著者らは、多剤耐性病原体の治療に対するシステム生物学的アプローチである助成金1 U01 AI124316-01の資金提供のために、R. QuinnとNIH / NIAIDに資金を提供してVertex PharmaceuticalsとCystic Fibrosis Research Innovation Awardを承認したいと考えています。また、UCSDの機械工学シニアデザインコースの機械宇宙工学科にもこの作業のエンジニアリング面での協力を促していただき、感謝します。

1.人工褥瘡のためのストックの準備<ol><li> 5％ムチン溶液を作成する。脱水豚の胃ムチン1.0gを20mLの脱イオン水に加えます。得られた溶液をオートクレーブする。 注：ムチン滅菌は、その固有の構造を破壊します。ムチンをその乾燥形態で滅菌するための他の方法には、UV滅菌および照射が含まれる。しかし、これらの方法は、WinCFシステムでは広く使用されていません。 </li><li> 50mLの脱イオン水に2.2gのKClを添加し、溶解させる。 5.0gのNaClを50mLの脱イオン水に加え、溶解させる。これら2つのソリューションをオートクレーブします。 </li><li> 100mgのサケ精子DNAを10mLの滅菌脱イオン水に加える。この溶液を水浴中で約85℃に数時間加熱して溶解させる。 </li><li> 5.0mgの滅菌脱イオン水に5.0mgのフェリチンを添加する。 </li></ol> 2.人工痰の調製<ol><li>結合する以下の成分：ムチン原液16mL、KCl原液2.0mL、NaCl原液2.0mL、卵黄エマルジョン200mL、DNA原液5.6mL、フェリチン原液120μL、必須液5.78mLアミノ酸溶液5.78mL、非必須アミノ酸溶液5.78mL、および滅菌水2.44mLを入れた。 <ol><li>少量の沈降物が現れる場合は、静かに振り混ぜる。 </li><li>培地5.0mLを8つの滅菌15mL遠心分離管にピペットで入れる。 注：各チューブの化学的条件は、必要に応じて操作できます。例えば、異なるpHレベルでの微生物の挙動を比較する目的で、緩衝溶液およびpH指示薬を各チューブに添加することができる。これのデモンストレーションは、代表的な結果セクションに示されており、8つの異なるpHレベル、すなわち5.0から8.5までが0.5pH増分で示されている。 </li></ol></li><li>培地の化学的条件がうまく操作されたら、後で使用するために凍結する。メディアは今後も安定している-20℃で数ヶ月間禅してください。解凍時に渦。 </li></ol>キャピラリーチューブの制御運転の準備<ol><li>滅菌された生物学的状況では、それぞれ250μLの培地を含む8つの滅菌マイクロ遠心チューブを充填します。 </li><li>さらに8個の滅菌15 mL遠心チューブを取得します。各チューブは、ステップ3.1で述べたマイクロ遠心チューブに対応しています。 <ol><li> 70％エタノール溶液でペーパータオルを滅菌し、乾燥させる。乾燥したら、タオルをそれぞれ約4平方インチの断片に裂き、15 mLの遠心管の底にそれぞれの断片をつぶします。チューブを追加する場合は、必要に応じてペーパータオルをスプレーして乾燥させてください。 </li><li>それぞれの遠心分離チューブの底に1つの紙塊を置き、湿った環境を作り出すために、約1.0mLの滅菌水で各紙塊をわずかに湿らせます。 </li></ol></li><li>ステップ3.1で調製したすべてのマイクロ遠心チューブ用の3本のガラス毛細管と1本のキャピラリーチューブパテシールnt。 </li><li>各マイクロ遠心チューブについて、3本のキャピラリーチューブに、チューブの上部近くの青いマーカーから約5mmの培地を満たしてください。 <ol><li>チューブの一端をマイクロ遠心チューブに入れ、水平方向に傾けて毛管作用で培地をチューブに導きます（ 図1参照）。 </li><li>手袋をした指を静かにチューブの開いた端に置いて充填を止め、チューブのもう一方の端をシーラントブロックに押し下げて密封します。 </li></ol></li><li></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> 図1：pH勾配の例、人工痰のある充填キャピラリーチューブ媒体は、管の一端を液体に挿入し、毛管作用を促進するために傾斜させることによって加えられる。この例における媒体の着色は、悪臭を助けるために加えられたpHインジケータによるものであるインキュベーション後の酸性度の変化を測定する。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="5"><li> 3本のキャピラリーチューブの各セットを、完全に滅菌水で湿らせたペーパータオルで満たした15mLの遠心チューブに入れ、パテ側を密閉します。チューブとラベルにキャップをします。これらの3本の毛細管は、各制御条件の複製のためのものである。 </li><li>すべての15 mL遠心チューブに指定の毛細管を満たしたら、チューブを保持ラックに置きます。チューブを水平にインキュベートするようにラックを置きます（気泡を捕まえるため）（ 図2参照）。 37℃で48時間遠心チューブ（湿った紙塊を含む）の内側に毛細管をインキュベートする。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> 図2：pH勾配の例、インキュベーションに適した毛管。 3本のキャピラリーチューブが満たされ、密封されたら、それらを、湿ったペーパータオルを底にした遠心チューブに入れる。このチューブをキャップし、ラックに入れる。インキュベーションが完了するとガスの生成が観察されるように、ここに示すように、インキュベーション中にラックを横向きにしなければなりません。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> インキュベーション後の対照毛管の画像化<ol><li>インキュベータから遠心チューブのラックを取り出し、チューブを水平に保ちます。キャピラリーチューブを遠心チューブから注意深くスライドさせ、各セットを他のセットとは別にしておきます。 </li><li>キャピラリーチューブをライトボックスの上に並べ、チューブの内容物が見えるように並べます明るく照らされた。異なる化学条件を分けるために3本のチューブごとにギャップを空けてください。 </li><li>チューブの位置を合わせ、ライトボックスをオンにして、真上から写真を撮ります。 （ 図3参照） </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> 図3：pH勾配の例、対照実験、プレインキュベーション、喀痰添加なし。毛細管に添加した後の人工喀痰培地。pHは左から右へ増加する。培地に添加された指示薬の組み合わせにより、より酸性の管がより黄色に見える一方、酸性の管はより紫色になる。管は水平に配置され、上から撮影された下から照明される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li>の処分生物学的有害廃棄物中の制御物質。 </li></ol> 5. WinCFキャピラリーチューブに痰のサンプルを接種する<ol><li>滅菌された生物学的状況では、それぞれ225μLの培地を含む8つの滅菌マイクロ遠心チューブを充填する。 </li><li> 3mLシリンジ（針なしのプラスチックシリンジ）を用いて喀痰を繰り返し抜き出して排出することにより、痰サンプルをホモジナイズする。喀痰が滑らかな一貫性を有するまで、これを行う。 </li><li>ステップ5.1で調製した各マイクロ遠心チューブ（ASM培地で1/10希釈）にホモジナイズした痰25μLを加えます。次に、チューブを30秒間ボルテックスして十分に混合します。 </li><li>手順3.2〜3.5と同じ手順に従って、キャピラリーチューブに培地を加えます。 </li></ol>インキュベーション後のサンプル毛細管の画像化<ol><li> 48時間のインキュベーション時間の後、ステップ4.1〜4.3と同じ手順に従って毛細管を取り除き、イメージングする。 </li><li>チューブに気泡が存在する場合は、必ず明確に撮影した写真は、チューブ内の気泡とメディア間の描写を示しています。バイオフィルムが存在する場合、写真ははっきりと同様にその存在を描くことができることを確認します。 </li></ol>ダウンストリームアプリケーションのためのメディアの7.取り外し<ol><li>下流分析を容易にするために、画像形成後毛細管からメディアを削除します。潜在的なアプリケーションは、培養およびDNA / RNA配列決定およびメタボロームプロファイリングが含まれます。 注意：病原体で満たされたガラス毛細管を有意バイオハザードは、このように、これらのステップは、特定の機器に非常に慎重に行う必要がありますされています。毛細管が壊れた場合は、適切なバイオハザード鋭利物容器に廃棄してください。 </li><li>メディアを削除するには25ゲージ、長さ0.5インチの平滑末端針を使用してください。シールを破るために、チューブの栓を最後に平滑末端の針を挿入します。 </li><li>開封後は、逆さまに毛細管をオンにし、メディアが上部から出て滴ります。私メディアF、容易に垂れない200μlの先端とピペットを使用して、キャピラリーチューブの端部に挿入されたときピペットプランジャーを押し下げることにより、チューブからメディアを追い出します。適切な容器（1.5mLの遠心分離管）に排出され、チューブ媒体を集めます。 注：トランスクリプトームまたは他のRNA分析のために、メディアがRNA安定化バッファに直接排出することができます。 </li></ol> 8. WinCF FLUDシステム注：WinCF流体読み込みユーティリティデバイス（FLUD）システムWinCFシステムのスループットを最適化するように設計された相補的なデバイスの任意スイートです。 WinCF FLUDシステムは、主に3Dプリント可能な材料で構成されています。 3D印刷された製造業は、研究者だけでなく、最小限の製造要件のための最小限のダウンタイムを確保するために、材料の迅速かつ容易に交換することができます。デザイン、STLファイル、3D印刷指示とWinCF FLUDマニュアルは、オンラインsupplemeでご利用いただけますNT。 <ol><li> 毛細管のロード用のメディアの準備 <ol><li>滅菌バイオフードでは、各メディアの900μLで8つの滅菌2mLの微小遠心管を埋めます。 </li><li> 3 mLシリンジ（針なしのプラスチックシリンジ）で繰り返し痰を吸引及び吐出することにより任意の喀痰サンプルを均質化します。痰がスムーズに一貫性のあるまでこれを行います。 </li><li>ステップ8.1.1で調製した各マイクロ遠心チューブ（培地中で1/10に希釈）に均質化痰の100μLを加えます。次いで、十分に混合するために30秒間チューブをボルテックス。 </li><li>チューブが垂直になるように配向回転子管ホルダーに充填し、オープンマイクロ遠心管をスロット。 </li></ol></li><li> 毛細管の配置 <ol><li>ステップ8.1で、すべてのマイクロチューブのための3つの毛細管を取得します。 </li><li>ゴムクレードルにスロット3本のチューブそれらは装置の他端にマイクロ遠心チューブと整列するようになっています。チューブのマーキングされた端がマイクロ遠心チューブから離れていることを確認します。クレードルの底にある3つの穴を、クレードルスタンドの3つのスタッドの上に正しく取り付けます。 </li><li>配置されたキャピラリーチューブを装置のガイドチャネルに載せた状態で、シフトを防ぐためにゴムタンプを中央部にしっかりと固定します。 （ 図4参照） </li></ol></li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> 図4：ゴムタブで固定されたキャピラリチューブが完全に装填されたFLUDシステム <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="3"><li> キャピラリーチューブへの媒体のローディング <ol><li>キャピラリーチューブがある装置の端を慎重に片手で掴んでください他方の手で微量遠心管が装填されている回転ラックを保持する。 </li><li>微量遠心チューブを微妙に回転させて、微量遠心チューブがほぼ水平になるようにし、ラックをゆっくりと毛管に向かって押し込みます。 （ 図5参照） </li><li>キャピラリーチューブの端が微量遠心管内の培地と接触すると、毛管作用がすぐに毛管を充填し始めるようにしてください。塗りつぶし率と塗りつぶしレベルを調整するには、装置全体を静かに回転させます。これを行う際に、微量遠心チューブからメディアをこぼさないように注意してください。 （ 図6参照） </li><li>毛細管が所望のレベルに満たされたら、装置の表面を表面に置き、慎重かつ迅速に微量遠心分離管のラックを毛細管の端部から引き離して充填を止める。マイクロ遠心チューブは、今度は垂直位置まで戻って閉じられ、閉じられることができる。 </li><li>封止剤ブロックを各3組のセットに押し、毛細管の突出した端部をシールし、すべてのセットが封止されるまで一度に1セットずつシールする。汚染のリスクを減らすために、シーラントブロックの別の部分を3重にセットします（ 図7参照）。 </li></ol></li></ol><img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> 図5：水平方向に配置された中程度のチューブを備えたFLUDシステム。キャピラリーチューブとの接触が可能です。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> 図6：毛管作用による媒体を伴う毛細管チューブを有するFLUDシステム。 </strong&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> 図7：シーラントブロックを使用して、一度に3つずつ3つずつ設定されたFLUDシステムの充填されたキャピラリーチューブのシールこのシーラントブロックは、シーリング中に隣接する3つのセットとの接触を防ぐために切断された縁に沿ってプラスチックを有していた。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li> インキュベーション <ol><li>チューブの中央部分のゴムタンプを取り外し、ゴム製の受け台を持ち上げて本体装置から外します。これですべてのキャピラリーチューブを取ります。ここで、クレードルとチューブをイメージングラックに固定します。このrackがにチューブを設定するには、3つのクレードルに収まるスタブだけでなく、小さなガイドチャネルを持っています。 </li><li>透明なプラスチックのインキュベーションボックスに全体としてイメージングラックを設定します。滅菌水に滅菌ペーパータオルの少量を浸し、インキュベーションの間、湿度を提供するために、箱の2つの短辺に沿っ置きます。 （ 図8を参照）。 </li><li>水平管を保つことを確認して、37℃のインキュベーター内に完全と設定ボックスを閉じます。 48時間インキュベートします。 </li></ol></li></ol><img alt="図8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> 図8：ラバークレードルに毛細管は、湿度を提供するために、湿った紙タオルと並んでクリアインキュベーション箱に入れてきたイメージングラックにFLUDシステムから転送します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">目の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>図です。 <ol start="5"><li> イメージングおよび抽出 <ol><li>インキュベーションボックスからチューブを保持する撮像ラックを取り外し、下から照明ライトボックス上に設定します。撮像ラックに既にチューブと、三重セットが適切に間隔を置いて配置され、直ちに画像の準備。 </li><li>全てのライトボックスからのビューとライトの分野で表示されているように、チューブ上にカメラの焦点を合わせるチューブ色素における色の十分なコントラストおよび視覚化を提供します。真上からの写真。 </li><li>管の内容物を抽出するために、一度に三連のゴムクレードル一組から毛細管を取り除きます。優しくクレードルのアップとアウトチューブを持ち上げたり、それらを引き出します。 </li><li>三連の各セットに対して、7.3〜ステップ7.1に詳述抽出手順に従います。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Winogradsky-based+culture+system+shows+an+association+between+microbial+fermentation+and+cystic+fibrosis+exacerbation.">A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation.</a> ISME J . 9, 1024-1038 (2015).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis.">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li><li>Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+of+the+cystic+fibrosis+lung.">Microbial ecology of the cystic fibrosis lung.</a> Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).</li><li>Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+lung+microbiome:+Opportunities+to+reconsider+management+of+airway+infection.">Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection.</a> Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).</li><li>Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+human+airway+microbial+ecology+reveals+a+pervasive+signature+for+cystic+fibrosis.">Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).</li><li>Willner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+microbial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung.</a> ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).</li><li>Delhaes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+microbiota+in+cystic+fibrosis:+a+complex+fungal+and+bacterial+community--implications+for+therapeutic+management.">The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management.</a> PloS one. 7 (4), e36313 (2012).</li><li>Rogers, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D.+Bacterial+diversity+in+cases+of+lung+infection+in+cystic+fibrosis+patients:+16S+ribosomal+DNA+(rDNA)+length+heterogeneity+PCR+and+16S+rDNA+terminal+restriction+fragment+length+polymorphism+profiling.">D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling.</a> J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).</li><li>Stenbit, A. E., Flume, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+exacerbations+in+cystic+fibrosis.">Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).</li><li>Twomey, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+metabolite+profiling+reveal+specific+alterations+in+bacterial+community+structure+and+environment+in+the+cystic+fibrosis+airway+during+exacerbation.">Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation.</a> PloS one. 8 (12), e82432 (2013).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cystic+fibrosis+airway+microbiota+at+pulmonary+exacerbation.">Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation.</a> Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).</li><li>Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+Cystic+Fibrosis+Sputum+Can+Be+Chemically+Dynamic,+Anoxic,+and+Extremely+Reduced+Due+to+Hydrogen+Sulfide+Formation.">Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation.</a> mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).</li><li>Sriramulu, D. D., L&#252;nsdorf, H., Lam, J. S., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolony+formation:+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung.">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).</li><li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogeochemical+forces+shape+the+composition+and+physiology+of+polymicrobial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung.</a> mBio. 5 (2), (2014).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

CFと肺の微生物学的メイクは、生物の多種多様なが含まれていますが、肺内の条件は、可能性の高い微生物の種類が生き残ると、13〜15を繁栄できるかに大きな影響を与えています。具体的なメカニズムは、それを通して、これらの条件が変化し、それが肺microbiomeに持って正確な効果は現時点では、一般的に不明です。この実験的な方法では、我々...

本稿に記載された方法は、WinCFシステム1と呼ばれています。 WinCFの全体的な目標は、粘液で満たされた肺の細気管支の環境をシミュレートできる実験装置を提供することです。これは、嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息などを含む粘液過剰分泌の表現型を有する肺疾患の微生物病原体を研究するための扱いやすいシステムを可能にします。手順は、肺の分泌物が最終的に粘液2と細気管支および他の小さな通路を埋め、クリアする太くて硬くなることが原因の変異によって特徴付けられるCFの研究、のために特別に設計されました。吸入空気は、もはや多くの肺胞に到達しても細菌のコロニー3、4の生息地を提供することができるので、肺の中のこのような閉塞は、ガス交換を阻害しません。での微生物の増殖を防止することができません過剰な肺粘液は最終的に気道の複雑な慢性感染症の発症につながる。これらのコミュニティには、ウイルス、菌類、 緑膿菌などの細菌など、さまざまな生物が含まれています。すべて相互に相互作用しています（5,6,7,8）。 CF肺ミクロバイオームの活性は、肺悪化と呼ばれる症状の激しさに関与していると考えられている1,9,10,11。 WinCFはこれらの悪化のまわりの微生物のコミュニティ行動の研究を可能にし、現在肺微生物生態学を研究するための基礎実験システムとして機能するように拡張されている。伝統的に、悪化は、肺から採取した試料の直接分析によって研究されてきた。多くの交絡因子が微生物bの直接分析を行いますWinCFシステムでは、これらの因子の多くが除去され、肺マイクロビームの挙動がより直接的に研究され、粘液詰め気管支叢における細菌活性のより精密な分析が可能になる。 WinCFシステムは、肺環境を効果的に模倣する方法で細菌を増殖および分析する方法を提供する。肺細菌を増殖させる従来の方法は、しばしば伝統的な寒天プレート上でサンプルを培養することを必要とした。これらの方法は、試料を大気中の酸素に開放したままにし、粘液12,13 で閉塞した肺細気管支に見られる低酸素状態およびしばしば無酸素状態を考慮に入れない。好気性条件下で寒天培地で培養することは、CF肺の環境と似たものではなく、治療しようとしている病原体の行動に関する臨床医や研究者を誤解させる可能性があります。さらに、寒天プレート上の細菌に利用可能な栄養素人工痰媒体（ASM）を利用してWinCFで説明されている実際の喀痰で利用可能なものとは異なる。 Sriramulu らの シュードモナス培養によって示されるように図14に示すように 、ASMは、痰の微生物に利用可能な資源を模倣し、痰の物理的な一貫性を再現する特定の成分セットを含む。罹患した肺は特定のマイクロビームを有するので、このような微生物の研究は、理想的には肺の特定の状態においても行われるべきである。 WinCFシステムは、実際の肺気管支内で起こるような微生物の変化を観察するための実験条件の迅速な分析と簡単な操作を可能にする。この技術は、痰、唾液、他の体の分泌物および純粋なまたは混合された細菌培養物を含む、無数の関連するサンプルタイプの接種を可能にする。実験装置の性質は、微生物学的なコミュニティの振舞いであり、多数の微生物学的およびオミックス手順の下流での容易な適用を可能にするように設計されている。そのような研究は、細菌のコミュニティ構成が環境の物理化学的条件に基づいて変化するため重要である。 WinCFを用いて、培地の化学的条件を操作して、細菌活性への影響を分析することができる。例えば、培地を接種する前に培地の酸性度を変更することができる。インキュベーション後、これらの各条件における細菌活性を直接比較することができ、これらの痰試料中の細菌が様々なpHに応答してどのように挙動するかについての結論を導くことができる。ここでは、WinCFシステムを適用する手順と、肺微生物に対する影響を研究するために培地化学を操作する方法の例を概説します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Color-Coded Capillary Tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-260943</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cha-seal Tube Sealing Compound</td>
			<td style="width:93px;">Kimble-Chase</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mucin from porcine stomach</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferritin, cationized from horse spleen</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)</td>
			<td style="width:93px;">AppliChem Panreac</td>
			<td>A2159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Egg Yolk Emulsion, 50%</td>
			<td style="width:93px;">Dalynn Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">VE30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P2157500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.0mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the wincf model - an inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections

多くの慢性気道疾患は、気道の粘液詰まりをもたらす。嚢胞性線維症を有する個体の肺は、それらの粘液栓付き細気管支が微生物のコロニー形成のための好都合な生息環境を作り出す典型的な場合である。様々な病原体が、この環境で相互作用し、CF疾患に関連する多くの症状を引き起こす。微生物群集のように、その生息地の化学的条件は、地域社会の構造と動態に大きな影響を与えます。例えば、異なる微生物は、異なるレベルの酸素または他の溶質濃度で増殖する。これは、酸素濃度がコミュニティの生理学および構造を駆動すると考えられるCF肺においても当てはまる。ここに記載されている方法は、肺環境を模倣し、病気を引き起こすような方法で病原体を増殖させるように設計されています。次に、これらの微生物の化学的環境の操作を用いて、肺感染のストリーはその微生物生態学を支配する。この方法は、WinCFシステムと呼ばれ、人工喀痰培地および細い毛細血管に基づいており、粘液栓の細気管支に存在するのと同様の酸素勾配を提供する。喀痰の培地pHや抗生物質の圧力などの化学的条件を操作することにより、着色インジケータを用いて試料中の微生物学的差異を視覚化することができ、気体またはバイオフィルムの産生を観察し、または各試料の核酸含量を抽出し、

サンプルの中に誘導し、様々な化学的条件にわたる微生物の増殖は、他の人に、より微妙にいくつかのケースでは劇的に変化します。活動の多くの変更は、すぐに潜伏期間が終了したとして容易に明らかにされて、自然の中で視覚的でした。インキュベーション後に明らかになった複数の要因によって示されるようなpH操作の例において、pHスペクトルにわたってサン...

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The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

粘液は、嚢胞性線維症の気道を差し込ま（CF）の患者は、微生物病原体が繁栄するための理想的な環境です。原稿は、彼らが病気を引き起こし、どのように化学的条件の変化は、微生物のダイナミクスを駆動することができ模倣環境でCF肺microbiomeを研究するための新規な方法を説明します。

WinCFモデル - 肺感染症の微生物学を研究するための粘液で閉鎖された細気管支の安価で収縮可能なマイクロコスモス

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

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9.0K ビュー.  University of California, San Diego. 粘液は、嚢胞性線維症の気道を差し込ま（CF）の患者は、微生物病原体が繁栄するための理想的な環境です。原稿は、彼らが病気を引き起こし、どのように化学的条件の変化は、微生物のダイナミクスを駆動することができ模倣環境でCF肺microbiomeを研究するための新規な方法を説明します。 

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

免疫・感染学

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

で水平遺伝子伝達の研究のための方法論<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...