Os autores gostaria de agradecer Eric Fishback (Universidade de Des Moines, Des Moines, Iowa, EUA) pela ajuda com gravação e edição de vídeo. As células de fibroblastos, como PS120 estàvel expressando NHE3-wt ou NHE3-YRK foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, EUA).

Nota: Dois amplificadores são necessárias para gravar a atividade dos transportadores de electroneutral por uma auto-referência ISE em conjunto com o patch de aperto, um amplificador de braçadeira do remendo para manter a célula em uma configuração de células inteiras e um (amplificador de alta impedância eletrômetro) para registrar a atividade de transporte através do ISE (ver tabela de materiais). O amplificador de braçadeira do remendo está directamente ligado ao terminal da placa de aquisição. O eletrômetro é ligado ao amplificador diferencial utilizado para filtrar e amplificar o sinal. O amplificador diferencial é conectado ao terminal da placa de aquisição. Capmeter, software de braçadeira do remendo que monitora a capacidade da pilha, tem sido utilizado em anteriores estudos20 (consulte a tabela de materiais). As soluções de câmara e perfusão de gravação são mantidas a 37 ° C.
1. preparação de pipetas para ISEs
<ol><li>Puxe as pipetas de vidro de borosilicato capilares para um diâmetro exterior de 1,2 mm (ver Tabela de materiais) usando a pipeta extrator2 .</li>
	<li>Polir a pipeta usando o microforge. O diâmetro da ponta da pipeta deve ser 2-3 µm.</li>
	<li>Coloque as pipetas em um suporte de frasco para pipetas com a ponta da pipeta virada para cima (veja a Tabela de materiais). Atenção: Execute etapas 1.4-1.6 em uma coifa química bem ventilada.</li>
	<li>Misture a mistura de siliconização que é composta de 1 gota (~ 150 µ l) de bis (dimetilamino) dimetil silano e 10 gotas de tetracloreto de carbono (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Despeje a mistura de siliconização dentro do frasco e feche a tampa firmemente.</li>
	<li>Incube o frasco com a mistura de siliconização por 24-48 h em uma coifa química à temperatura ambiente até que a mistura é completamente evaporada.</li>
	<li>Aterramento a pipeta com a resina de íon seletivo apropriada para criar uma coluna de aproximadamente 2-4 mm. Nota: Ionóforo de hidrogênio eu cocktail B pode ser atividade de gravação usedfor NHE (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Toque a ponta da pipeta para distribuir a resina íon-seletivo para a ponta e coloque a pipeta verticalmente no suporte do frasco com a ponta da pipeta para baixo.</li>
	<li>Pronto o dissecação microscópio que o coquetel de resina atingiu o fim da ponta. Se necessário, aplica uma pressão positiva para empurrar a resina para o efeito.</li>
	<li>Aterramento da metade-pipeta com a solução apropriada (~ 100 μL). Aqui, use 100 mM KCl e 10 mM HEPES pH 7.0 se usando ionóforo eu b cocktail.</li>
	<li>Conectem o ISE no eletrômetro e colocar a ponta do ISE na solução de banho usada para gravação. O eletrômetro de zero.</li>
	<li>Testar o H+-resposta seletiva de ISE, alterando o pH da solução de banho. O médio H+-seletivo ISE resposta é ~ 58 mV por unidade de pH.</li>
	<li>Avalie periodicamente a resposta ISE para calibração.</li>
</ol>2. preparação de Patch Clamp pipetas para gravação
Nota: Recomenda-se o método descrito por Donald Hilgemann, em seu artigo na gravação do Single-Channel21 .
<ol><li>Puxe as pipetas para patch gigante de capilares de vidro de borosilicato (mmOD 2.0 / 1.5 mm ID) em pipeta extrator2,22,23.</li>
	<li>Use uma microforge montada no palco de um microscópio invertido para fazer uma ampla pipeta ponta (22-10 μm)23. Derreter um grânulo (~ 0,5 mL) de vidro macio sobre o arame grosso de platina do microforge. Nota: Um fio de platina relativamente grosso é necessário (~0.5 mm), para fabricar pipetas remendo gigante.</li>
	<li>Posicione a pipeta de remendo perto do grânulo de vidro macio e aplique calor cheio até a ponta começa a diminuir. O fio de platina se moverá ligeiramente em direção a centerduring de aquecimento.</li>
	<li>Desligue o fogo e empurre a ponta da pipeta dentro do grânulo de vidro amolecida. O fio de refrigeração vai retrair e quebrar a ponta da pipeta.</li>
	<li>Reaplica o calor para suavizar a ponta da pipeta e criar uma ponta de pipeta do diâmetro desejado. O diâmetro da ponta é dependente do tamanho da célula para ser remendado (8-10 μm neste estudo).</li>
</ol>3. preparação de células
<ol><li>Aquecer a solução salina de tampão de fosfato (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +, solução de tripsina-EDTA e meio de crescimento para a 37 ° C.</li>
	<li>Células lave duas vezes com PBS. Use 1 mL de tampão de para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de tripsina às células para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm. Nota: Quando as células começam a reunir, agitar a placa para de anexar as células.</li>
	<li>Pare a ação da tripsina pela adição de 5 mL (quantidade para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm) de meio de cultura completo suplementado com 10% de soro fetal bovino. Nota: O tempo de reação em tripsina é o tipo de célula dependente.</li>
	<li>Coloca as células em um shaker com rock para evitar a formação de aglomerados.</li>
	<li>Use as células para até 2 h após tripsinização. Nota: O tempo pode variar conforme a linha celular.</li>
</ol>4. preparação de um sistema de perfusão Intrapipeta
<ol><li>Cortar um tamanho apropriado do tubo de quartzo (150 µm OD / 75 µm ID) para preparar a linha de perfusão intrapipeta.</li>
	<li>Inserir um lado do tubo de quartzo em uma ponta da pipeta 200 µ l. Cole o tubo de quartzo para a ponta e corte a extremidade da ponta com uma lâmina afiada.</li>
	<li>Conecte a linha de perfusão (tubo de quartzo colado à ponta) para um pequeno pedaço de tubo de silicone que serviria como um reservatório para a solução de perfusão intrapipeta.</li>
	<li>Conecte o tubo de silicone com uma seringa para criar pressão positiva.</li>
	<li>Inserir a extremidade livre do tubo de quartzo através do tubo de polietileno do titular da pipeta da perfusão de porta (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Avalie a linha de perfusão com a solução da pipeta.</li>
</ol>5. preparação de soluções
<ol><li>Prepare uma solução fortemente a tamponada pipeta para gravação NHE (aspartato de potássio 115 mM (KAsp), 1mm EGTA, 0.5 mM MgCl2, 10mm Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tubos de 12,5 mM, 12,5 mM MOPS e 12,5 mM MES, pH 6.0 ajustado com ácido aspártico). Nota: Prepare a solução de estoque pipeta e filtro. Adicione Mg-ATP antes da gravação.</li>
	<li>Prepare uma solução de banho fresco cada vez (140 mM de NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2e 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).</li>
</ol>6. gravação da actividade de transportador
<ol><li>Manter a câmara de gravação e todas as soluções a 37 ° C, porque a atividade de transporte é dependente da temperatura.</li>
	<li>Coloque as pilhas dentro da câmara de gravação. Espere até cair para o fundo da câmara, mas não deixe que eles anexar à câmara.</li>
	<li>Escolha uma célula apropriada. Medir o diâmetro da célula com o micrômetro ocular. Escolha células com diâmetros semelhantes. Nota: Geralmente, terá uma grande célula superfície mais celular e possivelmente mais transportadores expressos em sua membrana plasmática, assim também com mais actividade de transportador. No entanto, isto não é necessariamente correto, como atividade de transporte depende do transportador específico e o tipo de célula em estudo.</li>
	<li>Montar a pipeta de microeletrodos íon-seletivo para o micromanipulador, aterre a remendo-aperto pipeta com a solução intracelular, certifique-se de que a solução atinja a ponta da pipeta2. Nota: Ele pode requerer várias torneiras suaves para eliminar bolhas na ponta da pipeta.</li>
	<li>Monte a pipeta remendo-aperto para a fase principal da eletrofisiologia configurar2,22,23. Nota: É importante manter o palco principal no sobre um ângulo de 45 graus para o eixo horizontal, como isso garante um ângulo de entrada para a pipeta que é adequado para a formação de um selo altamente resistente.</li>
	<li>Aplicar uma pequena pressão positiva (~ 5 cm H2O) para a pipeta de remendo para reduzir a possibilidade de bloquear a ponta e colocá-lo na solução de banho.</li>
	<li>Pare de mexer a pipeta de braçadeira do remendo, uma vez que a ponta está perto da célula.</li>
	<li>Aliviar a pressão positiva enquanto pipeta toca o celular e aplique uma ligeira pressão negativa (~ 5 cm H2O) para obter um > 1000 pipeta de selo MΩ (um Giga-ohm) na membrana celular, com o patch23.</li>
	<li>Coloque a pipeta de remendo com a célula no mesmo plano focal como o ISE, e desloque a pipeta de remendo com a célula em proximidade com o ISE (~ 5-10 µm)2,5 evitar mas permitindo que a célula para entrar em contato com o ISE (figura 1A).</li>
	<li>Assegurar-se de que o potencial de exploração seja 0 mV.</li>
	<li>Rompa o selo com uma série de condutas curtas para obter a configuração de células inteiras.</li>
	<li>Mova o ISE (ou pipeta de braçadeira do remendo) lentamente, esquerda-direita ou acima-abaixo para registrar a atividade do transportador (figura 1B).</li>
	<li>Registrar picos de pelo menos 5-8 (Figura 1, de A para B).</li>
	<li>Aplicam-se as perturbações da onda quadrada durante a gravação para monitorar a qualidade do selo e a capacitância de membrana celular (Figura 1).</li>
	<li>Estimar o fluxo de H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) da diferença na concentração de H+ livre entre a superfície da pilha e a solução em massa (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Nota: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> e <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> h+ e coeficientes de difusão de buffer, respectivamente, BT é a concentração total do amortecedor, KD é a constante de dissociação do buffer, r é a célula raio, e <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> determina a mudança de estado estacionário da concentração de limite H+ para uma pequena mudança na enciclopédia H+. H+ indica um próton livre na solução. Para ser consistente com estudos anteriores, H+ fluxos são convertidos em unidades de fluxo eletrofisiológicos calculando os equivalentes atuais dos fluxos luminosos (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) em pA3,5].</li>
	<li>Normalize o fluxo de prótons à superfície da célula que pode ser calculada a partir do tamanho da célula ou para a capacitância de membrana.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. 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Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Apesar das funções cruciais de transportadores, os métodos disponíveis para estudar sua atividade são inadequado e ineficaz. Uma limitação é que os métodos disponíveis medem o movimento de iões mediado pela atividade de transporte, sem considerar as flutuações na composição iônica intracelular durante o experimento4. O método apresentado garante um controle preciso de composições de íon extracelular e intracelular e oferece uma poderosa ferramenta para modificar intracelular de...

Transporte de íons e solutos através da membrana de plasma é essencial para a sobrevivência das células e, portanto, de organismos1. Transporte seletivo de íons e solutos é alcançado por uma matriz de canal especializado e proteínas de transporte. Mutações nestas proteínas geralmente resultam em uma variedade de condições clínicas, canal e transportador proteínas alvos em potencial para o tratamento farmacológico1de renderização. Infelizmente, compreender os mecanismos subjacentes a função canal e transportador e regulamento é muitas vezes limitada pelas abordagens disponíveis para estudar sua atividade2,3,4.
Especificamente, os transportadores podem ser mais ou menos sub divididos em dois grandes grupos, dependendo se eles alterar o potencial transmembrana da célula durante o transporte de solutos: os transportadores de íons electrogenic alterando [por exemplo, fosfato de sódio- co-transportador 2a (NaPi2a), trocador de sódio-cálcio (NCX), etc.] ou os transportadores não alteram de íon electroneutral [por exemplo, o trocador de sódio-próton (NHE), co transportador de cloreto de sódio, NaPi2c, etc.]. As atividades de ambas as classes de transportadores têm sido estudadas extensivamente usando captação de isótopos radioativos e membrana-permeant fluorescente tinja2. Ambas as abordagens estimam a atividade dos transportadores medindo mudanças na concentração de íons citoplasmáticos específicos em massa, e os dois métodos têm limitações, como moderada sensibilidade e resolução de tempo e controle inadequado do intracelular Milieu. Com efeito, a atividade de muitos transportadores é dependente da concentração citoplasmática dos íons realizadas (por exemplo, NHE3, NCX), e alterações nas concentrações desses íons são esperadas para desempenhar um papel significativo na regulação da atividade de transporte2 , 3 , 5. medição precisa destes mecanismos regulador é limitada usando métodos clássicos.
Para superar essas limitações, métodos de braçadeira do remendo são utilizados para estudar a atividade de transportador2,6. Especificamente, a auto-referência eletrodos íon-seletivos (ISEs)7,8 combinada com o sistema de fixação de patch foi recentemente autorizado a medição da actividade de transporte de electroneutral3,4 , 5. ISEs são baseada no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. Um ISE movendo-se para e longe da membrana celular em um repetitivo, moda oscilatória registra uma diferença de tensão (MV). Diferenças de voltagem podem ser convertidas em valores de fluxo de iões utilizando um método de calibração que se aplica a primeira lei de Fick da difusão2,9. Enquanto ISEs são usados detectar o fluxo de íons em movimento de células, o método de braçadeira do remendo em ambas as células inteiras ou configurações de dentro para fora é usado para controlar a composição iônica intracelular e potenciais de membrana. Além disso, a aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lipídios e proteínas de3,5.
Em resumo, a versatilidade do método braçadeira remendo comparado com que outros métodos para estudar atividade de transporte fez remendo aperto apropriado para superar as limitações comuns destes outros métodos. A combinação de auto-referência ISEs e técnicas de braçadeira do remendo oferece a possibilidade única para medir a atividade dos transportadores de electroneutral em um ambiente experimental rigidamente controlado e descobrir romance biofísico e molecular Propriedades da membrana celular de transporte3,4,5. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para estudar a atividade do NHE. A família de proteínas mamífera NHE catalisa o intercâmbio líquido de electroneutral de sódio extracelular (Na+) para intracelular próton (H+)10,11 , utilizando um gradiente at+ para dentro. Nos mamíferos, a família de proteínas NHE inclui 11 proteínas relacionadas (NHE1-9 e NHA1-2) e um esperma específico NHE10,12,13.
Laiane (família SLC9a) é encontrados ubiquitously na maioria dos organismos vivos de simples procariontes para eucariontes superiores e está envolvidos em uma variedade de células vitais funções10,11, inclusive controlando a defesa de salinidade de célula em procariontes, mantendo o volume de homeostase e célula de ácido-base e regula a absorção de água e sal em vários epitélios especializados10,12,14,15. As funções biológicas chaves de laiane e a importância das suas funções foram determinados através de vários estudos; no entanto, alguns estudos têm investigado as propriedades biofísicas e moleculares de mamíferos laiane devido a limitações metodológicas4. Recentemente, a aplicação de auto-referência ISEs durante o aperto de células inteiras remendo revelou novos mecanismos moleculares de isoformas NHE regulamentadas por alterações nas concentrações intracelulares de íons, proteínas e fosfolipídios3, 4.
Especificamente, o protocolo fornecido neste manuscrito descreve os métodos e abordagens para estudar a atividade e o Regulamento de NHE isoform 3 (NHE3), um jogador importante na absorção de Na+, Cl–, HCO3– e fluido na membrana de fronteira escova do epitélio intestinal e renal14,16. Nova visão nas diferenças de sensibilidade do NHE3 atividade de remodelamento intracelular (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfato [PI (4,5) P2] e phosphatidylinositide 3, 4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) é relatado. Proteínas de transporte celular, tais como canais e transportadores, são regulamentadas pelo remodelamento17e NHE3 vincula diretamente tanto PI (4,5) P2 e P3 PI (3, 4,5)18. Com base na literatura atual, qualquer phosphoinositide pode ser relevante para a regulação fisiológica ou fisiopatológico da NHE35,18,19. Nossos resultados suportam funções separadas para PI (4,5) P2 e P3 de PI (3, 4,5) na regulação da atividade NHE3. Esta distinção foi possível graças à aplicação de técnicas ISE em combinação com gravação de braçadeira do remendo de células inteiras. Esta técnica também permite o controle do phosphoinositide conteúdo celular através da perfusão intracelular de remodelamento diferentes durante a medição da actividade NHE3.

<table><tbody><tr><td>Patch clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Differential Amplifier (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Software Based on MatLab</td><td>MatLab with acquisition toolbox</td><td></td><td>The capmeter software is recommended</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Temperature Control System</td><td>&amp;nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>In-line heater</td></tr><tr><td>Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Used for ion selective electrodes</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tetrachloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen ionophore I - cocktail B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Tubing</td><td>&amp;nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Used for patch clamp pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Used for intra-pipette perfusion system</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium aspartate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

O transporte de íons através das membranas celulares garante o controle fino de ião dentro e fora da célula que é indispensável para a sobrevivência da pilha. Estes mecanismos de transporte são mediados pela actividade de proteínas de transporte especializado. Especificamente, dinâmica de pH é finamente controlada por sistemas de extrusão de prótons (H+) de membrana plasmática, tais como o at+/h+ família de proteínas de cambista (NHE). Apesar de extensos esforços para estudar os mecanismos subjacentes Regulamento NHE, nossa compreensão atual das propriedades biofísicas e moleculares da família NHE é inadequada, devido à limitada disponibilidade de métodos para medir efetivamente a atividade NHE . Neste manuscrito, usamos H+-eletrodos seletivos durante a célula inteira remendo gravação aperto para medir o fluxo induzido por NHE H+ . Propusemos que esta abordagem para superar algumas limitações do normalmente usado métodos para medir atividade NHE, como absorção radioativa e fluorescente membrana permeants. Medição de atividade NHE, usando o método descrito permite alta sensibilidade e resolução de tempo e controle mais eficiente das concentrações intracelulares de H+ . H+-eletrodos seletivos são baseado no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. H+-elétrodo seletivo do movimento até e fora da membrana celular, de forma repetitiva, oscilatória registra uma diferença de tensão que é dependente do fluxo de H+ . Enquanto H+-eletrodos seletivos são usados para detectar o fluxo de H+ , movendo-se fora da célula, o método de braçadeira do remendo na configuração da célula inteira é utilizado para controlar a composição iônica intracelular. Além disso, aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lípidos. A atividade de transportador de NHE isoform 3 (NHE3) foi medida usando esta abordagem técnica para estudar a base molecular do Regulamento NHE3 pelo remodelamento.

Uma auto-referência ISE durante a gravação de braçadeira do remendo de célula inteira foi aplicado para estudar a regulamentação da atividade de NHE3 pelo remodelamento. PS120 células de fibroblastos,24, que falta a expressão da membrana plasmática endógena laiane, foram usados. NHE3 selvagem-tipo (NHE3-wt) ou NHE3 mutantes que não vincular remodelamento [tirosina 501, 503 de arginina e lisina 505 foram substituídos com alanina, Y501A/R503A/K505A (NHE3...

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Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K visualizações.  Des Moines University. Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

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Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Medir a tensão de membrana induzida com Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Biologia

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Bioquímica

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Neurociência

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Recapitulação de um Curve Ion IV Canal Usando componentes de freqüência

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of membrane carrier proteins reconstituted in lipid bilayer membranes is a powerful but delicate method for the assessment of their physicochemical and pharmacological properties. The substrate turnover number is a unique parameter that allows the comparison of the activity of different membrane proteins. In an electrogenic transport, the gradient of the translocated substrate creates a membrane potential that directly correlates to the substrate turnover rate of the protein. By using silver chloride electrodes, a diffusion potential, also called liquid junction potential, is induced, which alters electrode potential and significantly disturbs precise membrane potential measurements. Diffusion potential can be minimized by a salt bridge, which balances electrode potential. In this article, a micro-agar salt bridge is designed to improve the electrophysiological set-up, which uses micropipettes for the membrane formation. The salt solution is filled into a microcapillary pipette tip, stabilized by the addition of agarose, and can be easily mounted to a standard electrode. The electrode potential of a micro-salt bridge electrode is more stable compared to a standard electrode. The implementation of this system stabilizes electrode potential and allows more precise measurements of membrane potential generated by a pH gradient. Using this system, the proton turnover rates of the mitochondrial carriers UCP1 and UCP3 are reinvestigated and compared to earlier measurements.

In electrophysiological measurements, the presence of a diffusion potential disturbs the precise measurement of the reverse potential by altering the electrode potential. Using a micro-agar salt bridge, the impact of the diffusion potential is minimized, which allows a more precise measurement of substrate turnover numbers of reconstituted recombinant membrane proteins.

Um eletrodo de Micro-agar sal ponte para analisar a taxa de rotatividade de próton de proteínas recombinantes de membrana

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introdução à membrana apoiada sólida baseada Eletrofisiologia

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

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