この研究は、ウィーン市、Österreichische 協会 für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie の市長の医療科学基金によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは動物愛護とウィーンの医学大学の利用委員会によって承認され実施によると、連合の欧州研究所動物科学連合 (FELASA)。制度や政府の承認の後だけでなく、技術的に精通しているスタッフによってのみこのプロトコルで説明したすべての手順は実行されることに注意してください。
1. HFD 給電マウス
注: は、食料と水を無料で 12 h 光/暗いサイクルですべての c57bl/6 j マウスを保持します。
<ol><li>6 週齢、場所でマウス、肥満を誘発する、HFD (40-60% 脂肪カロリー) の 8-12 週の低脂肪ダイエット (LFD) リーン コントロール グループを供給しながら (10% 脂肪カロリー)。</li>
	<li>週単位でマウスの体重を決定します。ウェイト カーブ HFD 供給グループの高い斜面で、両方のグループで同じようなパターンが表示されます。</li>
</ol>2。 OGTT
注: 15 分毎、OGTT 中血液サンプリング タイム ポイントが選択されている場合実験対象となる最大並行して、15 匹のマウスのマウスあたり少なくとも 1 分処理時間を持つために。
<ol><li>OGTT の前日準備<ol>
<li>マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら新鮮な寝具と高速 (14 h) をテストする前に夜間にケージにマウスを転送 (例えば、18:00 次の朝 8:00 に開始時刻のために食べ物を削除) します。 メモ: 断食マウス一晩は標準的なアプローチが短く高速 (5 〜 6 時間) がより生理的マウス (詳細については説明を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>準備日に実験 (ただし実験開始前)<ol>
<li>20% ブドウ糖液 10 mL を準備 (溶解 d-(+)-グルコース蒸留水で)。 注: 動物に投与されるすべての試薬は、薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。</li>
		<li>5 μ L で各サンプリング時点の各マウス 1 つの井戸を埋めることでプラズマ コレクションの 96 ウェル プレートを準備 NaEDTA (0.5 M EDTA、pH 8.0 で 0.9% 食塩水、常温保管)。実験では、氷にこのプレートを保存します。 注: は、補足図 1詳細なチェックリストを参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>すべてのマウスの体重を測定し、マウスは簡単に区別できる (例えばマウス 1 = 1 ダッシュ、マウス 2 = 2 ダッシュのなど) を作るために永久的なマーカーと彼らの尾をマークします。</li>
	<li>グルコース測定と採血 (図 2)<ol>
<li>慎重に鋭いはさみ("バリアント"図 2の A) を使用して尻尾の先端の 1-2 mm を切った。常に溶血または血糖値測定のための新しい血液サンプルを取る前に組織液の混入を避けるために血の最初の滴を拭き取ってください。基底血糖値 (= 0 の時点)、glucometer との測定のため、少量の血液サンプル (〜 3 μ L) を描画します。 注意: を確認し、glucometer のテスト ストリップの充満数を調整します。 注: 代替血液サンプリング方法として鋭いメスの刃 (図 2には"バリアント B") でマウスの外側尾静脈をニックします。外側尾静脈に多数のサンプル、尾の根元に向かって尻尾先端から尾の長さに沿って約 3 分の 1 は、通常します。局所麻酔クリームの使用をお勧めします。少なくとも 30 の軟部組織に指の圧力を適用することによって血流を停止 s 動物は檻に戻される前に。</li>
		<li>新鮮な毛細管 (キャピラリー チューブの水平維持) を使用して血液サンプル (約 30 μ L) を収集します。ピペットを用いたキャピラリー チューブの端の上部にピペット チップを入れて、慎重に空気の泡を回避しながら 96 ウェル プレートのウェルに集められた血を押すキャピラリー チューブを空にします。すべてのマウスの 1 つずつのこの手順を繰り返します。 注: キャピラリー チューブを介して血のコレクションのための代替血液を収集し、収集のドロップする (例えば、30 μ L) 適切なボリューム調整ピペットを使用して血液パラフィン フィルムとピペットで尻尾からは EDTA 溶液に。厳密にその後グルコースとインスリンの測定に影響を与える可能性があります血または glucometer テスト ストリップとゼリーに石油の接触を避けます。 注意: OGTT は非常にマウスのストレス: 無駄のないマウスを失うことが前後の体重の 15% 夜行高速で。さらに、別の時点で採血は血液のかなりの損失につながります。簡単に採血、ワセリンと mouse-tail を慎重にマッサージすることが可能です。 注: 制度のガイドラインは、一定期間内に集められた血の許容量を制限があります。サンプリング ボリュームと縦長に許可されている最大値を超えないように調整してください。マウスの体重の合計を計算に使用する血液の撤退を許可します。</li>
	</ol></li>
	<li>体重 (体重 1 g グルコース/kg; 3 g/kg まで増加するこのことができます) に基づくブドウ糖輸液の必要量を計算にすべてのマウスの経口投与による投与されます。たとえば、30 g の体重を持つマウスは、30 mg のグルコースを管理する 20% ブドウ糖溶液を 150 μ l 添加を必要があります。 注: マウスの重量を基にグルコースの投与量を標準的な手順です。OGTT を計算する必要がありますのブドウ糖の投与量が、リーンに基づく体組成データが利用可能な場合本体質量 (詳細については説明を参照)。</li>
	<li>グルコースの投与<ol>
<li>準備に関するすべてのことは、前もって全体の実験中に必要な (タイマー、実験記録シート、グルコース モニターとストリップ、毛細血管、注射器、グルコース溶液、96 ウェル プレート、メス、電卓、バランス、永久的なマーカー、ベンチのペーパー、ピペット チップ、そして手袋をして)。</li>
		<li>グルコース アプリケーションのしっかりと首筋を把握することによりマウスを抑制します。マウスの抑制からのねじれを防ぐために正しく戻って頭を傾けると首の周りの皮膚に十分な硬さを適用されます。また、マウスが正しく呼吸できることを確認します。 注: グルコースの投与を開始すると、良い時間管理は非常に重要です。</li>
		<li>慎重に餌針を使用して胃の中に直接 (2.5 のステップに基づいて) グルコース溶液を管理します。慎重に直接食道に向かって口から給餌針。針を飲み込むには、マウスを許可する: マウスの下の食道/胃に完全、針のシンクします。その後、グルコース溶液 (図 3 a) を挿入します。<ol>
<li>どんな抵抗が満たされる動物はすぐに戦う場合や、針を撤回し、それを移動します。最初の強制経口投与後すぐにタイマーを開始および他のすべてのマウスに 1 分間隔でブドウ糖を管理します。 注: それが舐めていると嚥下、餌針の簡単挿入容易に刺激するマウスの口に餌針から直接ブドウ糖溶液の一滴を適用するあります。これは真剣に動物を傷つける可能性があります、餌針を挿入する場合は、圧力は適用されません。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>15 分後、glucometer と血糖値を測定し、また採血 (〜 30 μ L) (ステップ 2.4 で説明されている詳細) として各マウスの同じ順序で彼らを注入したよう。 注: 時間管理は非常に重要です。強制経口投与と同じ時間間隔を使用して可能な限り、従ってください。結果を変更可能性があります、ストレスを軽減することと、全体の手順中に制限を最小限に抑制自由に移動マウスをしましょう。片方の手で尻尾を牛乳し、他の血液を収集します。</li>
	<li>(例えば30、45、60、90、120、150、およびグルコースの投与後 180 分で) 期待される結果によって選択した時点で 2.7 手順を繰り返します。選択した時間ポイントが 120 分を超える場合、マウスに飲料水へのアクセスがあることを確認します。マウス常に飲料水へのアクセスがあることを確認します。実験を完了したら、マウスを食料と水装備ホーム檻に返します。 注意: OGTT はマウスに非常に疲れるです。したがって、ITT など次の代謝テストを実行する前に、少なくとも 1 週を待ちます。</li>
	<li>2,500 × g、30 分、4 ° C での血液サンプルを遠心実験の後分析まで、-20 ° C でプレートの井戸を空にして保管して上清 (プラズマ) を転送します。<ol>
<li>存在する場合は、サンプルの溶血を記録 (セクション 3 を参照してください)。</li>
	</ol></li>
	<li>市販 elisa 法を用いた血漿インスリン キット (材料の表を参照) を決定するキットの製造元の指示に従います。 注: 空腹の状態に応じてだけでなく、調査のマウスの代謝には、この試金の時に困難が発生する: 夜間空腹時インスリン レベル (時点 0) が非常に低く、したがって検出限界の近くにあります。この問題を回避するには、推奨される血漿量の量を倍増し、ELISA アッセイの結果をそれに応じて半減します。一方でマウス HFD 与えられたマウスで特に OGTT、中にインスリンのピークに達すると場合、インスリン レベルは検出限界を超える可能性があります: サンプルを希釈 (例えば、10 倍 0.9 %nacl)、ELISA アッセイを繰り返します。血漿検体の溶血は、読み取り値の減少、インスリンの低下につながる可能性があります。劣化は、時間、温度、およびサンプルのヘモグロビン濃度に依存します。寒さやインスリンの低下を減らすために氷の上に、溶血サンプルを常に保ちます。</li>
</ol>3. ITT
注: OGTT (ワセリン使い glucometer、血マウスの取扱い) について同じ注意は ITT の実行時に適用するまたあります。たとえば、すべての注射行なう 15 分以内で 1 分間隔で並列で 15 匹のマウスをテストする場合。ITT、毛細管での採血の後に収集はオプションです。
<ol><li>実験前に、の準備<ol>
<li>マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら、インスリン注射の前に少なくとも 2 時間マウスを高速 (例えば、8:00 で食品を削除、マウスをテスト 2 5 h 後)。</li>
		<li>0.9% でインスリン縮尺を希薄 NaCl (株式: 100 U/mL インスリン; 作業濃度 0.1 U/mL) 20% ブドウ糖を準備 (d-(+)-グルコース溶液に溶解した蒸留水) マウスが低血糖になった場合に投与します。 注: 一晩で発生する可能性がありますそれ以外の場合、低血糖を避けるために短い高速動物を絶食後、ITT は、通常実行されます。動物に投与されるすべての試薬が薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスの体重を測定、尾をマーク、鋭いはさみを使用して尻尾先端をカットし、ステップ 2.4 で OGTT は前述のように基底の血ブドウ糖のレベルを測定します。</li>
	<li>インスリン注射<ol>
<li>腹腔内にインスリンを注入する (0.75 U インスリン/kg 体重、事前計算)、首筋法によるマウスを抑制します。</li>
		<li>滅菌の 27 か 30 ゲージの針の不快感と、注射部位の感染のリスクを避けるために各動物のため、新鮮なを使用します。 注: 皮膚の殺菌インスリン投与の期間を延ばすことができる、動物に付加的な妨害を起こすことができます。したがって、それはお勧めしません。</li>
		<li>動物の腹側を公開するわずかな角度でマウスの頭を傾けてください。動物の腹部 (図 3 b) の右下の象限に滅菌針と 30 ° の角度で傾斜面を配置します。最初のマウスは、注入後すぐに、タイマーを開始します。 注: 低用量 ITTs (0.1 U/kg) が具体的には肝のインスリン感受性を評価するために行われます。投与量を基づかせている間標準的な手順は、体重に基づいて注入量の計算、OGTT は体組成データが利用可能な場合は無駄のない体の質量が最寄り。</li>
	</ol>
</li>
	<li>選択した時点で (例えば15、30、45、60、90 分後) に血糖値を測定します。 注: インスリン マウス13〜 10 分の短い半時間があり、(例えば2 h 後) インスリン投与後半違い表さない場合がありますインスリン作用の直接影響。マウスは低血糖になる場合に 20% ブドウ糖溶液を管理 (血糖値 35 mg/dL 以下) と死亡のリスクは、します。</li>
	<li>最終的な時間のポイントの後、食料と水をたっぷり用意してホーム ケージに戻ってマウスを配置します。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

糖尿病および世界の人口に関連する疾患の有病率高がある分子メカニズム、予防、および19疾患の治療に対処研究強い要件。提案するプロトコルは、世代 HFD マウスの全身代謝変化の評価のための強力なツールは、OGTT と ITT、伝導と同様に代謝の研究に使用される堅牢な動物モデルの確立した方法をについて説明しますなどインスリン抵抗性。本稿で示される方法は、薬理学...

先進国の肥満や糖尿病は、物理的な不活動と加工食品の過剰な消費の急速な都市化、工業化、グローバル化によって駆動される効果による流行の寸法を達した。ただし、研究インスリン抵抗性およびそれの併存、高脂血症や動脈硬化、最後の十年の間に卓越性を得たが、健康および病気の代謝を調節する複雑な生物学的メカニズムのまま不完全理解、まだ防ぎ1これらの疾患を治療する新しい治療法のための緊急の必要性があります。
インスリン、およびそれの counter-regulatory ホルモンのグルカゴン細胞のエネルギー供給と栄養素のバランス、適切な全身血ブドウ糖濃度2をまた維持の主レギュレータとして役立ちます。インスリン分泌の主要な刺激の 1 つとして膵 β 細胞によるグルコース自体機能他栄養素、液性因子としてそれ以上の神経入力は、この応答を変更します。インスリンは、筋肉や脂肪細胞に余分な血中グルコースの拡散を促進し、解糖系と同様にタンパク質や脂肪酸合成をそれぞれさらに活性その結果供給状態の同化のプロセスをトリガーします。さらに、インスリンは、糖新生を抑制することによって肝糖放出を抑制します。慢性的な過剰なエネルギー消費やメタ炎症は障害の結果、下流のシグナル伝達経路の変化と同様に、インスリン受容体の発現のダウンレギュレーションにより末梢のインスリン抵抗性と高インスリン血につながる肝糖生産3,4,5,6の不十分な抑制と同様、インスリンを介したグルコース処理する感度。
病の遺伝、栄養、または実験的誘導と動物モデルの広い範囲は、その付随の病気7 と同様、糖尿病の様々 な形態およびインスリン抵抗性の分子機構を研究する優れたツールであると証明されています。.典型的な例は広く使われていると定評の HFD 誘発マウス モデルは、代謝効率が低下、インスリン抵抗8,の結果での組み合わせで食事摂取量増加による急速な体重増加によって特徴付けられる9しますよく使用するインスリン抵抗性の指標とグルコースの他の全身の変化は、グルコースの投与に対する障害耐性だけでなく、両方のモデル動物と人間、空腹時血中グルコースとインスリン濃度の上昇。代謝。したがって、基底状態で、または刺激に監視の血中グルコースとインスリン濃度、簡単にアクセス可能な読み出しです。
この議定書の概要 HFD 給電マウスとして経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン抵抗性試験 (ITT)、代謝の表現型を特徴付けるそして調査するために役立つ 2 つの頻繁に使用されるメソッドの生成糖代謝の変化。詳細は、時間の経過とともに経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の処分を評価で OGTT をについて説明します。さらに、インスリンのボーラスへの応答の血中グルコース濃度を監視することによって全身のインスリン作用を調査する ITT を実施する方法の指示を提供します。この資料で説明されているプロトコルは定評あり複数研究10、11,12で使用されています。成功を高めるを助けるかもしれないわずかな変更、に加えて、我々 は実験デザインとデータ解析と同様有用なヒント潜在的な落とし穴を避けるのためのガイドラインを提供します。ここ記載されているプロトコルは、全身糖代謝とインスリン抵抗性などの関連疾患、遺伝的、薬理学的、食物、および他の環境要因の影響を調査するための非常に強力なツールをすることができます。グルコースとインスリン刺激、他は、個々 の研究の目的によって刺激のためさまざまな他の化合物を使用すること。この原稿のスコープの範囲外が他の多くのダウン ストリーム アプリケーションの詳細なだけでなく、グルコースとインスリン (例えば、脂質およびリポタンパク質プロファイル) 以外の血液の値の分析など、描かれた血液サンプルで実行できます。代謝マーカー (例えば、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、西部のしみの分析、および酵素結合抗体法 (ELISA) による) の分析。さらにフローサイトメトリー、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームのアプローチについても、不特定多数に向けた分析のため利用されるかもしれない一方単一細胞集団の効果を調査する並べ替え蛍光活性化セル (FACS) を適用可能性があります。
全体的に、我々 は全身代謝の変化、分泌、ITT は、病気の発症を勉強するための便利なツールをすることができますを検討する 2 つの強力なアプローチをさらに説明しながら HFD 誘発マウス モデルを生成するための単純なプロトコルを提供し、インスリン抵抗性・糖尿病など代謝疾患の分野を中心に、新しい治療法を開発します。

<table><tbody><tr><td>Mouse strain: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>LFD/HFD</td></tr><tr><td>Accu Chek Performa - Glucometer</td><td>Roche</td><td>6870228</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Accu Chek Performa - Strips</td><td>Roche</td><td>6454038</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Actrapid - Insulin</td><td>Novo Nordisk</td><td>417642</td><td>ITT</td></tr><tr><td>Reusable Feeding Needles</td><td>Fine Science Tools</td><td>#18061-22</td><td>OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)</td></tr><tr><td>Omnifix-Fine dosing syringes</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Sterican Insulin needle (30G x 1/3&quot;; &amp;oslash; 0.30 x 13 mm)</td><td>Braun</td><td>304000</td><td>ITT; lean mice</td></tr><tr><td>Sterican (G 27 x 3/4&quot;; &amp;oslash; 0.40 x 20 mm)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td>ITT; mice on HFD</td></tr><tr><td>96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>SP0016</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Crystam Chem</td><td>90080</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Rodent Diet with 60% kcal% fat</td><td>Research Diets Inc</td><td>D12492</td><td>mice on HFD</td></tr><tr><td>Rodent Diet with 10% kcal% fat.</td><td>Research Diets Inc</td><td>D12450B</td><td>mice on LFD</td></tr><tr><td>BRAND micro haematocrit capillary</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR749321</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Vaseline - creme</td><td>Riviera</td><td>P1768677</td><td>OGTT/ITT</td></tr></tbody></table>

study of in vivo glucose metabolism in high-fat diet-fed mice using oral glucose tolerance test (ogtt) and insulin tolerance test (itt)

肥満は 2 型糖尿病、インスリン刺激によるグルコース吸収と全身糖代謝の総代償不全への抵抗によって特徴付けられる病気の発症に最も重要な危険因子を表します。グルコース代謝の理解にかなりの進歩にもかかわらず健康と病気その制御の分子機構に残る下調査間小説を防止し、糖尿病の治療への取り組みが急務します。派生のグルコース供給状態の間に細胞の同化プロセスの主レギュレータとして機能し、こうして血糖値のバランスをインスリンの膵臓の分泌を刺激するダイエットは、全身のエネルギー状態を維持するレベルします。慢性過食トリガー メタ-炎症、末梢インスリン受容体関連での変更につながるシグナルとインスリンを介したグルコース処理への感受性を削減します。これらのイベント最終的に結果減少と同様、高い絶食のブドウ糖とインスリン レベルの耐糖能のターンではインスリン抵抗性の重要な指標となります。ここでは、生成と高脂肪食 (HFD) の代謝特性のプロトコルを提案-食事療法誘導されたインシュリン抵抗性の頻繁に使用されるモデルとしてマウスを供給します。経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT)、監視時間をかけて経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の周辺機器の処分の詳細に示します。さらに、インスリン負荷試験 (ITT) 全身のインスリン作用を監視するためのプロトコルを提案する.一緒に、これらのメソッドとその下流の応用は、特に糖代謝の変化を評価するだけでなくマウスの一般的な代謝表現型を特徴付けるための強力なツールを表します。彼らはインスリン抵抗性、糖尿病および肥満治療介入の効果をテストとして同様の病態のより良い理解を提供する広範な研究分野で、特に便利。

図 1は、食事療法のマウスの代謝フェノタイピングのスケマティック タイム テーブルを示しています。約 6 週間の年齢で LFD グループは対照群として役立つかもしれない間、HFD のマウスを配置する必要があります。重要なは、体重は、体重増加が予想されるかを観察する毎週決定する必要があります。ストレス (例えば、ノイズまたは積?...

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経口ブドウ糖負荷試験 OGTT およびインスリン負荷試験 ITT を使用した、高脂肪食を与えたマウスにおける生体内ブドウ糖代謝の研究 |医学 |ビデオ

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

現在の記事では、生成および食事療法誘導されたインシュリン抵抗性および肥満のモデルとして高脂肪食飼育マウスの代謝特性について説明します。さらに、経口ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、グルコース代謝体内の全身の変化の監視を実行する詳細なプロトコルを備えています。

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

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Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

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67.5K ビュー.  Medical University of Vienna. 現在の記事では、生成および食事療法誘導されたインシュリン抵抗性および肥満のモデルとして高脂肪食飼育マウスの代謝特性について説明します。さらに、経口ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、グルコース代謝体内の全身の変化の監視を実行する詳細なプロトコルを備えています。

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Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

医学

Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical profiles, inclusive of blood glucose levels in both the fed and fasted state, HbA1c, insulin levels, clinical history of diet, body composition, and body weight status, an assessment of normal and abnormal glycemic control can be made. Interpretation of an IVGTT is done through measurement of changes in glucose and insulin levels over time in relation to the dextrose challenge. Critical components to be considered are: peak glucose and insulin levels reached in relation to T0 (end of glucose infusion), the glucose clearance rate K derived from the slope of rapid glucose clearance in the first 20 min (T1 to T20), the time to return to glucose baseline, and the area under the curve (AUC). These IVGTT measures will show characteristic changes as glucose homeostasis moves from a healthy to a diseased metabolic state5. Herein we will describe the characterization of nonhuman primates (Rhesus and Cynomolgus macaques), which are the most relevant animal model of Type II diabetes (T2D) in humans and the IVGTT and clinical profiles of these animals from a lean healthy, to obese dysmetabolic, and T2D state 8, 10, 11.

The goal of this protocol is to present a standard method to perform intravenous glucose tolerance tests (IVGTTs) to assess glycemic control in nonhuman primates and assess their metabolic status from healthy to dysmetabolic.

静脈内グルコース負荷試験とヒト以外の霊長類における代謝状態のキャラクタリゼーション

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

免疫・感染学

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

の最適化分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;脂肪肝

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that involves measurement of blood glucose levels over time following a single intraperitoneal injection of insulin. Given that it is performed in the conscious state and blood is often collected via a tail snip, it has the potential to elicit a stress response from animals due to anxiety associated with handling and blood collection. As such, a stress-induced rise in blood glucose can occur, making it difficult to detect and interpret the primary endpoint measure, namely an insulin-mediated reduction in blood glucose. This has been seen in many mouse strains, and is quite common in diabetic db/db mice, where glucose levels can increase, rather than decrease, after insulin administration. Here, we describe a method of acclimating mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test. We find that this lowers stress-induced hyperglycemia and results in data that more accurately reflects whole body insulin sensitivity.

Stress-induced elevations in glucose levels can confound interpretation of data derived from a conscious intraperitoneal insulin tolerance test in mice. In this article, we describe a method to acclimate the mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test in order to limit stress-induced hyperglycemia.

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

マウスにおけるイソカロリック2:1間欠的断食の代謝効果評価

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...

生物学

マウスにおける高血糖および低血糖クランプの外科的設置

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, and adipose tissues (Type2 DM). Insulin injection treats DM patients but leads to hypoglycemia as a side effect. Cortisol and catecholamines are released to activate glucose production from the liver to recover hypoglycemia, called counter-regulatory responses (CRR). In DM research using rodent models, glucose tolerance tests and 2-deoxy-glucose injection are used to measure insulin release and CRR, respectively. However, blood glucose concentrations change persistently during experiments, causing difficulties in assessing net insulin release and CRR. This article describes a method in which blood glucose is kept at 250 mg/dL or 50 mg/dL in conscious mice to compare the release of insulin and CRR hormones, respectively.
Polyethylene tubing is implanted in the mice's carotid artery and jugular vein, and the mice are allowed to recover from the surgery. The jugular vein tubing is connected to a Hamilton syringe with a syringe pump to enable insulin or glucose infusion at a constant and variable rate. The carotid artery tubing is for blood collection. For the hyperglycemic clamp, 30% glucose is infused into the vein, and blood glucose levels are measured from the arterial blood every 5 min or 10 min. The infusion rate of 30% glucose is increased until the blood glucose level becomes 250 mg/dL. Blood is collected to measure insulin concentrations. For hypoglycemic clamp, 10 mU/kg/min insulin is infused together with 30% glucose, whose infusion rate is variable to maintain 50 mg/dL of blood glucose level. Blood is collected to measure counter-regulatory hormones when both glucose infusion and blood glucose reach a steady state. Both hyperglycemic and hypoglycemic clamps have the same surgical procedure and experimental setups. Thus, this method is useful for researchers of systemic glucose metabolism.

著者スポットライト:費用対効果の高い高血糖および低血糖クランプ技術を使用したマウス脳の血糖恒常性の調査

A hyperglycemic clamp is used for measuring insulin release with a maintained higher blood glucose concentration. A hypoglycemic clamp is for measuring glucose production induced by counter-regulatory responses. Both methods use the same surgical procedure. Here, we present a clamp technique to assess systemic glucose metabolism.

意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, ...

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

要約

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意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

静脈内グルコース負荷試験とヒト以外の霊長類における代謝状態のキャラクタリゼーション

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

の最適化分析

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリンシグナルを勉強

身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

マウスにおけるイソカロリック2:1間欠的断食の代謝効果評価

意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

要約

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この動画の章

意識、無拘束マウスにおける高インスリン血症、正常血糖クランプ

静脈内グルコース負荷試験とヒト以外の霊長類における代謝状態のキャラクタリゼーション

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

の最適化分析

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

マウスにおけるイソカロリック2:1間欠的断食の代謝効果評価

意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリンシグナルを勉強