המחברים רוצה להודות אריק Fishback (אוניברסיטת דה מוין, דה מוין, איווה, ארה ב) לסיוע שלו עם ירי ועריכת הוידאו. תאי פיברובלסט דמוי PS120 stably לבטא NHE3-wt או NHE3-YRK נמסרו באדיבות מאת ד ר מארק במושבים. שבהם (ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של אוניברסיטת, בולטימור, MD, ארצות הברית).

הערה: שני מגברים נדרשים עבור הקלטת הפעילות של מובילי electroneutral על ידי ISE הפניה עצמית בשיתוף עם תיקון מחבר חובק למעקה, מגבר מלחציים תיקון כדי לשמור על התא תצורה של כל תא, (מגבר של impendence גבוהה אלקטרומטר) כדי להקליט הפעילות טרנספורטר באמצעות ISE (ראה טבלה של חומרים). תיקון קלאמפ המגבר מחובר ישירות ללוח הרכישה מסוף. אלקטרומטר קשורה המגבר הדיפרנציאלי מנוצל כדי לסנן ומגבירים את האות. המגבר הדיפרנציאלי מחובר ללוח הרכישה מסוף. Capmeter, תוכנה מלחציים תיקון מפקח על קיבולת תא, שימש מחקרים קודמים20 (ראה טבלה של חומרים). הפתרונות קאמרית זלוף הקלטה נשמרים ב- 37 מעלות צלזיוס.
1. הכנה של מדי סוכר ISEs
<ol><li>משוך את פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט הקוטר החיצוני של 1.2 מ מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה פולר2 .</li>
	<li>פולנית על פיפטה באמצעות את microforge. הקוטר של קצה פיפטה צריכה להיות 2-3 מיקרומטר.</li>
	<li>מקם את פיפטות בעל צנצנת פיפטות עם קצה פיפטה פונה כלפי מעלה (ראה טבלה של חומרים). שים לב: בצע שלבים 1.4-1.6 בשכונה fume כימי מאוורר היטב.</li>
	<li>לערבב את התערובת siliconization המורכבת טיפה 1 (~ 150 µL) של bis (דלמטלמינו) דימתיל silane ו 10 טיפות של tetrachloride פחמן (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>שופכים את התערובת siliconization לתוך הצנצנת וסגור המכסה הדוק.</li>
	<li>דגירה את הצנצנת עם התערובת siliconization במשך 24-48 שעות בשכונה fume כימי בטמפרטורת החדר עד התערובת הוא התאדו לגמרי.</li>
	<li>מילוי רקע פיפטה עם שרף יון סלקטיבי המתאים כדי ליצור עמודה של 2-4 מ מ. הערה: מימן ionophore אני קוקטייל B יכול להיות פעילות NHE לבנייתם הקלטה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>הקש על קצה פיפטה להפיץ שרף סלקטיבית יון עד הקצה, ולמקם את פיפטה בצורה אנכית בתוך המחזיק צנצנת עם קצה פיפטה למטה.</li>
	<li>מתחת למיקרוסקופ ויבתר הקוקטייל שרף הגיע הסוף של הקצה. אם יש צורך, הפעילו לחץ חיובי כדי לדחוף את השרף עד הסוף.</li>
	<li>מילוי החצי-פיפטה עם הפתרון המתאים (~ 100 μL). . הנה, תשתמש 100 מ מ אשלגן ו- 10 מ מ HEPES ב- pH 7.0 אם משתמש ionophore אני קוקטייל B.</li>
	<li>להתחבר את ISE אלקטרומטר ולמקם את קצה ISE בתוך תמיסת אמבט משמש הקלטה. אפס את אלקטרומטר.</li>
	<li>בדיקת ה+-תגובה סלקטיבית ISE על-ידי שינוי ה-pH של התמיסה אמבט. ה ממוצע+-התגובה ISE סלקטיבית היא ~ 58 mV ליחידה של pH.</li>
	<li>מעת לעת להעריך את ההיענות ISE כיול.</li>
</ol>2. הכנת מלחציים תיקון סיליקון עבור הקלטת
הערה: השיטה המתוארת על ידי דונלד Hilgemann במאמרו על ערוץ אחד הקלטה21 מומלץ.
<ol><li>משוך את פיפטות ענק תיקון של נימים זכוכית בורוסיליקט (2.0 mmOD / 1.5 ממ ת. ז)22,232,פולר פיפטה.</li>
	<li>שימוש microforge רכוב על השלב של מיקרוסקופ הפוכה להגיע עם פיפטה רחב עצה (10-22 μm)23. להמיס חרוז (~ 0.5 מ ל) של זכוכית רכה על החוט פלטינה עבה של microforge. הערה: פלטינה חוט עבה יחסית נדרש (~0.5 מ"מ) כדי לבדות פיפטות ענק תיקון.</li>
	<li>מקם את פיפטה תיקון קרוב חרוז זכוכית רכה, ולהחיל חום מלא עד הקצה מתחילה לסגת. החוט פלטינה יעביר מעט לכיוון centerduring חימום.</li>
	<li>לכבות את האש, דחפו את הטיפ פיפטה חרוז זכוכית מרוככת. החוט קירור תמשוך ולשבור את הטיפ פיפטה.</li>
	<li>להחיל מחדש את החום כדי להחליק את הטיפ פיפטה וליצור טיפ פיפטה לקוטר הרצוי. הקוטר של הקצה תלויה בגודל של התא להיות שתוקנה (8-10 μm במחקר זה).</li>
</ol>3. הכנה של תאים
<ol><li>לחמם מלוחים מאגר פוספט (PBS) ללא Ca2 + , Mg2 +, טריפסין-EDTA פתרון מדיום הגידול ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>רחץ תאים פעמיים עם PBS. השתמש 1 מ"ל של המאגר לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ של טריפסין בתאי לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ. הערה: כאשר התאים מתחילים מצוד, נענעי את הצלחת לצרף מבטל את התאים.</li>
	<li>עצרי טריפסין על-ידי הוספת 5 מ ל (כמות לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ) של מדיום הגידול מלאה בתוספת 10% סרום שור בעובר. הערה: זמן התגובה של טריפסין הוא סוג התא התלויים.</li>
	<li>המקום התאים על מטרף עם נדנדה כדי למנוע היווצרות גושים.</li>
	<li>השתמש תאים עבור עד 2 שעות לאחר trypsinization. הערה: הזמן עשויים להשתנות בהתאם לקו תא.</li>
</ol>4. הכנת מערכת זלוף אינטרה-פיפטה
<ol><li>חתך בגודל המתאים של קוורץ אבובים (150 מיקרומטר OD / 75 מיקרומטר ID) כדי להכין את הקו זלוף אינטרה-פיפטה.</li>
	<li>הכנס צד אחד של הצנרת קוורץ טיפ פיפטה µL 200. הדבק את הצנרור קוורץ על הטיפ, לחתוך את הקצה של הקצה עם סכין גילוח חד.</li>
	<li>להתחבר לקו זלוף (קוורץ אבובים דבוק אל קצה) חתיכה קטנה של צינורות סיליקון שישמש מאגר עבור הפתרון זלוף אינטרה-פיפטה.</li>
	<li>להתחבר לאורך צינור סיליקון מזרק כדי ליצור לחץ חיובי.</li>
	<li>הוספה הסוף חינם של הצנרת קוורץ דרך הצינורית פוליאתילן של בעל פיפטה זלוף פורט (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להעריך את הקו זלוף עם הפתרון פיפטה.</li>
</ol>5. אופן ההכנה של פתרונות
<ol><li>להכין פתרון פיפטה בכבדות במאגר הקלטה NHE (115 מ מ אשלגן אספרטט (KAsp), 1 מ"מ EGTA, 0.5 מ מ MgCl2, 10 מ מ ג-ATP, 12.5 מ מ HEPES, צינורות 12.5 מ מ, המגבים 12.5 מ מ ו- 12.5 מ מ MES, pH 6.0 מותאם עם חומצה אספרטית). הערה: להכין את מניות פיפטה פתרון סינון. הוסף Mg-ATP לפני הקלטה.</li>
	<li>להכין פתרון אמבט טרי בכל פעם (140 מ"מ NaCl, מ מ 2 CaCl2, 2 מ מ MgCl2ו- pH טריס-HCl 0.1 מ מ 8.2).</li>
</ol>6. רישום של פעילות טרנספורטר
<ol><li>לשמור על חדר ההקלטה ואת כל הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס, כי פעילות טרנספורטר היא תלוית טמפרטורה.</li>
	<li>מקם את התאים אל החדר הקלטה. חכו עד שהם להוריד לחלק התחתון של החדר, אבל אל תתנו להם לצרף אל התא.</li>
	<li>בחר תא המתאים. למדוד את הקוטר של התא עם עינית מיקרומטר. בחר תאים עם קטרים דומה. הערה: בדרך כלל, תא גדול יהיה השטח התאים ואולי יותר מובילי הביע על קרום פלזמה שלה, וכך גם יש יותר פעילות המשלח. עם זאת, זה לא בהכרח נכון, כמו פעילות טרנספורטר תלוי ספציפית לגבי המעלית ואת סוג התא שנבחנה.</li>
	<li>הר על פיפטה microelectrode יון סלקטיבית כדי micromanipulator, מילוי פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה עם הפתרון תאיים, עליך לוודא כי הפתרון מגיע הטיפ של פיפטה2. הערה: זה עשוי לדרוש הברזים עדין מספר לחסל בועות על חוד פיפטה.</li>
	<li>הר של פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה ראש לשלב אלקטרופיזיולוגיה להגדיר22,2,23. הערה: חשוב לשמור על הבמה ראש על זווית 45 מעלות לציר האופקי, זה מבטיח זווית הכניסה עבור פיפטה מתאים היווצרות של גושפנקה עמיד מאוד.</li>
	<li>החל לחץ חיובי קטן (~ 5 ס"מ H2O) על פיפטה תיקון כדי להקטין את הסיכוי של חוסם את הטיפ, ומניחים אותו בתוך תמיסת אמבט.</li>
	<li>. תפסיק לזוז על פיפטה מלחציים תיקון פעם הטיפ הוא קרוב התא.</li>
	<li>לשחרר את הלחץ חיובי בעוד פיפטה נוגע התא והפעילו לחץ שלילי קלה (~ 5 ס"מ H2O) כדי להשיג > 1000 MΩ (גיגה אוהם) חותם על קרום התא עם התיקון פיפטה23.</li>
	<li>למקם את פיפטה תיקון עם התא באותו מישור מוקד כמו ISE ולהזיז את פיפטה תיקון עם התא בסמיכות ISE (~ 5-10 מיקרומטר)2,5 אלא למנוע ומאפשר את התא כדי לפנות את ISE (איור 1 א').</li>
	<li>להבטיח כי החזקת פוטנציאלי הוא 0 mV.</li>
	<li>קרע את החותם עם סדרת ראספים קצר כדי להשיג את תצורת כל תא.</li>
	<li>להזיז את ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) לאט משמאל או מעלה-מטה כדי להקליט את הפעילות של המשגר (איור 1B).</li>
	<li>להקליט את פסגות לפחות 5-8 (איור 1C, מ- A ל- B).</li>
	<li>החל גל מרובע לפליטת במהלך ההקלטה לעקוב אחר האיכות של החותם, קיבוליות של קרום התא (איור 1).</li>
	<li>להעריך את שטף H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) מן ההבדל בריכוז H+ חינם בין פני השטח תא הפתרון בתפזורת (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> הערה: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> , <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> H+ , מאגר המקדמים של דיפוזיה בהתאמה, BT הוא ריכוז מאגר הכולל, KD הוא קבוע דיסוציאציה של המאגר, r הוא התא רדיוס, ו <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> קובע לשינוי מצב יציב הריכוז של ה מאוגד+ עבור שינוי קטן חינם H+. H+ מציין פרוטון חופשי בתמיסה. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, H+ פלקסים מומרים השטף אלקטרופיזיולוגיות יחידות על-ידי חישוב של מקבילות הנוכחי פלקסים (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday)3,הרשות הפלסטינית5].</li>
	<li>לנרמל את שטף פרוטון השטח תא זה ניתן לחשב את גודל התא או את קיבול הממברנה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

למרות הפונקציות מכריע של שנאים, השיטות הזמינות ללמוד את פעילותם הן יעילות ואף לא מתאימות. מגבלה אחת היא כי השיטות הזמינות למדוד תנועה יון מתווכת על-ידי טרנספורטר פעילות בלי להתחשב תנודות בהרכב יון תאיים במהלך ניסוי4. השיטה הציג מבטיחה שליטה מדויקת של יון חוץ-תאית, תאיים יצירות ומציע כלי רב עוצמה עבור שינוי יון תאיים, חלבון, שומנים בדם יצירות3,4,5.
הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא הכנת איסה זה יציבים במשך תקופה ארוכה25. מניסיוננו, ISE לא יציבה אינה siliconized היטב (למשל, שרף יון סלקטיבי מחולקת בצדדים פיפטה ISE), אשר ניתן להבחין על הסחף מתמדת ובלתי נשלט בתוך האות ISE. בנוסף, התפלגות שרף ב ISE צריך לפקח באופן הדוק במהלך הניסוי. הפתרון אמבט עשויים לדחוף שרף יון סלקטיבי בתוך ISE הפיפטה יצירת עמודת בפתרון אמבטיה לפני שרף25. במקרה זה, ISE להקליט את ריכוז יון מעמודה זו ולהיות מצבו לשינויים מעברי הצבע יון במהלך הניסוי. התאמת הגיאומטריה של ISE המפתח כדי להשיג תשובה ISE בטווח של 100 ms9 ואת להתגבר על עיכובים אפשריים בתגובות-ISE זמן מושווה שינויים הדרגתיים יון.
המגבלה העיקרית של השיטה הציג הוא ירש את התיקון מחבר חובק למעקה מדידה של פעילות טרנספורטר בתאי אפיתל. בעת ניתוק מתמיכה ומתוחזק ההשעיה, תאי אפיתל מקוטב עלולה לאבד לוקליזציה מקוטב של מובילי על קרום הפסגה או basolateral.
תיקון ששונה מחבר חובק למעקה מדידה אמור לשמש לומדים ערוצי, מסועי ב epithelia מקוטב. בהתחשב בעובדה כי תאים עשוי משוער לתוך גליל מאשר כדור חשוב בשעת שינוי צורה של מעבר הצבע H+ לתוך השטף דרך הנוסחה מסופקים. במקרה זה, יש לשנות את הנוסחה כדי <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq7.jpg"> שבו λ הוא אורך הגליל, r הוא רדיוס גליל, ad x הוא המרחק רדיאלי האמצע גליל שבמהלכן מעבר הצבע הוא נמדד5. פיתוח עתידי של טכניקה זו עוצמה ללמוד electroneutral מובילי להתמקד על שינוי השיטה כדי למטב את ההקלטה תאים גדל של טפט.

תחבורה בין יונים מומסים בגבול על פני קרום פלזמה היא חיונית להישרדותו של התאים ומכאן של אורגניזמים1. תחבורה סלקטיבית של יונים, מומסים בגבול מושגת על ידי מערך של חלבונים טרנספורטר וערוץ מיוחדת. מוטציות בחלבונים אלה לעיתים קרובות לגרום מגוון תנאים קליניים, עיבוד טרנספורטר וערוץ חלבונים מטרות אפשריות עבור טיפול תרופתי1. למרבה הצער, הבנת המנגנונים שבבסיס ערוץ וטרנספורטר ורגולציה לעיתים קרובות מוגבל על ידי הגישות לרשות המחקר שלהם פעילות2,3,4.
באופן ספציפי, מסועי בערך תת מתחלקים לשתי קבוצות גדולות בהתאם אם הם לשנות את הפוטנציאל transmembrane תא במהלך ההובלה של מומסים בגבול: מובילי שינוי יון electrogenic [למשל, נתרן-פוספט 2a טרנספורטר משותף (NaPi2a), נתרן סידן מחליף (NCX), וכו '.] או למעליות יון electroneutral ללא שינוי [כגון: מחליף נתרן-פרוטון (NHE), מוביל שיתוף סודיום-כלוריד, NaPi2c, ועוד.]. הפעילות של שני המעמדות של מובילי נחקרו בהרחבה באמצעות קליטת איזוטופים רדיואקטיביים, צבעי פלורסנט ממברנה-permeant2. שתי הגישות להעריך את הפעילות של מובילי על ידי מדידת שינויים בריכוז בצובר יונים ספציפיים cytoplasmic ולאחר שתי השיטות יש מגבלות, כגון רגישות בינונית ו ברזולוציה זמן לקוי השליטה תאיים חצרו. ואכן, הפעילות של מובילי רבים תלויה cytoplasmic ריכוז היונים נשאו (למשל, NHE3, NCX), צפויים שינויים בריכוזים אלה יון יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות המשלח2 , 3 , 5. מדידה מדויקת של מנגנונים אלה בחקיקה מוגבל בשיטות קלאסיות.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, שיטות מלחציים תיקון משמשים כדי לחקור את פעילות המשלח2,6. באופן ספציפי, הפניה עצמית אלקטרודות יון סלקטיבית (ISEs)7,8 בשילוב עם התיקון מחבר חובק למעקה המערכת אפשרה לאחרונה את המדידה של electroneutral טרנספורטר פעילות3,4 , 5. ISEs הם מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. איסה זזים למעלה כדי ורחוק קרום התא בחוזרות אופנה מתנדנדות רשומות שינוי מתח (µV). מתח ההבדלים יכולים להיות מומרים יון השטף ערכים באמצעות שיטה כיול כי חל החוק הראשון של Fick של דיפוזיה2,9. בעוד ISEs משמשים לזיהוי השטף של יונים זז מתוך תאים, שיטת מלחציים תיקון שני תאים שלמים או תצורות הפוכה משמשת לבקרה ההרכב יון פוטנציאליים, תאיים ממברנה. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם3,של שומנים, חלבונים-5.
לסיכום, צדדיות של השיטה מלחציים תיקון לעומת כי של שיטות אחרות כדי ללמוד פעילות המשלח עשה תיקון מחבר חובק למעקה מתאימים על מנת להתגבר על המגבלות נפוצות של השיטות האחרות. השילוב של הכוללות הפניה עצמית ISEs וטכניקות מלחציים תיקון מציעה את האפשרות ייחודי כדי למדוד את הפעילות של מובילי electroneutral בסביבה ניסיוני פיקוח הדוק, לגלות את הרומן biophysical ומולקולרית המאפיינים של קרום התא תחבורה3,4,5. גישה זו שימש בהצלחה ללמוד את הפעילות של NHE. משפחת יונקים חלבונים NHE מזרז ההחלפה נטו electroneutral חוץ-תאית נתרן (Na+) עבור פרוטון תאיים (H.+)10,11 ניצול של הדרגה Na+ פנימה. ביונקים, משפחת חלבונים NHE כולל חלבונים הקשורים 11 (NHE1-9 ו- NHA1-2) של הזרע ספציפי NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a משפחה) נמצאים ubiquitously רוב היצורים החיים של אאוקריוטים פשוטה כדי פרוקריוטים גבוה ומעורבים במגוון של התא חיוני פונקציות10,11, כולל שליטה את ההגנה מליחות תא אאוקריוטים, שמירה על הומאוסטזיס חומצה בסיס וכרך תא, מווסת את ספיגת מלח ומים שונים מיוחדים epithelia10,12,14,15. התפקיד הביולוגי מפתח של NHEs ואת המשמעות של הפונקציות שלהם שנקבע באמצעות מספר מחקרים; עם זאת, מחקרים מעטים חקרו את המאפיינים biophysical ומולקולרית של יונקים NHEs בגלל מגבלות מתודולוגי4. לאחרונה, היישום של הכוללות הפניה עצמית של ISEs במהלך תיקון שלם-תא מחבר חובק למעקה חשפה את הרומן המנגנונים המולקולריים של NHE איזופורמים מוסדר על ידי שינויים ריכוזי יונים, חלבונים, פוספוליפידים3, תאיים 4.
באופן ספציפי, פרוטוקול בתנאי כתב יד זה מתאר את הדרכים ואת הגישות ללמוד את פעילות וויסות של NHE isoform 3 (NHE3), שחקן מרכזי לספיגת נוזלים HCO3– , Cl–, Na+ מברשת קרום הגבול של כליות, מעיים epithelia14,16. תובנה חדשה הבדלים הרגישות של פעילות NHE3 כדי phosphoinositides תאיים (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4.5) P2], phosphatidylinositide 3,4,5-טריפוספט [PI(3,4,5]P3]) הוא דיווח. תא תחבורה חלבונים, כגון ערוצי מובילים, מוסדרים על ידי phosphoinositides17, NHE3 נקשר ישירות P2 PI (4.5) והן P3 PI (3,4,5)18. על סמך הספרות הנוכחי, גם phosphoinositide יכול להיות רלוונטי להסדרת פיזיולוגיים או pathophysiological NHE35,18,19. הממצאים שלנו תומך בתפקידים נפרד PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) בוויסות פעילות NHE3. הבחנה זו התאפשרה בשל היישום של טכניקות ISE בשילוב עם הקלטה מלחציים תיקון כל תא. טכניקה זו מאפשרת גם שליטה על התוכן הסלולר phosphoinositide ויה זלוף תאיים של phosphoinositides שונים במהלך המדידה של פעילות NHE3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Patch clamp Amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:276px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Differential Amplifier (DP-301)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Patch Clamp Software Based on MatLab</td>
			<td style="width:219px;">MatLab with acquisition toolbox</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>The capmeter software is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">ThermoClamp-1 Temperature Control System</td>
			<td>&#160;AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:101px;">03-11-LL</td>
			<td>In-line heater</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:101px;">1B120F-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Used for ion selective electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Carbon tetrachloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">319961-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Hydrogen ionophore I - cocktail B</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">95293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Thin Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:219px;">&#160;Sutter Instrument</td>
			<td style="width:101px;">B200-156-15</td>
			<td style="width:276px;">Used for patch clamp pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td>
			<td style="width:219px;">Molex (Polymicro Technologies)</td>
			<td>106815-0018</td>
			<td style="width:276px;">Used for intra-pipette perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Potassium aspartate&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">PIPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MOPS</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Apyrase</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-4508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-3908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

הובלת יונים דרך קרום התא מבטיחה שליטה בסדר של יון תוכן בתוך ומחוץ לתא שעליו היא הכרחית להישרדות התא. מנגנונים אלה התחבורה הם מתווכת על-ידי הפעילות של חלבונים מוביל מתמחה. באופן ספציפי, pH dynamics דק נשלטים על ידי מערכות ההבלטה קרום פלזמה פרוטונים (H.+), כגון Na+/H+ מחליף (NHE) חלבון המשפחה. למרות המאמצים ללמוד המנגנונים NHE תקנה, ההבנה הנוכחית שלנו של המאפיינים biophysical ומולקולרית של משפחת NHE זה לא מספיק בשל המוגבל של שיטות למדוד ביעילות NHE פעילות . כתב יד זה, השתמשנו H+-אלקטרודות סלקטיבית במהלך כל-תא תיקון הקלטה clamping כדי למדוד את השטף הנוצרות על-ידי NHE H+ . אנחנו הציע גישה זו כדי להתגבר על כמה מגבלות של בדרך כלל השתמשו בשיטות למדידת פעילות NHE, כגון ספיגת רדיואקטיבי permeants ממברנה פלורסנט. מדידה של פעילות NHE באמצעות השיטה המתוארת מאפשר רגישות גבוהה, זמן רזולוציה ובקרה יעיל יותר של ריכוזים H+ תאיים. H+-אלקטרודות סלקטיבית הן מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. H+-סלקטיבית אלקטרודה מעבר, הרחק קרום התא בצורה שחוזרת על עצמה, מתנדנדות רשומות שינוי מתח התלויים השטף H+ . בעוד H+-אלקטרודות סלקטיבי משמשים לזיהוי שטף H+ עוזבת התא, השיטה מלחציים תיקון בתצורה שלם-תא משמשת לבקרה ההרכב יון תאיים. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם שומנים. הפעילות מוביל של NHE isoform 3 (NHE3) נמדדה באמצעות גישה טכנית זו ללמוד את הבסיס המולקולרי של תקנה NHE3 על ידי phosphoinositides.

ISE הפניה עצמית במהלך ההקלטה מלחציים תיקון שלם-תא הוחל ללמוד ויסות פעילות NHE3 על ידי phosphoinositides. PS120 תאי פיברובלסט כמו24, שחסרה את הביטוי של קרום פלזמה אנדוגני NHEs, שימשו. NHE3 פראי-סוג (NHE3-wt) או מוטציות NHE3 זה אין איגוד phosphoinositides [טירוזין 501, ארגינין 503, ליזין 505 היו שהוחלפו עם אלנין, R503A/Y501A/K505A (NHE3-YRK)] היו stably לידי תאי פיברובלסט דמוי PS12018.
העקבות מוצגים באיור2. התא היה במוחי תצורה של תאים שלמים באמצעות פיפטה עבור תיקון מחבר חובק למעקה, ISE הוצב מול התא. במצב הזה, ISE הקליט את הריכוז של H חינם+ קרוב קרום התא (איור 1 א'); לאחר מכן, ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) היה מיקרומטר רוחבית 50 הועברו באופן ידני ואשר נרשמו ריכוז חינם H+ הפתרון (איור 1B). ההבדלים מתח מוקלטות, המייצגים שתי העמדות של פיפטה תיקון עם התא לפני או הרחק את איסה הם נציג של פעילות NHE3 (איור 1C). זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase (ATP-diphosphatase) מקטין את הריכוז תאיים של ATP, לאחר מכן להקטין את תוכן phosphoinositide5. מסכים עם מחקרים שדווחה בעבר5,18,19, התוכן phosphoinositide ירד מתווכת על ידי טיפול apyrase מופחת פעילות NHE3 (~ 50%), אשר הוקלט כמו ירידה ברמת המתח משרעת תנודה (איור 2). ההשפעה של apyrase (ניתן ב- 5 יחידות/ml) על פעילות NHE3 התהפכה לחלוטין על ידי זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase בשילוב עם 2 מיקרומטר P3 PI (3,4,5) (איור 2 ו- 3 א). ממצאים אלה נתמכו על ידי הפעילות NHE3 הקליט בתאים PS120 stably לבטא מוטציות NHE3 (NHE3-YRK) הצליחו לקשור phosphatidylinositides18. זלוף של apyrase לבד או בשילוב עם PIP3 לא השפיע על הפעילות של NHE3 NHE3-YRK מוטציות (איור 3B). הפעילות של NHE3 אנדוגני היה גם מעוכבים על ידי טיפול apyrase תאי הכליה (OK) אופוסום3. זלוף אינטרה-פיפטה של PI (3,4,5) P3 להפוך עיכוב של פעילות NHE3 שנגזרות apyrase בתאים בסדר (איור 3C). ממצאים אלה מראים כי ההשפעה של P3 PI (3,4,5) על פעילות NHE3 אינה תא ייחודיים לסוג.
בשלב הבא, אנחנו נועדו לבדוק את ייחודה של PIP3 על ויסות בתיווך apyrase שינויים בפעילות NHE3. אנחנו עשינו את זה על-ידי assaying את ההשפעה על הפחתת apyrase תלויי על פעילות NHE3 לאחר זלוף של phosphoinositides אחרים, כגון P2 PI (4.5) PI (4.5) P2 (ב 10 מיקרומטר) לא השפיע על ירידה בפעילות NHE3 מתווכת על-ידי apyrase (איור 4A). בסופו של דבר, זלוף של המגבר-PNP, אנלוגי הלא-hydrolysable ATP, אינם חוסמים theapyrase תלויי-עיכוב של פעילות NHE3 (איור 4B). ממצאים אלה מראים תפקיד של P3 PI (3,4,5), אבל לא פאי (4.5) P2, בוויסות NHE3 לאחר דלדול ATP. זיהוי תפקידים נפרדים עבור PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) ב NHE3 תקנה היה אפשרי רק בגלל זלוף המערכת של phosphoinositides במהלך המדידות ISE בשילוב עם מלחציים תיקון שלם-תא הקלטה5. פעולה ספציפית של P3 PI (3,4,5) יותר מאשר PI (4.5) P2 בוויסות פעילות NHE3 יקר, כדי לקבוע אם phosphoinositides תאיים שונים לווסת את הפונקציה של NHE3 באופן שונה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig1.jpg"> איור 1 . ייצוג סכמטי של H+ שטף ובחינת המתאם בין פעילות NHE ההבדלים הפוטנציאליים נרשם על ידי microelectrode ה-pH. ייצוג סכמטי של הגדרת הקלטה. תרשים א של הגדרת הניסוי הראשוני. התא שבידי בתצורה שלם-תא פיפטה מהדק התיקון, הניח לפני איסה. בתנוחה זו, ISE מתעדת את הריכוז של H חינם+ קרוב קרום התא. נולד ב ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) הועברו באופן ידני רוחבית ~ 50 מיקרומטר, רושם את הריכוז של H חינם+ הפתרון במצב הזה. ג. ייצוג גרפי של מתח ההבדלים הקליטה באמצעות ISE. תנודות מעמדה (תא מול ISE) ל- B (תא רחוק ISE) הם נציג של פעילות NHE. התוכנה ששימשה רשום את המתח ההבדלים שהוקלט על ידי ISE ועורר לפליטת גל מרובע (20 mV, 0.2 kHz) כדי לנטר את קרום התא קיבוליות ואיכות החותם מלחציים תיקון. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig2.jpg"> איור 2 . דוגמה של הקלטה להגדיר לפעילות טרנספורטר NHE3 בתא יחיד PS120 stably לבטא NHE3-wt לפני ואחרי זלוף עם apyrase ו- P3 PI (3,4,5) (PIP3). לאחר ההקלטה הראשונית, התא הייתה דלה של ATP על ידי זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase. פעילות NHE3 בהדרגה ירד והיא שוחזרה על ידי PIP3 אינטרה-פיפטה זלוף. Apyrase תוספת מצוינת באמצעות העמודה האדומה, PIP3 תוספת מצוינת באמצעות הפס הירוק. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig3.jpg"> איור 3 . ההשפעה של דלדול ATP זלוף PIP3 בפעילות טרנספורטר NHE3 בתאים PS120 ו- OK. ההשפעה של דלדול ATP בתיווך apyrase על פעילות NHE3, את הזמנת את השפעת apyrase על פעילות NHE3 שנגזרות זלוף אינטרה-פיפטה PIP3: א PS120 תאים לביטוי NHE3-wt או B. PS120 תאים לביטוי NHE3-YRK, NHE3 מוטציות אפשרות לבצע איגוד phosphoinositides. ג תאים בסדר להביע NHE3 אנדוגני. החוגים מוצק הצג נתונים ממוצע ניסויים בודדים (ארבעה ניסויים שבוצעו בתנאים זהים). קווי שגיאה מייצגים את האמצעים ± תקן שגיאות (SE). * P 0.05 < לעומת שליטה, ANOVA. $ P < 0.5, apyrase < 0.01 $$P לעומת apyrase + PIP3, ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig4.jpg"> איור 4 . ההשפעה של PI (4.5) P2 (PIP2) ו- ANP-PNP זלוף בפעילות NHE3 לאחר דלדול ATP. ההשפעה של א PIP2 או B. זלוף ANP-PNP אינטרה-פיפטה על צמצום תלויי-apyrase NHE3 פעילות בתאים PS120 לבטא NHE3-wt. החוגים מוצק הצג נתונים ממוצע ניסויים בודדים (ארבעה ניסויים שבוצעו בתנאים זהים). קווי שגיאה לייצג את האמצעים ± SE. * P < 0.05, * * P < 0.01 לעומת שליטה, ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56630/56630fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K Views.  Des Moines University. כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספ...

Video: Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

יישום מיקרופלואידיקה Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...