この手順の目的は、多嚢胞性卵巣症候群、またはPCOSマウスモデルにおける肝グルコース産生を決定することです。調節不変糖代謝はPCOSの重要な現れであり、その病因の鍵です。したがって、PCOSにおけるグルコース代謝の評価に関する研究が最も重要である。
本研究では、ガスクロマトグラフィー、質量分析法、GCMSを介して、6つの重水素、安定同位体グルコーストレーサーのMプラス2の濃縮を測定することにより、PCOSマウスモデルにおける肝グルコース産生速度の定量化に関するステップバイステップの説明を検討する。この手順は、安定な同位体グルコーストレーサー溶液の作成、尾静脈カテーテル配置の使用およびグルコーストレーサーの両方の空腹時およびグルコースが豊富な状態の両方での注入を伴う。処置の1日前に、安定同位体グルコーストレーサーを正常食節で調製する。
この実験では、グルコースが豊富な条件での空腹時のグルコース産生を測定し、グルコース同位体を2つの異なる調製物で調製した。トレーサーは、グルコースの有無にかかわらず滅菌および発熱無分解6個の重糖および無菌0.9%塩化ナトリウム溶液を溶解することによって無菌条件下で調製した。最初のインフューズートはトレーサーのみで用意した。
第2のインフュージング物は、非同位体グルコースと共にトレーサーの両方を含んでいた。溶液が調製されると、彼らは0.22ミクロンフィルターで無菌濾過し、摂氏4度で保存された。溶液は、最終的な注入用量がキログラムあたり1ミリグラムと1キログラムあたり2ミリグラムと分ごとにそれぞれ2ミリグラムに近いように調製されました.
グルコースが豊富な状態での基底状態におけるグルコースの出現率測定では、それぞれ1キログラムあたり1.08ミリグラム、分当たり1.9ミリグラムで6つの重水素のプライム平均一定速度注入が使用された。供給状態を模倣するために、我々はグルコースが豊富な状態の間に1キログラムあたり18.8ミリグラムおよび分の平均Dグルコース注入率を採用した。マウスを自宅のケージから取り出し、実験開始の3時間前に断食ケージに入れます。
今回の実験では、C57BL6J株から生後4ヶ月の雌マウスを用いた。マウスをインスリンポンプ当たりの一定数のマウスにグループ化して、ケージ装置を組み立てます。平らで安定したベースの上にパーティションを置き、マウスの個々の屋台を作ります。
ケージは透明でプレキシガラスで作られています。パーティションが座っているフラットで安定したベースがあります。ケージのドアは閉じるようにスライドし、尾が通り抜けられるように下部にノッチがあります。
1ミリリットルの基底インフューズートを含むシリンジを組み立て、ポリエチレンチューブを使用して注入ポンプチューブに接続します。1時間に150マイクロリットル(基底速度)に速度を設定して、注入ポンプを準備します。水浴を摂氏48度に熱します。
30ゲージの半インチの針、膠着管、および1インチの明確な輸送テープを含む水浴に隣接するカテーテル挿入ステーションを準備します。マウスを1本選択し、尾部にアクセスできるセキュアホルダーに置きます。尾の近位部分にテープを置き、カテーテル挿入のスペースをより遠位にします。
マウスを水浴に持ち込み、約30~45秒間水浴に尾を入れます。これは、カテーテルの配置のための尾の脈管を拡張するのに役立ちます。カテーテルの挿入は無菌条件下で行われなければならない。
尾が温まったら、尾をきれいにし、尾の近位端に止血帯として小さな銅歯のないワニクランプを置きます。虫眼鏡の下に横の尾の静脈を視覚化します。その後、慎重に尾静脈にカテーテルを挿入し、カテーテルのステイシーを確保するために溶液を穏やかに洗い流します。
挿入部位の周りに輸送テープの一部を包み込んでカテーテルを固定し、尾から小さな止血帯を取り除きます。マウスを個々のケージに入れ、引き戸を閉じて、尾がノッチを突き出してケージの外に残っていることを確認します。カテーテル全体と尾部にテープを追加して、ケージのベースプレートに固定します。
尾静脈カテーテルからフラッシュを外し、ポンプからインフューゼートラインを接続しながらバックフローを防ぐために、カテーテルの胞子管に小さなクランプを置きます。しっかりと接続したら、クランプを取り外し、インフューズートで構成されるプライミング溶液を洗い流します。溶液がチューブ内で明確であり、血液に染められていないことを確認します。
注入ラインが正常に機能していると指摘されたら、マウスからカバーを取り外します。マウスの周りに標準の寝具を置きます。トレーサーを含む注入液で注入を開始し、連続して3時間実行します。
注入の期間、マウスの幸福と注入ラインをチェックし続けます。注入管が適切に固定されていること、およびライン接続ポイントからの漏出がないことを確認します。最初の注入が完了した後、注入を停止し、バックフローを防ぐためにカテーテルのチューブにクランプを置きます。
血液を採取するためにカテーテルを邪魔することなく、マウスをエンクロージャからそっと取り除いた。この実験では、マウスは4ミリメートルランセットを使用して頬静脈穿刺を受けた。あなたの望むバイアルに約75マイクロリットルの血液を収集します。
質量分析の準備のためにサンプルを分解するには、約15マイクロリットルの血液をアセトン500マイクロリットルに加えます。残りの血液は、グルコメータおよび/または遠心分離機を介して血糖値をチェックし、将来のホルモンアッセイのために血漿を分離するために使用することができます。注射器からチューブを切り離して注射器ポンプからインフュージングを取り出し、グルコースと一緒にトレーサーを含む第2のインフューズートに交換します。
グルコースが豊富な同位体グルコース注入を使用して、以前の注入ステップを繰り返します。定常状態に達するには、2番目のインフューズートのボーラスを1時間に600マイクロリットルで15分間実行します。ケージの各グループの開始時刻に注意してください。
1時間に150マイクロリットルに注入速度を下げ、3時間の総注入時間を完了します。前述のように血液サンプリングを繰り返します。注入を切断し、出血が止まるまでカテーテル部位に圧力をかけ、マウスを自宅のケージに戻します。
次に、サンプルが GCMS 用に送信されます。五重酸塩誘導体を用いてGCCMSによりグルコースピーク下のグルコース同位体の同位体濃縮を計算する。簡単に言えば、この方法は、グルコースのペンタアセテート誘導体の調製を含み、続いてGCMSを用いたサンプル分析を陽性化学イオン化モードで行う。
質量電荷比の選択的イオンモニタリングは、171〜169、グルコース同位体のMプラス2の濃縮を決定するために行われる。すべての運動測定は定常状態を想定して行われる。確立された同位体希釈方程式を用いて、M+グルコース同位体と血漿の2つの濃縮から総血漿グルコース出現率を計算します。
定常状態下では、グルコースの出現率はグルコースの消失率と等しいと仮定される。内因性グルコース産生率は、全血漿グルコース率から外因性グルコースを引いた値に等しい。表1に、研究の代表的な結果を示す。
すべての単位はキログラム当たりミリグラムおよび分単位で表されます。先に説明した同位体希釈方程式を用いて、総血漿グルコース率を算出した。対照群において、平均グルコース出現率は断食状態で19.98であった。
グルコースが豊富な条件では、現れのグルコース速度は25.8であった。グルコース生産率は断食状態で19.08、グルコースが豊富な状態では8.56であった。異常なグルコース代謝と恒常性はPCOSで一般的です。
異常なグルコース代謝の障害では、高血糖をもたらすグルコース産生の抑制の調節が損なわれる。本研究では、複数マウスにおける肝グルコース産生率を同時に測定する簡単な方法を説明する。この実験の重要な要素は、GCMSを適切に実行するために、カテーテルの挿入とグルコース同位体と天然グルコースの正確な測定を定義することです。
この研究の利点は、尾静脈カテーテル挿入による最小限の侵襲的な方法で注入を達成することと、容易に達成可能で安定したグルコーストレーサーの使用である。手順の技術的要求や可能な追加スキルの必要性など、研究にいくつかの制限があります。全体として、PCOSマウスモデルにおける総肝グルコース産生率を測定する簡単で正確な方法を説明する。
この技術は、マウスモデルのグルコース代謝を含む複数の研究の基礎として役立つ可能性があります。
