero delle esacerbazioni di regolazione trattamento secondo gli attuali orientamenti clinici11 ,20,21. In terzo luogo, l'analisi dell'espettorato possono aiutare a sviluppare terapie mirate. Ad esempio, la presenza di un numero abnorme di neutrofili di espettorato in COPD e alcuni pazienti asmatici ha portato allo sviluppo di trattamenti antineutrophilic11. In quarto luogo, la tecnica può svolgere un ruolo nella diagnosi. Ad esempio, la presenza di eosinofilia di espettorato è necessaria fare una diagnosi di bronchite eosinofila non-asmatica11.
Oltre ad ottenere un conteggio differenziale delle cellule, la tecnica di induzione dell'espettorato permette anche le prestazioni di molti ulteriori analisi, attraverso lo studio dell'espettorato surnatante o da cellule dell'espettorato. L'analisi di mediatori8,19,22 e la valutazione dell'attività chemiotattica del campione per eosinofili22esempi con espettorato surnatante. Dalle cellule dell'espettorato, RNA possa essere estratti e utilizzato per microRNA o espressione genica analizza19,23 . Le cellule dell'espettorato possono essere analizzate anche da flusso cytometry9,23 che permette, tra gli altri, immunophenotyping e ordinamento celle. Inoltre, le cellule dell'espettorato possono essere colta10, e loro produzione del Mediatore può essere misurato in vitro24. Vale la pena notare che in questo caso, il contenuto di mediatore è diverso da quello che può essere trovato in espettorato surnatante. Infatti, mediatori nel sovranatante dell'espettorato possono essere influenzate dalle secrezioni da cellule residenti delle vie respiratorie e di essudazione del plasma, al contrario l'espettorato cultura cellulare modello24. Infine, immunocitochimica e in situ di ibridazione può essere eseguita anche utilizzando cellule di espettorato7.
La tecnica di espettorato indotto presenta alcune limitazioni. L'induzione deve essere eseguita sotto controllo medico. È anche essenziale per l'operatore dare istruzioni esaurienti ai pazienti. Altre limitazioni includono la cooperazione e la condizione medica dei pazienti, sono necessari sforzi respiratori. Per quanto riguarda la fattibilità di questa tecnica nei bambini, parecchi studi hanno riferito che era successo e sicuro nei bambini di età superiore ai 6 anni25. Dati sui bambini di &#60; 6 anni di età sono carenti25, ma è probabile che l'induzione di espettorato è difficile da eseguire in quei bambini14. La tecnica è attualmente limitata ai servizi e centri specializzati di ricerca perché è tecnicamente impegnativo, che richiede tempo, e richiede personale specializzato1. Un'altra limitazione è che la tecnica di induzione dell'espettorato e di analisi non è sempre successo, significato che un cytospin leggibile non è sempre ottenuto26. Tuttavia, il tasso di successo è di solito circa 80% in diverse coorti di pazienti4,26,27,28,29. Infine, deve usare cautela quando si confrontano diverse coorti di pazienti per quanto riguarda la corrispondenza di età come è stato indicato agli urti l'espettorato delle cellule totali30,31. Allo stesso modo, altri parametri, quali le abitudini di genere e del tabacco devono essere abbinate come essi possono anche interferire con l'espettorato cella conteggio29,32. Quando il paziente di corrispondenza non è possibile, un altro modo per tener conto di età, sesso o stato di fumo è regolare l'analisi statistica per queste caratteristiche.
Rispetto ad altre tecniche che consentono la raccolta di cellule dalle vie aeree, come le biopsie e lavaggi broncoalveolari, il metodo di espettorato indotto ha il vantaggio di essere semplice, ben tollerato, sicuro, riproducibile, economica e non invasiva. Questi vantaggi consentono la tecnica di espettorato indotto da eseguirsi su larga scala e ripetutamente nel corso del tempo e ne fanno un'alternativa di scelta per il campionamento delle vie aeree. Bronchosorption è un'altra tecnica che permette la raccolta di liquido il rivestimento mucoso al fine di valutare delle vie respiratorie mediatori33. Mentre questa tecnica (che richiedono broncoscopia) è più invasiva rispetto espettorato indotto, presenta i vantaggi di evitare qualsiasi contaminazione con la saliva e l'ottenimento di elevate concentrazioni di mediatori rispetto a broncoalveolare lavaggio33.
Fasi critiche hanno bisogno di attenzione nel protocollo. In primo luogo, deve fare attenzione riguardo la concentrazione salina e il tempo di induzione, perché questi due parametri possono influenzare i risultati e pertanto devono essere standardizzati34,35. In secondo luogo, il mucolysis con DTT è un passo importante del trattamento. Rispetto a PBS, DTT è stato indicato per meglio disperdere espettorato celle7, che migliora la qualità di diapositiva di cytopsin ed è essenziale avere una cella riproducibile totali2. Tuttavia, l'agente mucolitico può interferire con la misurazione di componenti biochimici.Chiodare esperimenti quindi deve essere eseguita quando si misura un nuovo composto biochimico36. Infine, un altro passo fondamentale della procedura è la cella contando passo, che deve essere eseguita da un tecnico specializzato per garantire risultati affidabili e interpretabile.
Un metodo alternativo utilizzando spine di espettorato (parti viscida o più dense), anziché l'intero espettorato, è anche descritto in letteratura7. Entrambe le tecniche presentano vantaggi e svantaggi. La tecnica di espettorato intero consente più rapida elaborazione7, ma è spesso contaminata con la saliva, che diluisce il campione e può ridurre la qualità di cytospins2,7. Con la tecnica di selezione di spina, la contaminazione di saliva è ridotto, il che significa che i campioni siano spesso di qualità migliore per il dosaggio dei mediatori di fase fluida e cytospin diapositive7. Il trattamento è tuttavia più lungamente7 e spine selezionate potrebbero non essere rappresentativi della totalità del campione37. Vale anche la pena notare che non tutti i campioni contengono spine, che possono essere limitante. Entrambi i metodi sono validati e riproducibile, e attualmente non esiste alcuna prova che i conteggi differenziali delle cellule ottenuti da entrambi i metodi sono diversi14,38.
In futuro, l'espettorato indotto potrebbe essere utilizzato come strumento clinico per fornire biomarcatori per l'indagine, la diagnosi e la gestione di tutti i tipi di malattie respiratorie infiammatorie.

Parecchi metodi sono usati per studiare l'infiammazione delle vie aeree: diretta misure (come le biopsie bronchiali o lavaggi broncoalveolari) e metodi indiretti (come valutazione di sintomo, campione del polmone e analisi funzione analisi del sangue)1. Le tecniche dirette hanno il vantaggio di valutare in modo affidabile l'infiammazione delle vie aeree, ma sono invasiva e non è fattibile su grande scala a causa di disagio per il paziente e il rischio sostenuto1. Per quanto riguarda i metodi indiretti, scarsamente correlati con la valutazione diretta di infiammazione delle vie aeree1.
Raccolta dell'espettorato è un altro modo per campionare cellule dalle vie aeree e permette la valutazione diretta dell'infiammazione delle vie aeree. Tuttavia, produzione di espettorato spontaneamente può condurre ai campioni di qualità scadente e non è possibile per tutti i pazienti2. Questo problema è stato superato utilizzando soluzione salina ipertonica nebulizzata con ultrasuoni per indurre la produzione di espettorato2. Questo metodo è stato inizialmente utilizzato in pazienti infettati con il virus di immunodeficenza umana (HIV) per la diagnosi di polmonite di carinii di pneumocystis 3 ed è stato adattato per soggetti sani e gli asmatici nel 19924. Espettorato indotto è fattibile in pazienti più gravi anche utilizzando soluzione salina isotonica5. Anche se generalmente ben tollerato, l'inalazione di soluzione salina può causare broncospasmo in pazienti con hyperresponsive airways5. Pertanto, si consiglia di somministrare un breve durata d'azione beta agonista prima la procedura1. Inoltre, precedentemente abbiamo indicato che aggiungendo salbutamol per la soluzione salina nel nebulizzatore a ultrasuoni diminuito ulteriormente questo rischio6. I vantaggi di espettorato è che è non-invasivo2 e sicuro quando appropriate precauzioni5.
Per il trattamento dei campioni di espettorato, due metodi sono attualmente utilizzati nella letteratura: la tecnica tutta dell'espettorato e la spina selezione7. Nel nostro laboratorio, viene eseguita la tecnica tutta espettorato. L'obiettivo primario del trattamento dell'espettorato è quello di ottenere un conteggio differenziale delle cellule per studiare il tipo di infiammazione presente nel lume delle vie aeree. Tuttavia, molte altre analisi sono anche possibili ulteriori analisi di processi infiammatori e meccanismi immunitari, sia studiando mediatori nel sovranatante dell'espettorato8 o eseguendo la ricerca dettagliata sulle cellule dell'espettorato (per esempio. , flusso cytometry9, cell culture10, genomica10, proteomica10, immunocitochimica7, in situ Ibridazione7, ecc.)
La tecnica di induzione dell'espettorato e di analisi è attualmente limitata per ricercare servizi e centri specializzati nella pratica clinica, perché è tecnicamente impegnativo, richiede tempo e richiede personale specializzato1. Infiammazione delle vie aeree può essere studiata con questo metodo per varie malattie respiratorie come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la tosse cronica o fibrosi polmonare idiopatica11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1223">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Spirometer - Spirobank</td>
			<td style="width:265px;">MIR France</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol MDI - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0135-913</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Nebulizer UltraNeb</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>UltraNeb U3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Devilbiss UltraNeb Disposable Cups &#38; Lids</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td>100HD-647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers</td>
			<td style="width:265px;">DeVilbiss Healthcare USA</td>
			<td style="width:140px;">1001005879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">One-way Valves</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Aerosol T-connector&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Hudson RCI USA</td>
			<td style="width:140px;">41077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Ventilation circuit monobranch corrugated</td>
			<td style="width:265px;">Int&#39;Air Medical France</td>
			<td style="width:140px;">TA30A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl 5 %&#160;</td>
			<td style="width:265px;">/</td>
			<td style="width:140px;">/</td>
			<td style="width:305px;">Produced by our hospital pharmacy</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Mini-Plasco NaCl 0.9%</td>
			<td style="width:265px;">B.Braun Medical&#160; Diegem Belgium</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin</td>
			<td>GLAXOSMITHKLINE</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 0094-987</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent</td>
			<td style="width:265px;">Boehringer Ingelheim Germany</td>
			<td style="width:140px;">CNK: 1543-305</td>
			<td>See drug available in the country</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Belgium</td>
			<td style="width:140px;">BE17512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Sputolysin reagent</td>
			<td style="width:265px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:140px;">56000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Trypan blue 0.4% solution 100 mL</td>
			<td style="width:265px;">LONZA Bio Whittaker Belgium</td>
			<td style="width:140px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer - Thoma chamber</td>
			<td style="width:265px;">Labor Optik Lancing UK</td>
			<td style="width:140px;">1500000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hemacolor Stainig set</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">1116610001</td>
			<td style="width:305px;">Alternative product&#160; : Diff Quik Staining Set 
			&#160;Medion Diagnostic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium - Entellan</td>
			<td style="width:265px;">Merck Belgium</td>
			<td style="width:140px;">107960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:513px;">Statspin Cytofuge 12&#160;</td>
			<td style="width:265px;">Beckman Coulter Belgium</td>
			<td>X00-003066-001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for sputum induction and laboratory processing

La tecnica di induzione dell'espettorato e la lavorazione è un metodo riconosciuto non invasivo che permette la raccolta e l'analisi delle cellule dalle vie aeree, che è interessante in varie malattie respiratorie come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), tosse cronica, o la fibrosi polmonare idiopatica. Questa tecnica è ben tollerato, sicuro e non invasivo, ma è attualmente limitata a servizi di ricerca e centri specializzati nella pratica clinica, perché è tecnicamente impegnativo, richiede tempo e richiede personale specializzato. Il tasso di successo di espettorato e analisi è circa l'80%.
Qui, descriviamo il trattamento di induzione e laboratorio dei campioni di espettorato. Espettorato è indotta da inalazione di soluzione salina ipertonica o isotonica con salbutamolo. Per la lavorazione, usiamo la tecnica tutta espettorato. Ditiotreitolo (DTT) viene utilizzato per consentire mucolysis di campioni dell'espettorato. L'obiettivo primario del trattamento dell'espettorato è quello di ottenere un conteggio differenziale delle cellule per studiare i tipi di cellule presenti nel lume delle vie aeree. Ulteriori analisi possono essere eseguite anche su espettorato surnatante e cellule dell'espettorato, che possono consentire ulteriori indagine dei processi infiammatori e meccanismi immuni. Gli esempi includono studiando mediatori nel sovranatante dell'espettorato e l'esecuzione di un ampio spettro di analisi sulle cellule dell'espettorato come citometria a flusso, genomica e proteomica.
Infine, vengono presentati risultati rappresentativi dell'analisi dell'espettorato in controlli sani, asmatici e pazienti con BPCO.

Emocitometro Una tipica immagine è illustrata nella Figura 1 che viene visualizzato con il microscopio usando l'emocitometro. Cellule squamose sono facilmente identificabili, come sono molto più grandi rispetto alle cellule non squamocellulare. Queste cellule squamose sono cellule epiteliali proveniente dalla bocca. Entrambi i tipi di cellule sono macchiati di tripan blu quando è morto. Deve usare cautela per evitare il conteggio di lieviti, batteri e rottami.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
Figura 1 : Foto di emocitometro risultati (A) una vita non-squamous delle cellule, (B) una cellula morta non squamocellulare e (C) un squamous delle cellule. Barra della scala = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Cytospin diapositiva: la figura 2 Mostra un'immagine rappresentativa di una diapositiva di cytospin ottenuta dopo l'elaborazione dell'espettorato. I tipi differenti delle cellule (neutrofili, eosinofili, macrofagi, linfociti e cellule epiteliali) possono essere differenziati per mezzo di loro morfologia e la colorazione. In alcuni casi, la contaminazione da cellule squamose può essere importante e, se la percentuale delle cellule squamous è supera all'80%, il campione viene considerato infruttuoso (Figura 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
Figura 2 : Foto di diapositiva Cytospin risultati (A) un neutrofilo, (B) un macrofago, (C) un eosinofilo, (D), un linfocita e (E), una cellula epiteliale. Barra della scala = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
Figura 3 : Esempio di una diapositiva di cytospin di scarsa qualità con &#62; 80% delle cellule squamous. Barra della scala = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tasso di successo Nel nostro reparto, il tasso di successo della procedura (che combina una riuscita induzione e un cytospin leggibile), basato su un campione di 1.129 pazienti (soggetti sani, gli asmatici o pazienti con BPCO), è dell'82% (924/1.129). In una sotto-analisi secondo il tipo di pazienti, il tasso di successo è 75% (57/76) in soggetti sani, 82% (827/1.004) in asmatici e 82% (40/49) nei pazienti con BPCO.
Risultati in soggetti sani In un'analisi retrospettiva di una serie di 289 soggetti sani dal nostro reparto, la mediana (range interquartile) peso dell'espettorato era 3,72 g (range interquartile di 2,46 g - 5,54 g) e la mediana totale non-squamous delle cellule totali/g di espettorato era 0,59 x 106 ( intervallo interquartile di 0,37 x 106 - 1.29 x 106).
In tali soggetti sani, la proporzione di cellule squamose è bassa al 19% (10% - 34%) e la redditività è alta al 66% (54-78%). Per quanto riguarda la percentuale dei tipi differenti delle cellule, i risultati sono riassunti nella Figura 4A. Possiamo osservare che la percentuale dei macrofagi (49% [31-68%]) è superiore alla percentuale dei neutrofili (34% [14% - 60%]), mentre le percentuali di linfociti (2% [1-3%]), eosinofili (0% [0-0%]) e cellule epiteliali (4% [2-11%]) sono basse. Questi risultati sono simili quando i dati sono espressi in valori assoluti (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
Figura 4 : Risultati rappresentativi del conteggio differenziale delle cellule osservata in soggetti sani espressi come percentuali (A) o (B) valori assoluti. Risultati sono mostrati come mediana (range interquartile). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
È anche importante considerare l'età dei pazienti. Infatti, una forte correlazione è tra età del paziente e la percentuale di neutrofili presente nei campioni di espettorato (Figura 5). Allo stesso modo, quando classificare i pazienti secondo classi di età di 10 anni (Figura 6), abbiamo osservato un significativo aumento della percentuale dei neutrofili con l'aumento dell'età. Pertanto, questa variabile deve essere considerata quando si confrontano i risultati da diverse coorti e prestare attenzione in corrispondenza dei soggetti.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
Figura 5: Correlazione tra età ed espettorato percentuale del neutrofilo. La correlazione è stata calcolata con il test di Spearman. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
Figura 6: Evoluzione della percentuale dei neutrofili in base alla categoria di età. Il p-valore di ANOVA era &#60; 0,0001 per il confronto delle percentuali del neutrofilo tra classi di età. I confronti multipli sono stati realizzati con test comparazioni multiple di Dunn. I p-valori sono rappresentati come segue: * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0.01, e * * * p &#60; 0.001. Risultati sono mostrati come mediana (range interquartile). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Risultati nei pazienti affetti da malattie respiratorie La tecnica dell'espettorato indotto è comunemente utilizzata per valutare il profilo di cellule infiammatorie nei pazienti asmatici.Questa tecnica può essere applicata anche ai pazienti affetti da BPCO, un'altra malattia infiammatoria delle vie respiratorie. Quando si confrontano soggetti sani, gli asmatici e pazienti con BPCO (3 gruppi essere abbinati per età, sesso e abitudini del tabacco), abbiamo osservato che il profilo di cellula infiammatoria è molto diverso tra queste coorti (Figura 7). Infatti, i pazienti asmatici sono caratterizzati solitamente da eosinofili espettorato sollevata, mentre la proporzione dei neutrofili di espettorato è solitamente più elevata nei pazienti con BPCO rispetto ai controlli sani, che è collegata alla gravità della malattia.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
Figura 7 : Profilo di cellula infiammatoria dell'espettorato di soggetti sani (n = 45), pazienti asmatici (n = 108) e pazienti con BPCO (n = 54). I tre gruppi sono stati abbinati per età, sesso e abitudini del tabacco. I p-valori di ANOVA erano &#60; 0.05, &#60; 0,0001, e &#60; 0,0001 per il confronto di neutrofili, eosinofili e macrofagi tra gruppi, rispettivamente. I confronti multipli sono stati realizzati con test comparazioni multiple di Dunn. I p-valori sono rappresentati come segue: * p &#60; 0.05 e * * * p &#60; 0.001. Risultati sono mostrati come mediana (range interquartile). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Metodologia per l'induzione dell'espettorato e laboratorio di lavorazione

Qui descriviamo la tecnica di induzione dell'espettorato. Questo protocollo spiega anche l'espettorato di elaborazione per eseguire un conteggio differenziale delle cellule e per raccogliere il surnatante di espettorato e cellule per ulteriori analisi.

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

27.3K Views.  University of Liege. Qui descriviamo la tecnica di induzione dell'espettorato. Questo protocollo spiega anche l'espettorato di elaborazione per eseguire un conteggio differenziale delle cellule e per raccogliere il surnatante di espettorato e cellule per ulteriori analisi.

Video: Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Esecuzione ed elaborazione di FNA anteriore Fat Pad per Amiloide

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

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Medicina

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Come misurare Folding corticale dalle immagini MR: uno step-by-step tutorial per calcolare indice locale Gyrification

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy and/or cytotoxic chemotherapy. To induce bladder cancer, C57BL/6 mice (MUC1.Tg and wild type) were treated orally with the carcinogen N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (OH-BBN) at 3.0 mg/day, 5 days/week for 12 weeks. To assess the effects of OH-BBN on serum cytokine profile during tumor development, whole blood was collected via submandibular bleeds prior to treatment and every four weeks. In addition, a MUC1-targeted peptide vaccine and placebo were administered to groups of mice weekly for eight weeks. Multiplex fluorometric microbead immunoanalyses of serum cytokines during tumor development and following vaccination were performed. At termination, interferon gamma (IFN-&#947;)/interleukin-4 (IL-4) ELISpot analysis for MUC1 specific T-cell immune response and histopathological evaluations of tumor type and grade were performed. The results showed that: (1) the incidence of bladder cancer in both MUC1.Tg and wild type mice was 67%; (2) transitional cell carcinomas (TCC) developed at a 2:1 ratio compared to squamous cell carcinomas (SCC); (3) inflammatory cytokines increased with time during tumor development; and (4) administration of the peptide vaccine induces a Th1-polarized serum cytokine profile and a MUC1 specific T-cell response. All tumors in MUC1.Tg mice were positive for MUC1 expression, and half of all tumors in MUC1.Tg and wild type mice were invasive. In conclusion, using a team approach through the coordination of the efforts of pharmacologists, immunologists, pathologists and molecular biologists, we have developed an immune intact transgenic mouse model of bladder cancer that expresses hMUC1.

An N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder cancer model was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic mice for the purpose of testing MUC1-directed immunotherapy. After administering a MUC1-targeted peptide vaccine, a cytotoxic T lymphocyte response to MUC1 was confirmed by measuring serum cytokine levels and T-cell specific activity.

Induzione di Invasive Transitional cellulare Bladder Carcinoma in immunitario intatto umani MUC1 topi transgenici: un modello di sviluppo Immunoterapia

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the human respiratory tract. NA is a non-invasive technique which absorbs fluid from the inferior turbinate, and causes minimal discomfort. NA has yielded reproducible results with the ability to frequently repeat sampling of the upper airway. 
By comparison, alternative methods of sampling the respiratory mucosa, such as nasopharyngeal aspiration (NPA) and conventional swabbing, are more invasive and may result in greater data variability. Other methods have limitations, for instance, biopsies and bronchial procedures are invasive, sputum contains many dead and dying cells and requires liquefaction, exhaled breath condensate (EBC) contains water and saliva, and lavage samples are dilute and variable.
BA can be performed through the working channel of a bronchoscope in clinic. Sampling is well tolerated and can be conducted at multiple sites in the airway. BA results in MLF samples being less dilute than bronchoalveolar lavage (BAL) samples.
This article demonstrates the techniques of NA and BA, as well as the laboratory processing of the resulting samples, which can be tailored to the desired downstream biomarker being measured. These absorption techniques are useful alternatives to the conventional sampling techniques used in clinical respiratory research.

This manuscript describes the use of nasal and bronchial absorption techniques, specifically using synthetic absorptive matrices (SAM) to sample the mucosal lining fluid (MLF) of the upper and lower airway. These methods provide better standardization and tolerability than existing respiratory sampling techniques.

Assorbimento di liquidi nasali e bronchiali: precisione campionamento della Mucosa respiratoria umana e laboratorio di lavorazione dei campioni

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Strategie di campionamento e trattamento dei campioni di tessuto Biobank Porcine modelli biomedicale

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...